Resumo
A infecção de suínos pelo vírus influenza causa perdas significativas na suinocultura e a doença tem implicações consideráveis para a saúde pública. Dessa forma, a rápida detecção viral em amostras biológicas de suínos é importante para a vigilância da influenza. Para o diagnóstico, as condições de manutenção das amostras biológicas (modo de acondicionamento, temperatura e período de acondicionamento), desde a colheita das amostras de suínos até o envio ao laboratório, podem interferir negativamente na detecção viral. Neste estudo foi analisada a viabilidade de uma amostra do vírus influenza A H1N1/2009 isolada de suínos, mantida em diferentes modos de acondicionamento (meio comercial UTM, meio in house VTM e sem meio de manutenção) e diferentes temperaturas (4, 23 e 37 °C) por um período de até 120 horas. As amostras foram avaliadas por RT-qPCR e isolamento em ovos embrionados. Foram observados efeitos significativos (p<0,05) para o modo e período de acondicionamento e da interação entre esses dois fatores com a carga viral. Dessa forma, as amostras biológicas enviadas para diagnóstico de influenza devem ser armazenadas, preferencialmente, em meio de manutenção viral a 4 °C e o tempo decorrido entre a colheita da amostra e a chegada ao laboratório deve ser de, no máximo, três dias.
Influenza virus infection in pigs causes significant losses for the swine industry and concerns for the public health. Therefore, rapid virus detection is important for influenza surveillance in pigs. Storage conditions (such as medium, temperature, and time) of the biological samples are very important for the diagnosis because they can negatively interfere with the viral detection. In this study, influenza virus viability was evaluated in different storage media (UTM commercial medium, "in house" VTM medium, and without storage medium), temperature (4, 23 and 37 °C), and storage time (up to 120 hours). Samples were evaluated by RT-qPCR and isolation in embryonated chicken eggs. Significant effects (p<0.05) were observed for the media and time besides the interaction between the two factors with the viral load. In conclusion, biological samples of pigs sent for influenza diagnosis should be stored, preferably in viral maintenance medium at 4 °C, and the time estimated between the sample collection until the arrival in the laboratory should be less than three days.
Assuntos
Viabilidade Microbiana , Vírus da Influenza A Subtipo H1N1/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da PolimeraseResumo
A infecção de suínos pelo vírus influenza causa perdas significativas na suinocultura e a doença tem implicações consideráveis para a saúde pública. Dessa forma, a rápida detecção viral em amostras biológicas de suínos é importante para a vigilância da influenza. Para o diagnóstico, as condições de manutenção das amostras biológicas (modo de acondicionamento, temperatura e período de acondicionamento), desde a colheita das amostras de suínos até o envio ao laboratório, podem interferir negativamente na detecção viral. Neste estudo foi analisada a viabilidade de uma amostra do vírus influenza A H1N1/2009 isolada de suínos, mantida em diferentes modos de acondicionamento (meio comercial UTM, meio in house VTM e sem meio de manutenção) e diferentes temperaturas (4, 23 e 37 °C) por um período de até 120 horas. As amostras foram avaliadas por RT-qPCR e isolamento em ovos embrionados. Foram observados efeitos significativos (p<0,05) para o modo e período de acondicionamento e da interação entre esses dois fatores com a carga viral. Dessa forma, as amostras biológicas enviadas para diagnóstico de influenza devem ser armazenadas, preferencialmente, em meio de manutenção viral a 4 °C e o tempo decorrido entre a colheita da amostra e a chegada ao laboratório deve ser de, no máximo, três dias.(AU)
