Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.

Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.(AU)

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.(AU)

Cultivo in vitro de folículos pré-antrais: principais substâncias reguladoras, vias de sinalização e avanços nas espécies murina, bovina, ovina e caprina / In vitro culture of preantral follicles: main regulatory factors, signaling pathways and advances in murine, bovine, ovine and caprine

A regulação da foliculogênese é um processo complexo regulado por vários fatores intra e extraovarianos. A resposta das células ovarianas ao estímulo produzido por esses fatores depende da transdução de sinais no interior das células através de várias vias de sinalização. A interação entre as diversas vias de sinalização celular e a descoberta constante de novas vias demonstram a complexidade desse processo. A presente revisão se propõe a descrever os principais fatores reguladores da foliculogênese, seus receptores e as vias de sinalização celular destacando pontos de interação entre elas. Em adição, uma análise crítica dos principais resultados obtidos com o cultivo in vitro de folículos ovarianos murinos, bovinos, caprinos e ovinos levando-se em consideração as substâncias presentes nos meios de cultivo utilizados e as prováveis vias de sinalização celular empregadas é apresentada na presente revisão.

Folliculogenesis is regulated by a complex process, which involves several intra- and extraovarian factors. The response of the ovarian cells to those factors depends on the signal transduction inside the cells through several signaling pathways. The interaction of different signaling pathways and discovery of new pathways demonstrate the complexity of folliculogenesis. Therefore, this review will highlight the main regulatory factors that control folliculogenesis, their receptors and sharing signaling pathways. Moreover, a critical analysis about the main results from in vitro follicle culture studies in murine, bovine, caprine, and ovine, focusing on the medium supplements and the interactions of their signaling pathways will be presented.

Cultivo in vitro de folículos pré-antrais: principais substâncias reguladoras, vias de sinalização e avanços nas espécies murina, bovina, ovina e caprina / In vitro culture of preantral follicles: main regulatory factors, signaling pathways and advances in murine, bovine, ovine and caprine

A regulação da foliculogênese é um processo complexo regulado por vários fatores intra e extraovarianos. A resposta das células ovarianas ao estímulo produzido por esses fatores depende da transdução de sinais no interior das células através de várias vias de sinalização. A interação entre as diversas vias de sinalização celular e a descoberta constante de novas vias demonstram a complexidade desse processo. A presente revisão se propõe a descrever os principais fatores reguladores da foliculogênese, seus receptores e as vias de sinalização celular destacando pontos de interação entre elas. Em adição, uma análise crítica dos principais resultados obtidos com o cultivo in vitro de folículos ovarianos murinos, bovinos, caprinos e ovinos levando-se em consideração as substâncias presentes nos meios de cultivo utilizados e as prováveis vias de sinalização celular empregadas é apresentada na presente revisão.(AU)

Folliculogenesis is regulated by a complex process, which involves several intra- and extraovarian factors. The response of the ovarian cells to those factors depends on the signal transduction inside the cells through several signaling pathways. The interaction of different signaling pathways and discovery of new pathways demonstrate the complexity of folliculogenesis. Therefore, this review will highlight the main regulatory factors that control folliculogenesis, their receptors and sharing signaling pathways. Moreover, a critical analysis about the main results from in vitro follicle culture studies in murine, bovine, caprine, and ovine, focusing on the medium supplements and the interactions of their signaling pathways will be presented. (AU)

Avanços no crescimento, maturação e fecundação in vitro de oócitos caninos / Advances on in vitro growth, maturation and ecundation of canine oocyte

A produção in vitro de embriões em cães pode auxiliar na compreensão de inúmeros fenômenos fisiológicos como o crescimento, a maturação e a fecundação de oócitos e ainda se apresenta como alternativa para contornar obstáculos reprodutivos inerentes à espécie. Além disso, os conhecimentos adquiridos com esta técnica podem ser utilizados para a preservação de cães selvagens ameaçados de extinção. Entretanto a existência de diferenças na fisiologia reprodutiva canina quando comparado aos demais mamíferos domésticos, resulta em uma dificuldade em maiores avanços na produção in vitro de embriões nessa espécie. Nesse sentido inúmeros estudos vêm sendo realizados para desenvolver biotécnicas que venham a auxiliar na compreensão da fisiologia reprodutiva canina, bem como tentar solucionar o entrave da produção in vitro de embriões. Dessa forma, esta revisão tem como objetivo, relatar os avanços obtidos até o momento no crescimento e maturação in vitro de oócitos de cães domésticos, assim como discorrer sobre as estratégias utilizadas até o presente momento para aumentar a produção in vitro de embriões caninos, utilizando-se oócitos oriundos tanto de folículos pré-antrais como de folículos antrais.

The in vitro embryo production in dogs can help the understanding of several physiological processes such as growth, maturation and fertilization of oocytes, and also represents an alternative to overcome reproductive obstacles in this species. Moreover, the knowledge obtained from this technique can be used for the preservation of endangered wild dogs However, the existence of differences between dogs and other domestic species regarding the reproductive physiology in these species difficult major advances in the in vitro embryo production in dogs. In this regard, many studies were conducted to developing biotechniques which will help to understand the canine reproductive physiology, as well as to try to solve the obstacle on in vitro production of embryon. Thus, this review aims to address the progress obtained so far in the in vitro growth and maturation of oocytes from domestic dogs, as to address the strategies used until the present moment to improve the in vitro production of canine embryo, using oocyte from both preantral and antral follicles.

