Effect of bactofugation of raw milk on total bacterial and aerobic spore counts and on microbial diversity of sporeformers / Efeito da bactofugação do leite cru nas contagens bacteriana total, esporos aeróbios e na diversidade microbiana de formadores de esporos

This study describes the effect of bactofugation (10,000 × g in a continuous flow of 10,000 L/h) of three batches of raw milk on total bacterial count (TBC) and aerobic spore count, and it also shows the effect on the microbial diversity of spore-forming bacteria by analysing their genetic variability through molecular approaches. Given that milk must be preheated to approximately 55 °C before being bactofuged, for comparison, the three batches were evaluated at different stages as refrigerated raw, preheated, and bactofuged milk. For preheated milk, it was found that bactofugation caused a significant reduction (p < 0.05) of 99.52% (from 4.5 × 106 to 2.1 × 104 CFU/mL) in the mean TBC and of 95% (from 333 to 17 CFU/mL) in the aerobic mesophilic spore count. Due to the effect of bactofugation on preheated milk, a reduction of 82% was observed in both TBC and aerobic spore count. With respect to diversity, 107 isolates from raw milk, prior to bactofugation, and 16 isolates from bactofuged milk were recovered and grouped into 40 and 8 clusters, respectively. The predominant species detected in raw and preheated milk were Bacillus toyonensis (63% - 20 clusters) and Lysinibacillus fusiformis (15% - 8 clusters). Proportionally, B. toyonensis (69% - 6 clusters) and L. fusiformis (25% - 1 cluster) were predominant in bactofuged milk. B. pumilus, L. varians, B. flexus, B. invictae, and B. megaterium, bacteria with a known milk spoilage potential, were isolated from milk prior to bactofugation, and they reduced to undetectable levels in bactofuged milk. Bactofugation of milk, therefore, reduces the TBC and aerobic spore count, with a significant effect in reducing the microbial diversity of spore-forming bacteria, proportional to their incidence in raw milk. Therefore, bactofugation can be an alternative to increase the shelf life and technological potential of milk.(AU)

Esse estudo descreve o efeito da bactofugação (10,000 × g em fluxo contínuo de 10,000 L/h) de três lotes de leite cru nas contagens bacterianas totais (CBT) e de esporos aeróbios, verificando também o efeito sobre a diversidade microbiana dos formadores de esporos por abordagem molecular de variabilidade genética. Como o leite a ser bactofugado deve ser pré-aquecido (≈55ºC), os três lotes foram avaliados enquanto cru refrigerado, pré-aquecido e bactofugado. Em associação com o pré-aquecimento, foi verificado que a bactofugação promoveu a redução significativa (p < 0.05) de 99,52% (4,5 x 106 para 2,1 x 104 UFC/mL) na contagem bacteriana total e 95% (333 para 17 UFC/mL) dos esporos aeróbios mesófilos. Considerando o efeito isolado da bactofugação sobre o leite já pré-aquecido, foi observada a redução de 82% tanto para CBT quanto para formadores de esporos. Em relação à diversidade, foram recuperados 107 isolados do leite anterior à bactofugação e 16 isolados do leite bactofugado, agrupados em 40 e 8 clusters, respectivamente. Foi observado predomínio das espécies Bacillus toyonensis (63% - 20 clusters) e Lysinibacillus fusiformis (15% - 8 clusters) no leite cru e pré-aquecido e, proporcionalmente, B. toyonensis (69% - 6 clusters) e L. fusiformis (25% - 1 cluster) no leite bactofugado. Bacillus pumilus, Lysinibacillus varians, B. flexus, B. invictae, e B. megaterium, isolados do leite antes da bactofugação e com potencial deteriorante conhecido, foram reduzidos a níveis indetectáveis no leite bactofugado. A bactofugação do leite, portanto, reduz a CBT e as contagens de esporos aeróbios, também com efeito significativo na redução da diversidade de formadores de esporos, proporcionalmente, conforme a sua incidência no leite cru, tendo potencial para ser utilizado como alternativa para aumento da vida útil e potencial tecnológico do leite.(AU)

Artificial intelligence applied to enzymatic hydrolysis of lactose: improving the control of industrial processes / Inteligência artificial aplicada a hidrólise enzimática da lactose: melhorando o controle dos processos industriais

Lactose is the main carbohydrate in milk, and its absorption occurs via enzymatic hydrolysis, generating glucose and galactose. Lactose intolerance is the reduction of intestinal hydrolysis capacity due to hypolactasia, which results in the need to consume dairy foods with low levels of this carbohydrate. ß-galactosidase enzymes are used in dairy industries to hydrolyze lactose, thereby allowing intolerant consumers access to dairy products without the negative health implications. Alternative and official analytical methods are used to quantify the carbohydrate content resulting from enzymatic hydrolysis. The objective of this study was to evaluate the enzymatic hydrolysis of two distinct industrial enzymes produced by the microorganisms Bacillus licheniformis and Kluyveromyces lactis using three analytical methods: enzymatic method, cryoscopy, and high performance liquid chromatography (HPLC) using artificial intelligence to improve the control of the industrial processes. After adding the enzymes to skim milk, time kinetics was performed by collecting samples at time 0, every 10 min for 1 h, and every 30 min until the end of 5 h of hydrolysis. In 97% of the cases, a decrease in lactose concentration was observed by HPLC, followed by the deepening of the cryoscopic point. Glucose measurements by absorbance and HPLC quantification were correlated (r = 0.79; p < 0.01) but not concordant (p < 0.01). It was concluded that by means of artificial intelligence, it was possible to indirectly estimate lactose concentration using an algorithm that associates cryoscopy and glucose concentration.(AU)

O principal carboidrato do leite é a lactose e a sua absorção ocorre devido à hidrólise enzimática, gerando glicose e galactose. A intolerância à lactose é a redução da capacidade de hidrólise intestinal devido à hipolactasia, gerando a necessidade do consumo de alimentos lácteos com baixo teor deste carboidrato. As enzimas ß-galactosidase são utilizadas nas indústrias de laticínios para hidrolisar a lactose, proporcionando ao consumidor intolerante a possibilidade de ingerir os produtos lácteos sem prejuízos à saúde. Para quantificar o conteúdo de carboidratos resultante da hidrólise enzimática, são utilizados métodos analíticos alternativos e oficiais. O objetivo deste estudo foi avaliar a hidrólise enzimática de duas enzimas industriais distintas produzidas pelos microrganismos Bacillus licheniformis e Kluyveromyces lactis, por meio de três métodos analíticos: método enzimático, crioscopia e HPLC. A inteligência artificial foi utilizada para melhorar o controle dos processos industriais. Após a adição das enzimas ao leite desnatado, foi realizada a cinética de tempo coletando as amostras no tempo 0, a cada 10 minutos, até completar 1 hora de reação, e a cada 30 minutos até serem atingidas 5 horas de reação de hidrólise. Em 97% dos casos, a diminuição da concentração de lactose por HPLC acompanhou o aprofundamento do ponto crioscópico. As medições de glicose por absorbância e HPLC foram correlacionadas (r = 0,79; p < 0,01), mas não concordantes (p < 0,01). Concluiu-se que, por meio da inteligência artificial, é possível estimar indiretamente a concentração de lactose a partir de um algoritmo que associa a crioscopia e a concentração de glicose.(AU)

Potencial deteriorante da microbiota mesófila, psicrotrófica, termodúrica e esporulada do leite cru / Deteriorating potential of the mesophilic microbiota, psychrotrophic, termoduric and spore raw milk

Considerando os diversos problemas tecnológicos e econômicos que os microrganismos deteriorantes acarretam aos laticínios, o objetivo deste trabalho foi quantificar aeróbios mesófilos, psicrotróficos, termodúricos e esporulados no leite cru produzido na região Norte do Paraná e verificar a capacidade proteolítica e lipolítica desses microrganismos. Foram analisadas 20 amostras de leite cru e determinadas contagens de aeróbios mesófilos, psicrotróficos, termodúricos mesófilos, termodúricos psicrotróficos e esporos aeróbios e o perfil proteolítico e lipolítico de cada grupo. A contagem média de aeróbios mesófilos foi de 1,7x106UFC/mL acima do limite estabelecido pela Instrução Normativa 76 (3,0x105UFC/mL); 55% das amostras apresentaram contagens dentro dos padrões. As contagens de psicrotróficos variaram de 1,0x102 a 9,9x106UFC/mL e em 30% das amostras esse valor foi superior ao de mesófilos. A média de termodúricos mesófilos foi de 2,4x104UFC/mL, de termodúricos psicrotróficos 1,7x102UFC/mL e de esporos aeróbios foi de 5,0x101UFC/mL. Quanto ao perfil deteriorante, todos os grupos apresentaram atividade lipolítica e proteolítica elevadas, com predomínio de bactérias lipolíticas. Os valores encontrados indicam que o manejo higiênico-sanitário inadequado durante a ordenha e o resfriamento prolongado favorece a proliferação da microbiota deteriorante, que pode promover alterações significativas na qualidade e no rendimento do leite e seus derivados, mesmo após tratamento térmico.