Influenza virus infection in pigs causes significant losses for the swine industry and concerns for the public health. Therefore, rapid virus detection is important for influenza surveillance in pigs. Storage conditions (such as medium, temperature, and time) of the biological samples are very important for the diagnosis because they can negatively interfere with the viral detection. In this study, influenza virus viability was evaluated in different storage media (UTM commercial medium, "in house" VTM medium, and without storage medium), temperature (4, 23 and 37 °C), and storage time (up to 120 hours). Samples were evaluated by RT-qPCR and isolation in embryonated chicken eggs. Significant effects (p<0.05) were observed for the media and time besides the interaction between the two factors with the viral load. In conclusion, biological samples of pigs sent for influenza diagnosis should be stored, preferably in viral maintenance medium at 4 °C, and the time estimated between the sample collection until the arrival in the laboratory should be less than three days.(AU)
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Viabilidade Microbiana , Vírus da Influenza A Subtipo H1N1/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da PolimeraseResumo
Economic losses with high mortality rate associated with Porcine circovirus type 2 (PCV2) is reported worldwide. PCV2 commercial vaccine was introduced in 2006 in U.S. and in 2008 in Brazil. Although PCV2 vaccines have been widely used, cases of PCV2 systemic disease have been reported in the last years. Eleven nursery or fattening pigs suffering from PCV2 systemic disease were selected from eight PCV2-vaccinated farms with historical records of PCV2 systemic disease in Southern Brazil. PCV2 genomes were amplified and sequenced from lymph node samples of selected pigs. The comparison among the ORF2 amino acid sequences of PCV2 isolates revealed three amino acid substitutions in the positions F57I, N178S and A190T, respectively. Using molecular modeling, a structural model for the capsid protein of PCV2 was built. Afterwards, the mutated residues positions were identified in the model. The structural analysis of the mutated residues showed that the external residue 190 is close to an important predicted region for antibodies recognition. Therefore, changes in the viral protein conformation might lead to an inefficient antibody binding and this could be a relevant mechanism underlying the recent vaccine failures observed in swine farms in Brazil.(AU)
Assuntos
Animais , Circovirus/ultraestrutura , Capsídeo/ultraestrutura , Suínos/virologia , Epitopos , Vacinas ViraisResumo
Abstract Economic losses with high mortality rate associated with Porcine circovirus type 2 (PCV2) is reported worldwide. PCV2 commercial vaccine was introduced in 2006 in U.S. and in 2008 in Brazil. Although PCV2 vaccines have been widely used, cases of PCV2 systemic disease have been reported in the last years. Eleven nursery or fattening pigs suffering from PCV2 systemic disease were selected from eight PCV2-vaccinated farms with historical records of PCV2 systemic disease in Southern Brazil. PCV2 genomes were amplified and sequenced from lymph node samples of selected pigs. The comparison among the ORF2 amino acid sequences of PCV2 isolates revealed three amino acid substitutions in the positions F57I, N178S and A190T, respectively. Using molecular modeling, a structural model for the capsid protein of PCV2 was built. Afterwards, the mutated residues positions were identified in the model. The structural analysis of the mutated residues showed that the external residue 190 is close to an important predicted region for antibodies recognition. Therefore, changes in the viral protein conformation might lead to an inefficient antibody binding and this could be a relevant mechanism underlying the recent vaccine failures observed in swine farms in Brazil.