Avanços no crescimento, maturação e fecundação in vitro de oócitos caninos / Advances on in vitro growth, maturation and ecundation of canine oocyte

A produção in vitro de embriões em cães pode auxiliar na compreensão de inúmeros fenômenos fisiológicos como o crescimento, a maturação e a fecundação de oócitos e ainda se apresenta como alternativa para contornar obstáculos reprodutivos inerentes à espécie. Além disso, os conhecimentos adquiridos com esta técnica podem ser utilizados para a preservação de cães selvagens ameaçados de extinção. Entretanto a existência de diferenças na fisiologia reprodutiva canina quando comparado aos demais mamíferos domésticos, resulta em uma dificuldade em maiores avanços na produção in vitro de embriões nessa espécie. Nesse sentido inúmeros estudos vêm sendo realizados para desenvolver biotécnicas que venham a auxiliar na compreensão da fisiologia reprodutiva canina, bem como tentar solucionar o entrave da produção in vitro de embriões. Dessa forma, esta revisão tem como objetivo, relatar os avanços obtidos até o momento no crescimento e maturação in vitro de oócitos de cães domésticos, assim como discorrer sobre as estratégias utilizadas até o presente momento para aumentar a produção in vitro de embriões caninos, utilizando-se oócitos oriundos tanto de folículos pré-antrais como de folículos antrais.(AU)

The in vitro embryo production in dogs can help the understanding of several physiological processes such as growth, maturation and fertilization of oocytes, and also represents an alternative to overcome reproductive obstacles in this species. Moreover, the knowledge obtained from this technique can be used for the preservation of endangered wild dogs However, the existence of differences between dogs and other domestic species regarding the reproductive physiology in these species difficult major advances in the in vitro embryo production in dogs. In this regard, many studies were conducted to developing biotechniques which will help to understand the canine reproductive physiology, as well as to try to solve the obstacle on in vitro production of embryon. Thus, this review aims to address the progress obtained so far in the in vitro growth and maturation of oocytes from domestic dogs, as to address the strategies used until the present moment to improve the in vitro production of canine embryo, using oocyte from both preantral and antral follicles.(AU)

Effect of bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) on in vitro survival of caprine preantral follicles / Efeito da proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) para a sobrevivência in vitro de folículos pré-antrais caprinos

This study was conducted in order to verify the effect of different concentrations of BMP-7 in the in vitro survival and development of caprine preantral follicles. Fragments of caprine ovarian cortical tissue were cultured for 1 or 7 days in Minimum Essential Medium (MEM+) supplemented with different concentrations of BMP-7 (1, 10, 50 or 100ng/ml). Non-cultured fragments or those cultured for 1 or 7 days were processed for classical histology and transmission electron microscopy (TEM). Parameters such as follicular survival, activation and growth were evaluated. The results showed that, after 1 or 7 days of culture, the percentage of morphologically normal follicles was significantly reduced in all treatments when compared with fresh control, except at 1ng/ml of BMP-7 for 1 day. In addition, the concentration of 10ng/ml of BMP-7 significantly increases follicular diameter from day 1 to 7 of culture. There was no influence of the other concentrations of BMP-7 regarding to the follicular and oocyte diameter. Ultrastructure studies confirmed follicular integrity after 7 days of culture in 1ng/ml BMP-7. In conclusion, small concentrations of BMP-7 can improve the survival and growth of caprine preantral follicles during in vitro culture.(AU)

O presente trabalho foi conduzido de modo a se verificar o efeito de diferentes concentrações da BMP-7 no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. Fragmentos de tecido cortical ovariano caprino foram cultivados por 1 ou 7 dias em Minimum Essential Medium (MEM+) suplementado com diferentes concentrações de BMP-7 (1, 10, 50 ou 100ng/ml). Os fragmentos não cultivados ou aqueles cultivados por 1 ou 7 dias foram processados para histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), sendo avaliados parâmetros morfológicos indicativos de viabilidade, ativação e crescimento. Os resultados mostraram que o percentual de folículos morfologicamente normais diminuiu significativamente em todos os tratamentos quando comparados ao controle, exceto na concentração de 1ng/ml por 1 dia de cultivo. Já no D7 todos os tratamentos reduziram significativamente os percentuais de folículos morfologicamente normais. Utilizando 10ng/ml de BMP-7 foi observado um aumento significativo no diâmetro folicular quando comparados os diferentes períodos de cultivo. Não houve influência das demais concentrações de BMP-7 quando avaliados além do diâmetro folicular o diâmetro oocitário. A análise por TEM confirmou a integridade ultra-estrutural nos folículos após 7 dias de cultivo com 1ng/ml de BMP-7 . Em conclusão, o BMP-7 em baixas concentrações pode melhorar a sobrevivência e o crescimento durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos.(AU)