Considering that technological problems and economic losses are basically caused by spoilage microorganisms on dairy industry, therefore the aim of this study was to quantify the mesophilic aerobic, psychrotrophic, thermoduric and aerobic spore-forming in raw milk produced in northern Paraná and also verify the proteolytic and lipolytic capacity of these microorganisms. Twenty samples of raw milk were analyzed and were determined mesophilic aerobic, psychrotrophic, thermoduric mesophilic, psychrotrophic thermoduric and aerobicspore-forming counts and proteolytic and lipolytic capacity from each group. The average counts of aerobic mesophilic were 1,79x106CFU/mL, above the limit established to Normative Instruction 76 (3,0x105CFU/mL); 55% samples had scores within the standards. Psychrotrophic counts ranged from 1,0x102 to 9,9x106CFU/mL and in 30% samples this count was higher than mesophilic. The average mesophilic thermoduric was 2,4x104CFU/mL, psychrotrophic thermoduric was 1,7x102CFU/mL and aerobic spore-forming was 5,0x101CFU/mL. As for the spoilage profile, all groups showed higher lipase and proteolytic activity, with a predominance of lipolytic bacteria. The values found indicates the inappropriate hygienic-sanitary management during milking and maintaining molk refrigerated for long periods until pasteurize, it can favorsthe proliferation of spoilage microbiota, which can promote significant changes in the quality and yield of milk and dairy products, even after the heat treatment.

Potencial deteriorante da microbiota mesófila, psicrotrófica, termodúrica e esporulada do leite cru / Deteriorating potential of the mesophilic microbiota, psychrotrophic, termoduric and spore raw milk

Considerando os diversos problemas tecnológicos e econômicos que os microrganismos deteriorantes acarretam aos laticínios, o objetivo deste trabalho foi quantificar aeróbios mesófilos, psicrotróficos, termodúricos e esporulados no leite cru produzido na região Norte do Paraná e verificar a capacidade proteolítica e lipolítica desses microrganismos. Foram analisadas 20 amostras de leite cru e determinadas contagens de aeróbios mesófilos, psicrotróficos, termodúricos mesófilos, termodúricos psicrotróficos e esporos aeróbios e o perfil proteolítico e lipolítico de cada grupo. A contagem média de aeróbios mesófilos foi de 1,7x106UFC/mL acima do limite estabelecido pela Instrução Normativa 76 (3,0x105UFC/mL); 55% das amostras apresentaram contagens dentro dos padrões. As contagens de psicrotróficos variaram de 1,0x102 a 9,9x106UFC/mL e em 30% das amostras esse valor foi superior ao de mesófilos. A média de termodúricos mesófilos foi de 2,4x104UFC/mL, de termodúricos psicrotróficos 1,7x102UFC/mL e de esporos aeróbios foi de 5,0x101UFC/mL. Quanto ao perfil deteriorante, todos os grupos apresentaram atividade lipolítica e proteolítica elevadas, com predomínio de bactérias lipolíticas. Os valores encontrados indicam que o manejo higiênico-sanitário inadequado durante a ordenha e o resfriamento prolongado favorece a proliferação da microbiota deteriorante, que pode promover alterações significativas na qualidade e no rendimento do leite e seus derivados, mesmo após tratamento térmico.(AU)

Considering that technological problems and economic losses are basically caused by spoilage microorganisms on dairy industry, therefore the aim of this study was to quantify the mesophilic aerobic, psychrotrophic, thermoduric and aerobic spore-forming in raw milk produced in northern Paraná and also verify the proteolytic and lipolytic capacity of these microorganisms. Twenty samples of raw milk were analyzed and were determined mesophilic aerobic, psychrotrophic, thermoduric mesophilic, psychrotrophic thermoduric and aerobicspore-forming counts and proteolytic and lipolytic capacity from each group. The average counts of aerobic mesophilic were 1,79x106CFU/mL, above the limit established to Normative Instruction 76 (3,0x105CFU/mL); 55% samples had scores within the standards. Psychrotrophic counts ranged from 1,0x102 to 9,9x106CFU/mL and in 30% samples this count was higher than mesophilic. The average mesophilic thermoduric was 2,4x104CFU/mL, psychrotrophic thermoduric was 1,7x102CFU/mL and aerobic spore-forming was 5,0x101CFU/mL. As for the spoilage profile, all groups showed higher lipase and proteolytic activity, with a predominance of lipolytic bacteria. The values found indicates the inappropriate hygienic-sanitary management during milking and maintaining molk refrigerated for long periods until pasteurize, it can favorsthe proliferation of spoilage microbiota, which can promote significant changes in the quality and yield of milk and dairy products, even after the heat treatment.(AU)

Resistência antimicrobiana e caracterização molecular do grupo filogenético de STEC e EPEC típicas e atípicas isoladas de queijos Minas Frescal clandestinos / Antimicrobial resistance and molecular characterization of the phylogenetic group of STEC and EPEC typical and atypical isolated from clandestines Minas Frescal cheeses

Esse estudo avaliou a resistência antimicrobiana e o grupo filogenético de Escherichia coli enteropatogênicas (EPEC) e produtoras de toxina shiga-like (STEC) em 10 amostras de queijos Minas Frescal clandestinos. A média da contagem de E. coli foi de 1,1 x 105 UFC/g. Duas (1,8%) das 111 cepas foram identificadas como EPEC (gene eaeA) sendo uma EPEC típica (gene bfpA) e outra atípica. Outras três (2,7%) foram identificadas como STEC (gene stx2). A t-EPEC foi resistente à estreptomicina e a a-EPEC à cefoxitina e ampicilina. Uma STEC foi considerada multirresistente (ampicilina, estreptomicina e tetraciclina), outra resistente à tetraciclina e outra sensível. A presença de t-EPEC, juntamente com o predomínio de cepas do grupo filogenético A (60%), confirmam a possível origem fecal humana dos isolados de E. coli nos queijos clandestinos.(AU)

Pseudomonas spp. and other psychrotrophic microorganisms in inspected and non-inspected Brazilian Minas Frescal cheese: proteolytic, lipolytic and AprX production potential / Pseudomonas spp. e outros micro-organismos psicrotróficos em queijos Minas Frescal inspecionados e não inspecionados: potencial proteolítico, lipolítico e produção de AprX

The most consumed cheese in Brazil, Minas Frescal cheese (MFC) is highly susceptible to microbial contamination and clandestine production and commercialization can pose a risk to consumer health. The storage of this fresh product under refrigeration, although more appropriate, may favor the growth of spoilage psychrotrophic bacteria. The objective of this study was to quantify and compare Pseudomonas spp. and other psychrotrophic bacteria in inspected and non-inspected MFC samples, evaluate their lipolytic and proteolytic activities and their metalloprotease production potentials. Twenty MFC samples were evaluated: 10 inspected and 10 non-inspected. Counts of psychrotrophic bacteria and Pseudomonas spp., evaluation of the proteolytic and lipolytic potential of the isolates, and identification of potential producers of alkaline metalloprotease (AprX) were assessed. The mean total psychrotrophic counts were 1.07 (±2.18) × 109CFU/g in the inspected samples and 4.5 (±5.86) × 108CFU/g in the non-inspected, with no significant difference (p=0.37). The average score of Pseudomonas spp. was 6.86 (±18.6) × 105 and 2.08 (±3.65) × 106 CFU/g for the inspected and non-inspected MFC samples, respectively, with no significant difference (p=0.1). Pseudomonas spp. represented 0.06% and 0.004% of psychrotrophic bacteria found in inspected and non-inspected MFC samples, respectively. Collectively, 694 psychrotrophic strains and 47Pseudomonas spp. were isolated, of which 59.9% and 68.1% were simultaneously proteolytic and lipolytic, respectively. Of the 470 psychrotrophs isolated from inspected and 224 from non-inspected cheese samples, 5.74% and 2.23% contained aprX, respectively, while 100 and 86.96% of the Pseudomonas spp. isolates in inspected and non-inspected cheese samples contained the gene. The production potential of AprX did not, however, determine the proteolytic activity on plates of these isolates under the conditions evaluated in this study. Of total, 65.63% of the psychrotrophs that contained aprX gene were confirmed as Pseudomonas spp., using genus-specific PCR. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene of the other psychrotrophs that were potential producers of AprX identified them as Serratia spp. (n=7), Raoultella ornithinolytica (n=1), and Acinetobacter schindleri (n=1) in the inspected samples and Psychrobacter sanguinis (n=1) and Leuconostoc mesenteroides (n=1) in the non-inspected samples. The production conditions of Brazilian MFC of these samples, while meeting the legal determinations, are not sufficient to control Pseudomonas and other spoilage-related psychrotrophs. Thus, stricter hygienic measures are required during the formal production of this type of cheese.(AU)