Resumo
Este trabalho descreve a colheita adequada de amostras, as técnicas/procedimentos disponíveis para o diagnóstico de influenza A em suínos, assim como os resultados e suas respectivas interpretações, para auxiliar médicos veterinários de campo na identificação dessa doença. Em suínos vivos, as amostras adequadas são: secreção nasal, fluido oral e sangue (soro). Para suínos mortos, colher preferencialmente amostras de pulmão com consolidação cranioventral. Secreção nasal e fragmentos de pulmão refrigerado são utilizados para detectar partícula viral viável (isolamento viral - IV) ou ácido nucleico viral (RT-PCR convencional e RT-PCR em tempo real). As amostras não devem ser congeladas, pois o vírus é inativado a -20°C. A caracterização molecular dos isolados é feita pela análise filogenética obtida pelo sequenciamento de DNA. O soro é utilizado para a detecção de anticorpos (Acs) por meio do teste da inibição da hemaglutinação e ELISA. O fluido oral pode ser utilizado para detecção de anticorpo (ELISA) ou de vírus. Fragmentos de pulmão fixados em formol a 10% são examinados microscopicamente para identificar pneumonia broncointersticial e para detecção de antígeno viral pela imuno-histoquímica (IHQ). Para o sucesso do diagnóstico, as amostras devem ser colhidas de suínos que estão preferencialmente na fase aguda da doença, para aumentar as chances de detecção viral. As melhores opções para o diagnóstico de influenza A em suínos vivos são RT-PCR e isolamento viral de amostras de swab nasal ou fluido oral. Pulmão para análise por RT-PCR, isolamento viral ou IHQ é a amostra de escolha em suínos mortos. Testes sorológicos têm valor diagnóstico limitado e são utilizados apenas para determinar o estado imune do rebanho, não indicando doença clínica, pois os Acs são detectados 7-10 dias pós-infecção (fase subaguda). O diagnóstico de influenza é importante para avaliar o envolvimento desse agente no complexo de doença respiratória suína. Além disso, o isolamento do vírus influenza é essencial para o monitoramento dos principais subtipos circulantes em uma determinada região ou país, assim como para a detecção de novos rearranjos virais, já que influenza é considerada uma zoonose.(AU)
This article is intended to describe the adequate sample collection, the laboratory procedures/techniques, the expected results and their interpretation for diagnosis of influenza infection in swine, serving as a support for field veterinarians. In live pigs, the samples to be taken are nasal secretions, oral fluids and blood. For dead pigs, preference should be given to samples of cranioventral lung consolidation. Nasal discharge and chilled lung fragments are used for detection of virus (virus isolation - VI) or viral nucleic acids (conventional RT-PCR and real-time RT-PCR). Samples should not be frozen, because the virus is inactivated at -20°C. Molecular characterization of isolates is performed by phylogenetic analysis of gene sequences obtained by DNA sequencing. Serum is used for the detection of antibodies using hemagglutination inhibition (HI) test and ELISA. Oral fluid may be used for either antibody (ELISA) or viral detection. Fragments of lung fixed in 10% formaldehyde are used for histopathological analysis to identify bronchointerstitial pneumonia, and for immunohistochemistry (IHC) for antigens. For a successful diagnosis, sampling should be preferably performed in the acute phase of the disease to improve chances of virus detection. The best options to perform the diagnosis of influenza A in a swine herd are RT-PCR and VI from nasal swabs or oral fluid in live pigs and/or lung tissue for RT-PCR, VI or IHC in dead pigs. Serological tests are of very limited diagnostic value and are useful only to determine the immune status of the herd, not indicating clinical disease, because antibodies are detected after 7-10 days post infection (subacute phase). The diagnosis of influenza is important to evaluate the involvement of this agent in the complex of respiratory diseases in pigs. Furthermore, the isolation of influenza virus is essential for monitoring the main subtypes circulating in a given region or country, as well as for the detection of potential new viral reassortants, because influenza is considered a zoonosis.(AU)
Assuntos
Animais , Alphainfluenzavirus/isolamento & purificação , Manejo de Espécimes , Suínos/virologia , Técnicas e Procedimentos Diagnósticos/veterinária , Saliva , Reação em Cadeia da PolimeraseResumo
Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.
A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.