O mais consumido no Brasil, o queijo Minas Frescal (QMF) é altamente suscetível à contaminação microbiana e a produção e comercialização clandestina podem representar um risco para a saúde do consumidor. O armazenamento deste produto fresco sob refrigeração, embora mais apropriado, pode favorecer a multiplicação de bactérias psicrotróficas deteriorantes. O objetivo deste estudo foi quantificar e comparar Pseudomonas spp. e outras bactérias psicrotróficas em amostras de QMF inspecionadas e não inspecionadas, avaliar o potencial lipolítico, proteolítico e de produção de metaloprotease alcalina. Vinte amostras de QMF foram avaliadas: 10 inspecionadas e 10 não inspecionadas. Foram avaliadas as contagens de bactérias psicrotróficas e Pseudomonas spp., o potencial proteolítico e lipolítico dos isolados e a identificação de potenciais produtores de metaloprotease alcalina (AprX). A média total das contagens de bactérias psicrotróficas foi de 1,07 (±2,18) × 109UFC/g nas amostras inspecionadas e 4,5 (±5,86) × 108UFC/g nas não inspecionadas, sem diferença significativa (p=0,37). A média de Pseudomonasspp. foi de 6,86 (±18,6) × 105 e 2,08 (±3,65) × 106UFC/g para as amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente, sem diferença significativa (p=0,1). Pseudomonas spp. representaram 0,06% e 0,004% de bactérias psicrotróficas encontradas em amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente. Das amostras inspecionadas e não inspecionadas, foram isoladas 694 colônias psicrotróficas e 47 Pseudomonasspp., dos quais 59,9% e 68,1% foram simultaneamente proteolíticos e lipolíticos, respectivamente. Dos 470 isolados de psicrotróficos das amostras de queijo inspecionados e dos 224 isolados das não inspecionadas, 5,74% e 2,23% continham o gene aprX, respectivamente, enquanto 100 e 86,96% das Pseudomonasspp. isoladas em amostras de queijo inspecionadas e não inspecionadas continham o potencial de expressão de AprX. Esse potencial, no entanto, não determinou a atividade proteolítica em placas desses isolados nas condições avaliadas neste estudo. Do total, 65,63% dos psicrotróficos que continham o gene aprX foram confirmados como Pseudomonasspp., utilizando PCR gênero-específico. A análise filogenética do gene 16S rRNA dos outros psicrotróficos que foram produtores potenciais de AprX os identificou como Serratia spp. (n=7), Raoultella ornithinolytica (n=1) e Acinetobacter schindleri (n=1) nas amostras inspecionadas e Psychrobacter sanguinis (n=1) e Leuconostoc mesenteroides (n=1) nas amostras não inspecionadas. As condições de produção do QMF dessas amostras, atendendo às determinações legais, não são suficientes para controlar a Pseudomonas e outros psicrotróficos relacionados à deterioração. Assim, medidas higiênicas mais rígidas são necessárias durante a produção formal deste tipo de queijo.(AU)

Pseudomonas spp. and other psychrotrophic microorganisms in inspected and non-inspected Brazilian Minas Frescal cheese: proteolytic, lipolytic and AprX production potential

ABSTRACT: The most consumed cheese in Brazil, Minas Frescal cheese (MFC) is highly susceptible to microbial contamination and clandestine production and commercialization can pose a risk to consumer health. The storage of this fresh product under refrigeration, although more appropriate, may favor the growth of spoilage psychrotrophic bacteria. The objective of this study was to quantify and compare Pseudomonas spp. and other psychrotrophic bacteria in inspected and non-inspected MFC samples, evaluate their lipolytic and proteolytic activities and their metalloprotease production potentials. Twenty MFC samples were evaluated: 10 inspected and 10 non-inspected. Counts of psychrotrophic bacteria and Pseudomonas spp., evaluation of the proteolytic and lipolytic potential of the isolates, and identification of potential producers of alkaline metalloprotease (AprX) were assessed. The mean total psychrotrophic counts were 1.07 (±2.18) × 109CFU/g in the inspected samples and 4.5 (±5.86) × 108CFU/g in the non-inspected, with no significant difference (p=0.37). The average score of Pseudomonas spp. was 6.86 (±18.6) × 105 and 2.08 (±3.65) × 106 CFU/g for the inspected and non-inspected MFC samples, respectively, with no significant difference (p=0.1). Pseudomonas spp. represented 0.06% and 0.004% of psychrotrophic bacteria found in inspected and non-inspected MFC samples, respectively. Collectively, 694 psychrotrophic strains and 47Pseudomonas spp. were isolated, of which 59.9% and 68.1% were simultaneously proteolytic and lipolytic, respectively. Of the 470 psychrotrophs isolated from inspected and 224 from non-inspected cheese samples, 5.74% and 2.23% contained aprX, respectively, while 100 and 86.96% of the Pseudomonas spp. isolates in inspected and non-inspected cheese samples contained the gene. The production potential of AprX did not, however, determine the proteolytic activity on plates of these isolates under the conditions evaluated in this study. Of total, 65.63% of the psychrotrophs that contained aprX gene were confirmed as Pseudomonas spp., using genus-specific PCR. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene of the other psychrotrophs that were potential producers of AprX identified them as Serratia spp. (n=7), Raoultella ornithinolytica (n=1), and Acinetobacter schindleri (n=1) in the inspected samples and Psychrobacter sanguinis (n=1) and Leuconostoc mesenteroides (n=1) in the non-inspected samples. The production conditions of Brazilian MFC of these samples, while meeting the legal determinations, are not sufficient to control Pseudomonas and other spoilage-related psychrotrophs. Thus, stricter hygienic measures are required during the formal production of this type of cheese.

RESUMO: O mais consumido no Brasil, o queijo Minas Frescal (QMF) é altamente suscetível à contaminação microbiana e a produção e comercialização clandestina podem representar um risco para a saúde do consumidor. O armazenamento deste produto fresco sob refrigeração, embora mais apropriado, pode favorecer a multiplicação de bactérias psicrotróficas deteriorantes. O objetivo deste estudo foi quantificar e comparar Pseudomonas spp. e outras bactérias psicrotróficas em amostras de QMF inspecionadas e não inspecionadas, avaliar o potencial lipolítico, proteolítico e de produção de metaloprotease alcalina. Vinte amostras de QMF foram avaliadas: 10 inspecionadas e 10 não inspecionadas. Foram avaliadas as contagens de bactérias psicrotróficas e Pseudomonas spp., o potencial proteolítico e lipolítico dos isolados e a identificação de potenciais produtores de metaloprotease alcalina (AprX). A média total das contagens de bactérias psicrotróficas foi de 1,07 (±2,18) × 109UFC/g nas amostras inspecionadas e 4,5 (±5,86) × 108UFC/g nas não inspecionadas, sem diferença significativa (p=0,37). A média de Pseudomonasspp. foi de 6,86 (±18,6) × 105 e 2,08 (±3,65) × 106UFC/g para as amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente, sem diferença significativa (p=0,1). Pseudomonas spp. representaram 0,06% e 0,004% de bactérias psicrotróficas encontradas em amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente. Das amostras inspecionadas e não inspecionadas, foram isoladas 694 colônias psicrotróficas e 47 Pseudomonasspp., dos quais 59,9% e 68,1% foram simultaneamente proteolíticos e lipolíticos, respectivamente. Dos 470 isolados de psicrotróficos das amostras de queijo inspecionados e dos 224 isolados das não inspecionadas, 5,74% e 2,23% continham o gene aprX, respectivamente, enquanto 100 e 86,96% das Pseudomonasspp. isoladas em amostras de queijo inspecionadas e não inspecionadas continham o potencial de expressão de AprX. Esse potencial, no entanto, não determinou a atividade proteolítica em placas desses isolados nas condições avaliadas neste estudo. Do total, 65,63% dos psicrotróficos que continham o gene aprX foram confirmados como Pseudomonasspp., utilizando PCR gênero-específico. A análise filogenética do gene 16S rRNA dos outros psicrotróficos que foram produtores potenciais de AprX os identificou como Serratia spp. (n=7), Raoultella ornithinolytica (n=1) e Acinetobacter schindleri (n=1) nas amostras inspecionadas e Psychrobacter sanguinis (n=1) e Leuconostoc mesenteroides (n=1) nas amostras não inspecionadas. As condições de produção do QMF dessas amostras, atendendo às determinações legais, não são suficientes para controlar a Pseudomonas e outros psicrotróficos relacionados à deterioração. Assim, medidas higiênicas mais rígidas são necessárias durante a produção formal deste tipo de queijo.

Pseudomonas spp. and other psychrotrophic microorganisms in inspected and non-inspected Brazilian Minas Frescal cheese: proteolytic, lipolytic and AprX production potential / Pseudomonas spp. e outros micro-organismos psicrotróficos em queijos Minas Frescal inspecionados e não inspecionados: potencial proteolítico, lipolítico e produção de AprX

The most consumed cheese in Brazil, Minas Frescal cheese (MFC) is highly susceptible to microbial contamination and clandestine production and commercialization can pose a risk to consumer health. The storage of this fresh product under refrigeration, although more appropriate, may favor the growth of spoilage psychrotrophic bacteria. The objective of this study was to quantify and compare Pseudomonas spp. and other psychrotrophic bacteria in inspected and non-inspected MFC samples, evaluate their lipolytic and proteolytic activities and their metalloprotease production potentials. Twenty MFC samples were evaluated: 10 inspected and 10 non-inspected. Counts of psychrotrophic bacteria and Pseudomonas spp., evaluation of the proteolytic and lipolytic potential of the isolates, and identification of potential producers of alkaline metalloprotease (AprX) were assessed. The mean total psychrotrophic counts were 1.07 (±2.18) × 109CFU/g in the inspected samples and 4.5 (±5.86) × 108CFU/g in the non-inspected, with no significant difference (p=0.37). The average score of Pseudomonas spp. was 6.86 (±18.6) × 105 and 2.08 (±3.65) × 106 CFU/g for the inspected and non-inspected MFC samples, respectively, with no significant difference (p=0.1). Pseudomonas spp. represented 0.06% and 0.004% of psychrotrophic bacteria found in inspected and non-inspected MFC samples, respectively. Collectively, 694 psychrotrophic strains and 47Pseudomonas spp. were isolated, of which 59.9% and 68.1% were simultaneously proteolytic and lipolytic, respectively. Of the 470 psychrotrophs isolated from inspected and 224 from non-inspected cheese samples, 5.74% and 2.23% contained aprX, respectively, while 100 and 86.96% of the Pseudomonas spp. isolates in inspected and non-inspected cheese samples contained the gene. The production potential of AprX did not, however, determine the proteolytic activity on plates of these isolates under the conditions evaluated in this study...(AU)

O mais consumido no Brasil, o queijo Minas Frescal (QMF) é altamente suscetível à contaminação microbiana e a produção e comercialização clandestina podem representar um risco para a saúde do consumidor. O armazenamento deste produto fresco sob refrigeração, embora mais apropriado, pode favorecer a multiplicação de bactérias psicrotróficas deteriorantes. O objetivo deste estudo foi quantificar e comparar Pseudomonas spp. e outras bactérias psicrotróficas em amostras de QMF inspecionadas e não inspecionadas, avaliar o potencial lipolítico, proteolítico e de produção de metaloprotease alcalina. Vinte amostras de QMF foram avaliadas: 10 inspecionadas e 10 não inspecionadas. Foram avaliadas as contagens de bactérias psicrotróficas e Pseudomonas spp., o potencial proteolítico e lipolítico dos isolados e a identificação de potenciais produtores de metaloprotease alcalina (AprX). A média total das contagens de bactérias psicrotróficas foi de 1,07 (±2,18) × 109UFC/g nas amostras inspecionadas e 4,5 (±5,86) × 108UFC/g nas não inspecionadas, sem diferença significativa (p=0,37). A média de Pseudomonasspp. foi de 6,86 (±18,6) × 105 e 2,08 (±3,65) × 106UFC/g para as amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente, sem diferença significativa (p=0,1). Pseudomonas spp. representaram 0,06% e 0,004% de bactérias psicrotróficas encontradas em amostras QMF inspecionadas e não-inspecionadas, respectivamente. Das amostras inspecionadas e não inspecionadas, foram isoladas 694 colônias psicrotróficas e 47 Pseudomonasspp., dos quais 59,9% e 68,1% foram simultaneamente proteolíticos e lipolíticos, respectivamente. Dos 470 isolados de psicrotróficos das amostras de queijo inspecionados e dos 224 isolados das não inspecionadas, 5,74% e 2,23% continham o gene aprX, respectivamente, enquanto 100 e 86,96% das Pseudomonasspp. isoladas em amostras de queijo inspecionadas e não inspecionadas continham o potencial de expressão de AprX...(AU)

Resistência antimicrobiana e caracterização molecular do grupo filogenético de STEC e EPEC típicas e atípicas isoladas de queijos Minas Frescal clandestinos / Antimicrobial resistance and molecular characterization of the phylogenetic group of STEC and EPEC typical and atypical isolated from clandestines Minas Frescal cheeses

Esse estudo avaliou a resistência antimicrobiana e o grupo filogenético de Escherichia coli enteropatogênicas (EPEC) e produtoras de toxina shiga-like (STEC) em 10 amostras de queijos Minas Frescal clandestinos. A média da contagem de E. coli foi de 1,1 x 105 UFC/g. Duas (1,8%) das 111 cepas foram identificadas como EPEC (gene eaeA) sendo uma EPEC típica (gene bfpA) e outra atípica. Outras três (2,7%) foram identificadas como STEC (gene stx2). A t-EPEC foi resistente à estreptomicina e a a-EPEC à cefoxitina e ampicilina. Uma STEC foi considerada multirresistente (ampicilina, estreptomicina e tetraciclina), outra resistente à tetraciclina e outra sensível. A presença de t-EPEC, juntamente com o predomínio de cepas do grupo filogenético A (60%), confirmam a possível origem fecal humana dos isolados de E. coli nos queijos clandestinos.

Influence of the microbiological quality of raw milk on the shelf life of pasteurized milk / Influência da qualidade microbiológica do leite cru na vida útil do leite pasteurizado

The dairy industry strives to produce high quality products with high nutritional value as well as to meet the legal standards for longer shelf life. However, these goals are made unfeasible by the poor quality of raw milk produced in some regions of Brazil. Others Brazilian dairy regions, however, already succeed in producing milk with low microbial counts, such as the municipality of Castro, Paraná state, designated as the ‘Brazilian dairy capital. In order to evaluate the effect of raw milk quality on microbial counts during the shelf life of pasteurized milk, samples were collected from two dairy regions of Paraná: the northern and Castro region, characterized by milk production with high and low microbiological counts, respectively. Samples were experimentally pasteurized and the total microorganism counts were analyzed for 18 days at 7°C, using the Brazilian standard microbiological count limit for pasteurized milk (8 x 104 CFU/mL) as the end of the shelf life. Low microbiological counts in raw milk (Castro) resulted in significantly lower counts shortly after pasteurization and over the entire shelf life, meeting the pasteurized milk standard for 18 days. The temporal evolution in the counts over 18 days for the milks of high and low microbiological count was similar; however, the disparity between the absolute counts between the regions was significant (p < 0.05). Of the milk samples from northern Paraná, four (44.4%) already had counts higher than that of the legislative limit for pasteurized milk immediately after pasteurization. The others (five) reached the maximum microbiological count limit for pasteurized milk on the 6th day after pasteurization. In contrast, the milk from the Castro region remained below the limit throughout the analysis period...(AU)