Assuntos
Animais , Suínos/virologia , Vírus da Influenza A Subtipo H1N1/isolamento & purificação , Surtos de Doenças/veterinária , Infecções , Pulmão/virologiaResumo
Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.(AU)
A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.(AU)
Assuntos
Animais , Suínos/virologia , Vírus da Influenza A Subtipo H1N1/isolamento & purificação , Infecções , Surtos de Doenças/veterinária , Pulmão/virologiaResumo
Aujeszky' s disease (AD) is an infectious disease causing important economic losses to the swine industry worldwide. The disease is caused by an alpha-herpesvirus, Aujeszky' s disease virus (ADV), an enveloped virus with a double stranded linear DNA genome. The ADV genome encodes 11 glycoproteins, which are major targets for the immune system of the host in response to the infection. The glycoprotein E (gE) is a non-essential protein and deletion of the gE gene has been used for the production of marker vaccines. Aiming to develop molecular reagents for the production of a gE specific ELISA test, the gE gene was amplified by PCR, cloned and expressed into a baculovirus expression system. The recombinant DNA vector pFastBac-gE-ADV was used for site-specific transposition into the recombinant baculovirus (bacmid). Colonies with recombinant bacmid-pFastBac-gE-ADV were selected by antibiotic and color selection and the presence of the gE gene was confirmed by PCR. The recombinant bacmid-pFastBac-gE-ADV was cotransfected in insect Trichoplusia ni and the presence of the recombinant DNA and gE protein were detected by PCR, SDS-PAGE and Western blotting, respectively.
A doença de Aujeszky (DA) é uma enfermidade infecto-contagiosa que causa grandes perdas econômicas ao produtor e à agroindústria suinícola em todo o mundo. É causada pelo vírus da doença de Aujeszky (VDA), um alfaherpesvírus envelopado com genoma DNA de fita dupla e linear. O genoma do VDA codifica 11 glicoproteínas, as quais são os maiores alvos do sistema imune do hospedeiro em resposta a infecção. A glicoproteína E (gE) é uma proteína não essencial e a deleção do gene da gE é muito utilizada para a produção de vacinas com marcadores. Com o objetivo de desenvolver insumos moleculares para a produção de um teste de ELISA específico para gE do VDA, a seqüência do gene da gE foi amplificada, clonada e expressa no sistema de expressão em baculovírus. O produto da amplificação foi clonado no vetor pGem®-T Easy e subclonado no plasmídeo de expressão pFastBac1. O DNA recombinante pFastBac-gE-VDA foi usado para a transposição sítio-específica no baculovírus recombinante (bacmid). Após seleção por antibióticos e cor, as colônias com o recombinante bacmid-pFastBac-gE-VDA foram selecionadas e a presença do gene da gE foi confirmada por PCR. O DNA recombinante viral, bacmid-pFastBac-gE-VDA, foi usado para cotransfecção de células de inseto Trichoplusia ni e a presença do recombinante e a proteína gE foi determinada por PCR, por SDS-PAGE e Western blotting, respectivamente.
Resumo
Aujeszky's disease virus (ADV) belongs to Herpesviridae family and is an important etiological agent which infects pigs causing economic losses in swine producing countries worldwide and international trade restrictions to products of swine origin. An eradication program for ADV was established in Santa Catarina State since 2001. The last outbreak was reported in July 2004 and since then none has been reported. The disease has been controlled with the use of a genetic modified vaccine and elimination of seropositives. Aiming the characterization of ADV isolated in the South of Brazil in the last twenty years (1983-2003), a retrospective study based on the genomic analysis of the isolates through a digestion of viral genomic DNA with restriction enzyme Bam HI was done. Thirty-seven ADV samples isolated from swine from the States of Santa Catarina, Parana and Rio Grande do Sul were analyzed. These isolates were compared to the reference strains NIA-4, Bartha and Begonia. The most predominant genomic arrangement was type II found in 33 samples isolated in Santa Catarina State and in one isolate from Rio Grande do Sul State. Genomic arrangement type I, characteristic of vaccine strains was identified in 2 isolates from Parana State and in 1 isolate from Rio Grande do Sul State.