Produtos de alta qualidade, com elevado valor nutricional e longa vida útil, são objetivos almejados pela indústria de laticínios, dificultados pela má qualidade microbiológica do leite cru produzido no Brasil. No entanto, algumas regiões já produzem leite com baixas contagens microbianas, como a capital brasileira do leite, Castro, no Paraná. Com a intenção de avaliar o efeito da qualidade do leite cru nas contagens microbianas durante o período de vida útil de leite pasteurizado, amostras de leite cru foram coletadas de duas regiões do Paraná: a região norte e a região de Castro, caracterizadas pela produção de leite com contagens microbiológicas altas e baixas, respectivamente. As amostras foram experimentalmente pasteurizadas e analisadas as contagens totais de micro-organismos pelo período de 18 dias a 7ºC, utilizando o padrão determinado na IN62/2011 para o fim da vida de útil (máx. 8 x 104 UFC/mL). Baixas contagens microbiológicas no leite cru resultaram em contagens significativamente menores logo após a pasteurização e ao longo da vida útil, atendendo ao padrão de qualidade para leite pasteurizado por 18 dias. As evoluções nas contagens durante o período de análise para os leites de alta e baixa contagem microbiológica foram proporcionais, no entanto, a disparidade entre as contagens absolutas entre as regiões foi significativa. O leite do norte do Paraná atingiu o limite máximo para o leite pasteurizado no 6°dia após a pasteurização, enquanto o leite da região de Castro manteve-se abaixo da contagem limite durante todo o período de análise. Dessa forma, é possível afirmar que as contagens de microrganismos e a vida útil do leite pasteurizado está diretamente relacionada às contagens apresentadas pelo leite antes da pasteurização. Assim, para prolongar a vida útil do leite pasteurizado, deve-se diminuir as contagens do leite cru e, como se sabe, as boas práticas de higiene na produção são essenciais para atingir esse objetivo.(AU)

Influence of the microbiological quality of raw milk on the shelf life of pasteurized milk / Influência da qualidade microbiológica do leite cru na vida útil do leite pasteurizado

The dairy industry strives to produce high quality products with high nutritional value as well as to meet the legal standards for longer shelf life. However, these goals are made unfeasible by the poor quality of raw milk produced in some regions of Brazil. Others Brazilian dairy regions, however, already succeed in producing milk with low microbial counts, such as the municipality of Castro, Paraná state, designated as the ‘Brazilian dairy capital’. In order to evaluate the effect of raw milk quality on microbial counts during the shelf life of pasteurized milk, samples were collected from two dairy regions of Paraná: the northern and Castro region, characterized by milk production with high and low microbiological counts, respectively. Samples were experimentally pasteurized and the total microorganism counts were analyzed for 18 days at 7°C, using the Brazilian standard microbiological count limit for pasteurized milk (8 x 104 CFU/mL) as the end of the shelf life. Low microbiological counts in raw milk (Castro) resulted in significantly lower counts shortly after pasteurization and over the entire shelf life, meeting the pasteurized milk standard for 18 days. The temporal evolution in the counts over 18 days for the milks of high and low microbiological count was similar; however, the disparity between the absolute counts between the regions was significant (p < 0.05). Of the milk samples from northern Paraná, four (44.4%) already had counts higher than that of the legislative limit for pasteurized milk immediately after pasteurization. The others (five) reached the maximum microbiological count limit for pasteurized milk on the 6th day after pasteurization. In contrast, the milk from the Castro region remained below the limit throughout the analysis period...

Produtos de alta qualidade, com elevado valor nutricional e longa vida útil, são objetivos almejados pela indústria de laticínios, dificultados pela má qualidade microbiológica do leite cru produzido no Brasil. No entanto, algumas regiões já produzem leite com baixas contagens microbianas, como a capital brasileira do leite, Castro, no Paraná. Com a intenção de avaliar o efeito da qualidade do leite cru nas contagens microbianas durante o período de vida útil de leite pasteurizado, amostras de leite cru foram coletadas de duas regiões do Paraná: a região norte e a região de Castro, caracterizadas pela produção de leite com contagens microbiológicas altas e baixas, respectivamente. As amostras foram experimentalmente pasteurizadas e analisadas as contagens totais de micro-organismos pelo período de 18 dias a 7ºC, utilizando o padrão determinado na IN62/2011 para o fim da vida de útil (máx. 8 x 104 UFC/mL). Baixas contagens microbiológicas no leite cru resultaram em contagens significativamente menores logo após a pasteurização e ao longo da vida útil, atendendo ao padrão de qualidade para leite pasteurizado por 18 dias. As evoluções nas contagens durante o período de análise para os leites de alta e baixa contagem microbiológica foram proporcionais, no entanto, a disparidade entre as contagens absolutas entre as regiões foi significativa. O leite do norte do Paraná atingiu o limite máximo para o leite pasteurizado no 6°dia após a pasteurização, enquanto o leite da região de Castro manteve-se abaixo da contagem limite durante todo o período de análise. Dessa forma, é possível afirmar que as contagens de microrganismos e a vida útil do leite pasteurizado está diretamente relacionada às contagens apresentadas pelo leite antes da pasteurização. Assim, para prolongar a vida útil do leite pasteurizado, deve-se diminuir as contagens do leite cru e, como se sabe, as boas práticas de higiene na produção são essenciais para atingir esse objetivo.

Spoilage potential of spore-forming bacteria from refrigerated raw milk / Potencial deteriorante de bactérias formadoras de esporos do leite cru refrigerado

Aerobic bacterial spores are an important group of microorganisms in raw milk. These microbes are thermoduric, whereas the vegetative forms are thermophilic, thermoduric and psychrotrophic and reduce the shelf life of pasteurized milk. In Brazil, there are a lack of studies on the load of aerobic spores in raw milk; thus, little is known about the spoilage activity of these organisms. The aim the present study was to quantify the aerobic spores in Brazilian refrigerated raw milk of dairy region of Castro, Paraná state, assess the potential proteolytic and/or lipolytic isolates and identify the microorganisms derived from the germination. Twenty milk samples were evaluated, and the aerobic spore count was performed after plating the samples following heat treatment at 80ºC for 12 min. The activity proteolytic and lipolytic isolates were evaluated through subculture on milk agar and tributyrin agar, respectively, and these microorganisms were identified using partial 16S rRNA gene sequences that were compared through GenBank. The aerobic spore counts ranged from 1 to 3.7 log CFU.mL-¹, with a mean of 1.75 (± 0.59) log CFU.mL-¹. After spore germination, 137 aerobic bacterial isolates were obtained, 40 of which (29.2%) showed milk spoilage activity. Among these, 31 isolates (77.5%) were proteolytic and lipolytic, seven isolates (17.5%) were exclusively lipolytic and two isolates (5%) were only proteolytic. Based on the 16S rRNA gene analysis, Bacillus licheniformis (55%), Bacillus spp. (27.5%), Paenibacillus spp. (7.5%), Bacillus pumilus (5%), Bacillus circulans (2.5%) and Brevibacillus spp. (2.5%) were identified. Studies of Brazilian raw milk microbiota have not yet described B. circulans which are frequently detected in milk from other countries. Among the 22 B. licheniformis isolates, 21 microbes (95.5%) showed proteolytic and lipolytic activity, and one isolate (4.5%) exhibited only proteolytic activity. The two B. pumilus isolates were proteolytic...(AU)

Esporos de bactérias aeróbias são um importante grupo de micro-organismos no leite cru. Esses micro-organismos são termodúricos, e suas formas vegetativas são termofílicas, termodúricas e psicrotróficas e reduzem a vida útil do leite pasteurizado. No Brasil, não há estudos sobre os esporos aeróbios no leite cru, assim, pouco se sabe sobre o potencial deteriorante dessa microbiota no leite cru brasileiro. O objetivo do presente trabalho foi quantificar esporos aeróbios no leite cru refrigerado brasileiro, avaliar o seu potencial proteolítico e/ou lipolítico e identificar esses micro-organismos originários da germinação dos esporos. Foram avaliadas 20 amostras de leite cru refrigerado, nas quais foi realizada a contagem de esporos aeróbios após o tratamento térmico de 80ºC por 12 min. A atividade proteolítica e/ou lipolítica dos isolados foi avaliada após o repique das colônias em ágar leite e tributirina, respectivamente, e a identificação desses micro-organismos deteriorantes foi realizada pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA e comparação com as sequencias depositadas no GenBank. As contagens de esporos aeróbios variaram de 1 a 3.7 log CFU.mL-¹, com média de 1.75 (± 0.59) log UFC.mL-¹. Após a germinação dos esporos, foram obtidas 137 colônias, das quais 40 (29.2%) apresentaram algum tipo de atividade deteriorante: 31 (77.5%) isolados foram proteolíticos e lipolíticos, sete (17.5%) foram exclusivamente lipolíticos e dois (5%) foram apenas proteolíticos. Baseado nas sequencias do gene 16S rRNA, foram identificados Bacillus licheniformis (55%), Bacillus spp. (27.5%), Paenibacillus spp. (7.5%), Bacillus pumilus (5%), Bacillus circulans (2.5%) e Brevibacillus spp. (2.5%) entre os esporulados deteriorantes. Estudos preliminaries sobre a microbiota do leite brasileiro ainda não haviam descrito B. circulans e Paenibacillus, gêneros frequentemente descritos no leite de outros países. Entre os 22 B. licheniformis...(AU)

Proteolytic and lipolytic potential of Pseudomonas spp. from goat and bovine raw milk / Potencial proteolítico e lipolítico de espécies de Pseudomonas do leite cru caprino e bovino

Pseudomonas, the main genus of gram-negative microorganisms isolated from milk, is psychrotrophic, biofilm-forming, and thermo-resistant deteriorating enzyme producers. The aim of this study was to quantify Pseudomonas spp. in goat's and cow's milk produced in the Paraná state, Brazil, to evaluate the deteriorating activity of the isolates at mesophilic and psychrotrophic conditions and to identify, at the species level, the isolates with alkaline metalloprotease (aprX gene) production potential. Microbiological, biochemical and molecular methods were used for isolating, confirming and identifying of isolates. The mean counts were 1.6 (±6.3)x104 and 0.89(±3)x102 CFU/mL for goat and bovine milk samples, respectively, immediately after milking. Of the Pseudomonas colonies isolated from goat milk (n=60), 91.7% showed proteolytic potential when incubated at 35°C/48 h and 80% at 7°C/10 days, and lipolytic potential was observed in 95% of the isolates incubated in mesophilic and 78.3% at refrigeration conditions. From the isolates of bovine milk (n=20), 35% showed proteolytic activity only when incubated at 35°C/48 h, and lipolytic potential was observed in 25% of the isolates incubated at 7°C/10d and 35°C/48h. It was observed that 83.3% and 25% of the isolates genetically confirmed as Pseudomonas spp. of goat and bovine milk showed the potential for alkaline metalloprotease production, with the species P. azotoformans, P. koreensis, P. gessardii, P. monteilii and P. lurida being the most frequent in goat milk and P. aeruginosa the only species identified in cow milk.(AU)

Pseudomonas é o principal gênero de micro-organismos Gram negativos isolados do leite, são psicrotróficos, formadores de biofilmes e produtores de enzimas deteriorantes termodúricas. O objetivo do presente trabalho foi quantificar Pseudomonas spp. no leite de cabras e vacas produzido no estado do Paraná, Brasil, avaliar a atividade deteriorante em temperatura mesofílica e psicrotrófica e identificar, em nível de espécie, os isolados com potencial de produção de metaloprotease alcalina (geneaprX). Foram utilizados métodos microbiológicos, bioquímicos e moleculares para isolamento, confirmação e identificação dos isolados. As contagens médias foram de 1,6 (±6,3) x 104 e 0,9 (±3) x 102 UFC/mL para as amostras de leite caprino e bovino, respectivamente. Dos isolados de Pseudomonas do leite de cabra (n=60), 91,7% demonstraram potencial proteolítico quando incubadas a 35°C/48h e 80% a 7°C/10dias e lipolíticos em 95% dos isolados incubados em mesofilia e em 78,3% dos incubados em temperatura de refrigeração. Dos isolados do leite bovino (n=20), foi verificada atividade proteolítica de 35% apenas quando incubadas a 35°C/48h e lipolítica em 25% dos isolados incubados a 7°C/10d e 35°C/48h. Foi observado que 83,3% e 25% dos isolados confirmados geneticamente como Pseudomonas spp. do leite caprino e bovino, respectivamente, apresentaram o potencial de produção de metaloprotease alcalina, sendo as espécies P. azotoformans, P. koreensis, P. gessardii, P. monteilii e P. lurida as mais frequentes no leite de cabras e P. aeruginosa a única identificada do leite de vacas.(AU)

Proteolytic and lipolytic potential of Pseudomonas spp. from goat and bovine raw milk / Potencial proteolítico e lipolítico de espécies de Pseudomonas do leite cru caprino e bovino

Pseudomonas, the main genus of gram-negative microorganisms isolated from milk, is psychrotrophic, biofilm-forming, and thermo-resistant deteriorating enzyme producers. The aim of this study was to quantify Pseudomonas spp. in goat's and cow's milk produced in the Paraná state, Brazil, to evaluate the deteriorating activity of the isolates at mesophilic and psychrotrophic conditions and to identify, at the species level, the isolates with alkaline metalloprotease (aprX gene) production potential. Microbiological, biochemical and molecular methods were used for isolating, confirming and identifying of isolates. The mean counts were 1.6 (±6.3)x104 and 0.89(±3)x102 CFU/mL for goat and bovine milk samples, respectively, immediately after milking. Of the Pseudomonas colonies isolated from goat milk (n=60), 91.7% showed proteolytic potential when incubated at 35°C/48 h and 80% at 7°C/10 days, and lipolytic potential was observed in 95% of the isolates incubated in mesophilic and 78.3% at refrigeration conditions. From the isolates of bovine milk (n=20), 35% showed proteolytic activity only when incubated at 35°C/48 h, and lipolytic potential was observed in 25% of the isolates incubated at 7°C/10d and 35°C/48h. It was observed that 83.3% and 25% of the isolates genetically confirmed as Pseudomonas spp. of goat and bovine milk showed the potential for alkaline metalloprotease production, with the species P. azotoformans, P. koreensis, P. gessardii, P. monteilii and P. lurida being the most frequent in goat milk and P. aeruginosa the only species identified in cow milk.(AU)

Pseudomonas é o principal gênero de micro-organismos Gram negativos isolados do leite, são psicrotróficos, formadores de biofilmes e produtores de enzimas deteriorantes termodúricas. O objetivo do presente trabalho foi quantificar Pseudomonas spp. no leite de cabras e vacas produzido no estado do Paraná, Brasil, avaliar a atividade deteriorante em temperatura mesofílica e psicrotrófica e identificar, em nível de espécie, os isolados com potencial de produção de metaloprotease alcalina (geneaprX). Foram utilizados métodos microbiológicos, bioquímicos e moleculares para isolamento, confirmação e identificação dos isolados. As contagens médias foram de 1,6 (±6,3) x 104 e 0,9 (±3) x 102 UFC/mL para as amostras de leite caprino e bovino, respectivamente. Dos isolados de Pseudomonas do leite de cabra (n=60), 91,7% demonstraram potencial proteolítico quando incubadas a 35°C/48h e 80% a 7°C/10dias e lipolíticos em 95% dos isolados incubados em mesofilia e em 78,3% dos incubados em temperatura de refrigeração. Dos isolados do leite bovino (n=20), foi verificada atividade proteolítica de 35% apenas quando incubadas a 35°C/48h e lipolítica em 25% dos isolados incubados a 7°C/10d e 35°C/48h. Foi observado que 83,3% e 25% dos isolados confirmados geneticamente como Pseudomonas spp. do leite caprino e bovino, respectivamente, apresentaram o potencial de produção de metaloprotease alcalina, sendo as espécies P. azotoformans, P. koreensis, P. gessardii, P. monteilii e P. lurida as mais frequentes no leite de cabras e P. aeruginosa a única identificada do leite de vacas.(AU)

Quality of goat"s milk produced on farms in the Paraná State - Brazil / Qualidade do leite de cabra produzido em fazendas do Paraná - Brasil

The consumption of goats milk has increased significantly in Brazil. In 2014, its production was 153 thousand tons, and the Paraná state is responsible for the production of 380 thousand liters. Although the government regulates goat milk, this raw material is not widely studied in Brazil. The objective of this work was to study its microbiological and physicochemical characteristics. A total of 32 samples from 8 Paraná State farms were analyzed. The microbial indicators of hygiene, psychrotrophic bacteria, L. monocytogenes and Salmonella spp. were evaluated. We used physicochemical tests of goats milk that were established by the Brazilian legislation. In addition, phosphatase activity, pH, conductivity, boiling test, and urea content were measured. The average concentrations of mesophilic aerobes, coliforms, E. coli, coagulase positive Staphylococcus and psychrotrophic microorganisms were 4.10, 2.38, 0.65, 2.06 and 4.02 log CFU mL-1, respectively. The samples did not present L. monocytogenes and Salmonella spp. In the physicochemical analysis, 90.63% of the samples presented at least one parameter outside the legal standards. In the somatic cell count, 73.33% of the samples had counts higher than 1 x 106 cells mL-1. Raw goats milk produced in Paraná has high coliform and psychrotrophic counts, indicating poor hygiene during milking. The fluctuating values of the physicochemical data indicate that additional studies are required to determine the parameters that reflect the Brazilian conditions of goat milk production.(AU)