O vírus da doença de Aujeszky (VDA) pertencente à família Herpesviridae é um importante agente etiológico que infecta suínos causando perdas na produção de suínos no mundo inteiro e restrições para o comércio internacional de suínos ou de seus subprodutos. No estado de Santa Catarina, Brasil, foi instituído em 2001 um programa de erradicação da doença de Aujeszky (DA). O último surto da DA foi reportado em julho de 2004 e desde então não foram notificados mais casos. A doença tem sido controlada com o uso de uma vacina geneticamente modificada e eliminação de animais soropositivos para o VDA. Visando caracterizar amostras do VDA isoladas nos últimos vinte anos (1983-2003) na região Sul do Brasil, foi realizado um estudo retrospectivo baseado na análise do genoma dos vírus isolados de acordo com os perfís de restrição apresentados após a digestão do DNA genômico viral com a enzima Bam HI. Foram analisadas trinta e sete amostras isoladas de suínos oriundos dos estados de Santa Catarina, Paraná e Rio Grande do Sul. Os isolados foram comparados com as amostras de referência NIA-4, Bartha e Begônia. O arranjo genômico predominante, encontrado em 33 amostras isoladas em Santa Catarina e em uma isolada no Rio Grande do Sul, foi o do tipo II. O arranjo genômico do tipo I, característico de amostras de vírus vacinal foi identificado em duas amostras isoladas no Paraná e em uma amostra isolada no Rio Grande do Sul.
Resumo
O diagnóstico laboratorial da raiva utiliza uma metodologia padronizada, baseada essencialmente no método de imunofluorescência direta, ou direct fluorescent antibody test (DFAT). No presente estudo foram reavaliadas algumas variáveis do DFAT, incluindo a duração do tempo de fixação das lâminas com impressões de tecido nervoso, duração das incubações de pré-adsorção do conjugado com as suspensões de tecido nervoso de camundongos infectados (IMB) ou não infectados (NMB) e a duração do período de incubação destas misturas sobre as lâminas com as impressões fixadas. A combinação que proporcionou maior eficácia à DFAT foi obtida com a fixação das lâminas com impressões de tecido nervoso em acetona a -20 oC por 30 minutos, pré-adsorção do conjugado com suspensões de NMB e IMB por 60 minutos a 37oC e subseqüente incubação dessas misturas sobre as impressões por 2 horas a 37oC. Estas alterações permitiram a obtenção de uma fluorescência de intensidade sensivelmente maior que a obtida com a metodologia padrão recomendada, aliada a uma completa inibição da fluorescência sobre os controles.
Resumo
O diagnóstico laboratorial da raiva utiliza uma metodologia padronizada, baseada essencialmente no método de imunofluorescência direta, ou direct fluorescent antibody test (DFAT). No presente estudo foram reavaliadas algumas variáveis do DFAT, incluindo a duração do tempo de fixação das lâminas com impressões de tecido nervoso, duração das incubações de pré-adsorção do conjugado com as suspensões de tecido nervoso de camundongos infectados (IMB) ou não infectados (NMB) e a duração do período de incubação destas misturas sobre as lâminas com as impressões fixadas. A combinação que proporcionou maior eficácia à DFAT foi obtida com a fixação das lâminas com impressões de tecido nervoso em acetona a -20 oC por 30 minutos, pré-adsorção do conjugado com suspensões de NMB e IMB por 60 minutos a 37oC e subseqüente incubação dessas misturas sobre as impressões por 2 horas a 37oC. Estas alterações permitiram a obtenção de uma fluorescência de intensidade sensivelmente maior que a obtida com a metodologia padrão recomendada, aliada a uma completa inibição da fluorescência sobre os controles.
Resumo
O diagnóstico laboratorial da raiva utiliza uma metodologia padronizada, baseada essencialmente no método de imunofluorescência direta, ou direct fluorescent antibody test (DFAT). No presente estudo foram reavaliadas algumas variáveis do DFAT, incluindo a duração do tempo de fixação das lâminas com impressões de tecido nervoso, duração das incubações de pré-adsorção do conjugado com as suspensões de tecido nervoso de camundongos infectados (IMB) ou não infectados (NMB) e a duração do período de incubação destas misturas sobre as lâminas com as impressões fixadas. A combinação que proporcionou maior eficácia à DFAT foi obtida com a fixação das lâminas com impressões de tecido nervoso em acetona a -20 oC por 30 minutos, pré-adsorção do conjugado com suspensões de NMB e IMB por 60 minutos a 37oC e subseqüente incubação dessas misturas sobre as impressões por 2 horas a 37oC. Estas alterações permitiram a obtenção de uma fluorescência de intensidade sensivelmente maior que a obtida com a metodologia padrão recomendada, aliada a uma completa inibição da fluorescência sobre os controles.