O consumo de leite de cabra tem aumentado significativamente no Brasil. Em 2014, sua produção foi de 153 mil toneladas, e o estado do Paraná foi responsável pela produção de 380 mil litros. Embora o governo regulamenta o leite de cabra, essa matéria-prima não é amplamente estudada no Brasil. O objetivo deste trabalho foi estudar suas características microbiológicas e físico-químicas. Foram analisadas 32 amostras de 8 fazendas do estado do Paraná. Os indicadores microbianos de higiene, bactérias psicrotróficas, L. monocytogenes e Salmonella spp. foram avaliados. Foram realizados testes físico-químicos estabelecidos pela legislação brasileira para leite de cabra. Além disso, realizou-se o teste de ebulição e o teor de ureia. As concentrações médias de aeróbios mesofílicos, coliformes, E. coli, Staphylococcus coagulase positivo e microrganismos psicrotróficos foram de 4.10, 2.38, 0.65, 2.06 e 4.02 log UFC mL-1, respectivamente. As amostras não apresentaram L. monocytogenes e Salmonella spp. Na análise físico-química, 90.63% das amostras apresentaram pelo menos um parâmetro fora dos padrões legais. Na contagem de células somáticas, 73.33% das amostras tiveram contagens superiores a 1 x 106 células mL-1. O leite de cabra cru produzido no Paraná tem altas contagens de coliformes e psicrotróficos, indicando uma má higiene durante a ordenha. Os valores flutuantes dos dados físico-químicos indicam que são necessários estudos adicionais para determinar os parâmetros que refletem as condições brasileiras de produção de leite caprino.(AU)

Efficiency of boiling and four other methods for genomic DNA extraction of deteriorating spore-forming bacteria from milk / Eficiência da fervura e outros quatro métodos para extração do DNA genômico de bactérias esporuladas deteriorantes do leite

The spore-forming microbiota is mainly responsible for the deterioration of pasteurized milk with long shelf life in the United States. The identification of these microorganisms, using molecular tools, is of particular importance for the maintenance of the quality of milk. However, these molecular techniques are not only costly but also labor-intensive and time-consuming. The aim of this study was to compare the efficiency of boiling in conjunction with four other methods for the genomic DNA extraction of sporulated bacteria with proteolytic and lipolytic potential isolated from raw milk in the states of Paraná and Maranhão, Brazil. Protocols based on cellular lysis by enzymatic digestion, phenolic extraction, microwave-heating, as well as the use of guanidine isothiocyanate were used. This study proposes a method involving simple boiling for the extraction of genomic DNA from these microorganisms. Variations in the quality and yield of the extracted DNA among these methods were observed. However, both the cell lysis protocol by enzymatic digestion (commercial kit) and the simple boiling method proposed in this study yielded sufficient DNA for successfully carrying out the Polymerase Chain Reaction (PCR) of the rpoB and 16S rRNA genes for all 11 strains of microorganisms tested. Other protocols failed to yield sufficient quantity and quality of DNA from all microorganisms tested, since only a few strains have showed positive results by PCR, thereby hindering the search for new microorganisms. Thus, the simple boiling method for DNA extraction from sporulated bacteria in spoiled milk showed the same efficacy as that of the commercial kit. Moreover, the method is inexpensive, easy to perform, and much less time-consuming.

A microbiota esporulada é a principal responsável pela deterioração do leite pasteurizado de longa vida útil nos Estados Unidos. A identificação destes micro-organismos é de especial importância para a qualidade do leite e ferramentas moleculares são fundamentais nesse processo. No entanto, exigem a execução de etapas onerosas e laboriosas que podem inviabilizar algumas pesquisas. O objetivo do presente trabalho foi comparar a eficiência do método de extração de DNA por fervura com outros quatro métodos para extração de DNA genômico de bactérias esporuladas com potencial proteolítico e lipolítico isoladas do leite cru dos estados do Paraná e Maranhão, Brasil. Foram utilizados protocolos que se baseavam na lise celular por digestão enzimática, agitação com fenol, aquecimento em micro-ondas, tiocianato de guanidina e este trabalho propõe um método por fervura simples para o estudo desses micro-organismos. Observaram-se variações nos métodos de quantificação do DNA extraído e baixo coeficiente de correlação de Person entre esses métodos. No entanto, observou-se que tanto no protocolo de lise celular por digestão enzimática (kit comercial) quanto na fervura simples proposta pelo presente estudo, houve êxito na realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para pesquisa dos genes rpoB e 16S rRNA para todas as 11 cepas de micro-organismos testadas. Os outros protocolos não apresentaram sucesso na extração de DNA para a totalidade da microbiota avaliada, já que somente algumas amostras tiveram êxito nas reações de PCR, fato que os inviabiliza para a pesquisa desses micro-organismos. Dessa forma, o método de fervura simples das suspensões de bactérias esporuladas deteriorantes do leite demonstrou a mesma eficiência do kit comercial para a extração do DNA desses micro-organismos, sendo um método de baixo custo e de fácil e rápida execução.

Efficiency of boiling and four other methods for genomic DNA extraction of deteriorating spore-forming bacteria from milk / Eficiência da fervura e outros quatro métodos para extração do DNA genômico de bactérias esporuladas deteriorantes do leite

The spore-forming microbiota is mainly responsible for the deterioration of pasteurized milk with long shelf life in the United States. The identification of these microorganisms, using molecular tools, is of particular importance for the maintenance of the quality of milk. However, these molecular techniques are not only costly but also labor-intensive and time-consuming. The aim of this study was to compare the efficiency of boiling in conjunction with four other methods for the genomic DNA extraction of sporulated bacteria with proteolytic and lipolytic potential isolated from raw milk in the states of Paraná and Maranhão, Brazil. Protocols based on cellular lysis by enzymatic digestion, phenolic extraction, microwave-heating, as well as the use of guanidine isothiocyanate were used. This study proposes a method involving simple boiling for the extraction of genomic DNA from these microorganisms. Variations in the quality and yield of the extracted DNA among these methods were observed. However, both the cell lysis protocol by enzymatic digestion (commercial kit) and the simple boiling method proposed in this study yielded sufficient DNA for successfully carrying out the Polymerase Chain Reaction (PCR) of the rpoB and 16S rRNA genes for all 11 strains of microorganisms tested. Other protocols failed to yield sufficient quantity and quality of DNA from all microorganisms tested, since only a few strains have showed positive results by PCR, thereby hindering the search for new microorganisms. Thus, the simple boiling method for DNA extraction from sporulated bacteria in spoiled milk showed the same efficacy as that of the commercial kit. Moreover, the method is inexpensive, easy to perform, and much less time-consuming.(AU)

A microbiota esporulada é a principal responsável pela deterioração do leite pasteurizado de longa vida útil nos Estados Unidos. A identificação destes micro-organismos é de especial importância para a qualidade do leite e ferramentas moleculares são fundamentais nesse processo. No entanto, exigem a execução de etapas onerosas e laboriosas que podem inviabilizar algumas pesquisas. O objetivo do presente trabalho foi comparar a eficiência do método de extração de DNA por fervura com outros quatro métodos para extração de DNA genômico de bactérias esporuladas com potencial proteolítico e lipolítico isoladas do leite cru dos estados do Paraná e Maranhão, Brasil. Foram utilizados protocolos que se baseavam na lise celular por digestão enzimática, agitação com fenol, aquecimento em micro-ondas, tiocianato de guanidina e este trabalho propõe um método por fervura simples para o estudo desses micro-organismos. Observaram-se variações nos métodos de quantificação do DNA extraído e baixo coeficiente de correlação de Person entre esses métodos. No entanto, observou-se que tanto no protocolo de lise celular por digestão enzimática (kit comercial) quanto na fervura simples proposta pelo presente estudo, houve êxito na realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para pesquisa dos genes rpoB e 16S rRNA para todas as 11 cepas de micro-organismos testadas. Os outros protocolos não apresentaram sucesso na extração de DNA para a totalidade da microbiota avaliada, já que somente algumas amostras tiveram êxito nas reações de PCR, fato que os inviabiliza para a pesquisa desses micro-organismos. Dessa forma, o método de fervura simples das suspensões de bactérias esporuladas deteriorantes do leite demonstrou a mesma eficiência do kit comercial para a extração do DNA desses micro-organismos, sendo um método de baixo custo e de fácil e rápida execução.(AU)