Resumo
The brain of an one year old male calf which died with signs of neurological disease was submitted to the laboratory for rabies diagnosis. Microscopical findings included moderate mielitis, mild meningoencephalitis with perivascular cell cuffing and Negri inclusion bodies in Purkinje cells of the cerebellum. Rabies virus infection was further confirmed by the direct fluorescent antibody test as well as by mouse inoculation. In addition, a herpesvirus was isolated from brain tissues. The isolate was antigenic and genetically characterized as bovine herpesvirus type 5 (BHV-5). It was not possible to determine whether BHV-5 played an active role in the outcome of the infection, since, the virus might have been present in a latent form in neural tissues. This is the first report of a mixed rabies/ BHV-5 infection in calves (AU)
Assuntos
Animais , Herpesvirus Bovino 5 , Bovinos , RaivaResumo
O vírus da Raiva foi considerado durante muito tempo como sendo muito estável antigenicamente. Entretanto, nos últimos anos, diversos trabalhos de caracterização de isolados do vírus da Raiva, realizados em várias partes do mundo, demonstraram diferenças entre as amostras de vírus isoladas de diferentes espécies animais. Estas diferenças ocorrem principalmente entre amostras do vírus isoladas de hospedeiros terrestres e aéreos (morcegos). Este trabalho teve como objetivos o estudo de características antigênicas e genômicas de amostras brasileiras do vírus da Raiva e o desenvolvimento de uma vacina contra a Raiva, produzida a partir de um vetor viral. Setenta e oito amostras de vírus rábico, obtidas de diferentes espécies e oriundas de vários estados brasileiros foram submetidas a um perfil de reatividade com um painel de anticorpos monoclonais (Mabs) dirigidos contra antígenos dos Lyssavirus. Posteriormente, essas amostras foram submetidas a análise genômica, envolvendo a análise de restrição genômica (REA) da seqüência inteira do gene que codifica a nucleoproteína viral (N; 1,5 kb) amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR). A combinação da caracterização antigênica e REAs permitiu a diferenciação das amostras de acordo com a espécie de origem, independente da distribuição geográfica. O seqüenciamento de 225 nucleotídeos do gene N (nucleotídeos 140-364), de sete amostras do vírus, consideradas representativas das amostras analisadas, confirmou as diferenças identificadas através da análise antigênica e REA. O seqüenciamento também permitiu um refinamento na caracterização de amostras isoladas de morcegos, revelando diferenças entre amostras isoladas de espécies hematófagas e não hematófagas, sugerindo que as amostras virais de morcegos não hematófagos vem apresentando evolução adaptativa distinta das amostras de morcegos hematófagos. A segunda parte deste estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um antígeno com potencial para o desenvolvimento de uma vacina bivalente contra a Raiva e contra o Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BHV-1). Para isto, foi construído um vírus recombinante utilizando como vetor uma amostra autóctone de BHV-1, onde foi inserido, no locus do gene que codifica a glicoproteína E (gE) viral, o gene que codifica a glicoproteína (G) do vírus rábico. A estratégia escolhida para a construção do recombinante incluiu a remoção de potenciais sítios de splicing do gene G, com o objetivo de propiciar a transcrição e tradução adequada do mesmo nas células infectadas pelo recombinante. A expressão da proteína G do vírus da Raiva foi detectada em células eucarióticas transfectadas com DNA plasmideal contendo o gene G do vírus da Raiva e também após a co-transfecção, em células EBTr, do DNA do BHV-1 wild-type e do fragmento de recombinação contendo o gene G do vírus da Raiva. O vírus recombinante (BHV-gE-/ Raiva G) produzido está sendo isolado para posteriormente ser caracterizado e avaliado experimentalmente