Quality of milk produced by small and large dairy producers / Qualidade do leite produzido por pequenos e grandes produtores

The aim of this study was to compare the microbiological and physicochemical quality of raw milk produced by small and large dairy producers in Paraná, Brazil. Samples of raw milk were collected from small (49) and large (21) dairy producers. Dairy farms were characterized by observation and application of questionnaires. The total bacterial count (TBC) was obtained by flow cytometry and Petrifilm® AC, while the somatic cell count (SCC) was obtained by only flow cytometry. The content of fat, proteins, lactose, and solids in the mil were determined by infrared. Differences were observed in the techniques employed by small and large dairy producers, which may have influenced the microbiological quality of raw milk. Milk contamination significantly greater in milk produced by small farmers, which is evident from the average TBC of 3.8 × 106 CFU/mL obtained from milk produced by small farmers as compared to the TBC of 1.5 × 104 CFU/mL obtained from larger dairy farms. Twenty-four (49%) small diary producers are no-compliant with the current standards for microbiological quality of refrigerated raw milk established by the law, while all larger producers were compliant with the standards. The average SCC of milk obtained from small producers was 2.2 × 105 SC/mL, while that of large milk producers was 3.9 × 105 SC/mL. Milk produced by small producers contained significantly higher...(AU)

O objetivo do presente trabalho foi comparar a qualidade microbiológica e físico-química do leite cru refrigerado  roduzido por pequenos e grandes produtores do estado do Paraná, Brasil. Foram avaliadas amostras de leite cru refrigerado, oriundas de pequenos (49) e grandes (21) produtores. A caracterização das propriedades foi realizada através da observação e aplicação de questionários. A Contagem Bacteriana Total (CBT) foi realizada por citometria de fluxo e em PetrifilmTM AC, a Contagem de Células Somáticas (CCS) por citometria de fluxo e os percentuais de gordura, proteína, lactose e sólidos totais por infravermelho. Foram observadas diferenças de tecnificação entre os pequenos e grandes produtores, o que provavelmente influenciou a qualidade microbiológica do leite cru. A contaminação do leite foi substancialmente superior no leite produzido por pequenos produtores, como demonstrado pelas médias de CBT 3,8 x 106 UFC/mL e 1,5 x 104 UFC/mL, respectivamente para pequenas e grandes propriedades. Considerando o padrão vigente de qualidade microbiológica do leite cru refrigerado determinado pela legislação, 24 (49%) pequenos produtores estão em desacordo, enquanto todos os grandes produtores estão em conformidade com a legislação. A CCS média foi de 2,2 x 105 CS/mL para os pequenos e 3,9 x 105 CS/mL para os grandes produtores de leite. O leite oriundo dos pequenos produtores...(AU)

Preservatives and neutralizing substances in milk: analytical sensitivity of official specific and nonspecific tests, microbial inhibition effect, and residue persistence in milk / Sustâncias conservantes e neutralizantes no leite: sensibilidade analítica das provas oficiais específicas, provas inespecíficas, inibição microbiana e persistência de resíduos no leite

Milk fraud has been a recurring problem in Brazil; thus, it is important to know the effect of most frequently used preservatives and neutralizing substances as well as the detection capability of official tests. The objective of this study was to evaluate the analytical sensitivity of legislation-described tests and nonspecific microbial inhibition tests, and to investigate the effect of such substances on microbial growth inhibition and the persistence of detectable residues after 24/48h of refrigeration. Batches of raw milk, free from any contaminant, were divided into aliquots and mixed with different concentrations of formaldehyde, hydrogen peroxide, sodium hypochlorite, chlorine, chlorinated alkaline detergent, or sodium hydroxide. The analytical sensitivity of the official tests was 0.005%, 0.003%, and 0.013% for formaldehyde, hydrogen peroxide, and hypochlorite, respectively. Chlorine and chlorinated alkaline detergent were not detected by regulatory tests. In the tests for neutralizing substances, sodium hydroxide could not be detected when acidity was accurately neutralized. The yogurt culture test gave results similar to those obtained by official tests for the detection of specific substances. Concentrations of 0.05% of formaldehyde, 0.003% of hydrogen peroxide and 0.013% of sodium hypochlorite significantly reduced (P<0.05) the microbial counts in milk after 24 and 48h refrigeration. Formaldehyde and sodium hypochlorite remained detectable in milk after 48 and 24h of refrigeration, respectively; while hydrogen peroxide could not be detected after 24h. Official tests for the detection of milk fraud by the addition of preservatives and neutralizing substances present limitations and may be ineffective in detecting milk adulteration.(AU)

Fraudes no leite têm sido um problema recorrente no Brasil, tornando importante conhecer o efeito dos conservantes e neutralizantes utilizados com maior frequência, e a capacidade de detecção das provas oficiais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade analítica de provas descritas pela legislação, das provas por inibição microbiana inespecífica, o efeito dessas substâncias na inibição do crescimento microbiano e a persistência de resíduos detectáveis após 48 horas de refrigeração. Lotes de leite cru, livres de sustâncias adulterantes, foram aliquotados e adicionados de diferentes concentrações de formaldeído, peróxido de hidrogênio, hipoclorito de sódio, cloro, detergente alcalino clorado e hidróxido de sódio. A sensibilidade analítica das provas oficiais foi: 0,005% para formaldeído; 0,003% para peróxido de hidrogênio e 0,013% para hipoclorito. Cloro e detergente alcalino clorado não foram detectados pelas provas oficiais. A prova de neutralizantes não detectou hidróxido de sódio quando a acidez foi neutralizada com precisão. A prova da cultura de iogurte apresentou resultados próximos ao das provas oficiais para substâncias específicas. Concentrações de 0,05% formaldeído, 0,003% de peróxido de hidrogênio e 0,013% de hipoclorito de sódio reduziram significativamente (P 0,05) a microbiota do leite após 24 e 48 horas de refrigeração. O formaldeído e hipoclorito de sódio permaneceram detectável no leite após 48 e 24 horas de refrigeração, respectivamente e o peróxido de hidrogênio não foi detectável após 24 horas. As provas oficiais para a pesquisa de fraudes por adição de conservantes e neutralizantes ao leite apresentam limitações e podem não ser capazes de detectar adulterações no leite.(AU)

Determination of freezing point standard for UHT milk / Determinação do parâmetro de crioscopia para leite UHT

The extended shelf life and undemanding storage requirements of UHT (ultra high temperature) milk make it the most consumed fluid milk in Brazil. The thermal treatment to which UHT milk is subjected alters casein micellar structure, leading to protein sedimentation and age gelation. Therefore, the current legislation allows the addition of up to 0.1% stabilizing salts (sodium citrate and/or sodium phosphates) in milk. The adding of stabilizing salts hinders the possibility of inclusion of freezing point and density as quality parameters of UHT milk. Evaluation of freezing point is the main test to detect adulteration of milk with water; however, addition of stabilizers alters its results. This study aimed to measure the alterations in freezing point and density caused by stabilizers in samples of pasteurized milk added with sodium citrate or sodium phosphates, in order to propose standards for freezing point and density for UHT milk. For this purpose, 16 aliquots of milk were prepared in nine repetitions with different concentrations (0%, 0.001%, 0.01%, 0.05%, 0.075%, 0.1%, 0.125%, and 0.15%) of sodium citrate or a commercial mix of sodium mono-, di- and triphosphate. The density and freezing point of all aliquots were tested. As expected, addition of stabilizers lowered the freezing point of milk. Addition of 0.1% citrate and commercial mix promoted an average reduction of –0.021°H (± 0.001) and –0.017°H (± 0.002) in freezing point, respectively. However, no significant change in the density of milk was observed. Given that UHT milk industry usually adds the maximum limit of 0.1% of stabilizers in order to obtain proper effect, the interval from –0.572°H to –0.545°H can be suggested as the standard for freezing point to UHT milk. However, as the addition of stabilizers caused no significant change in the density of UHT milk, the density parameter of raw and pasteurized milk in the range from 1.028 g.mL-1 to 1.034 g.mL-1 could be applied to UHT milk.(AU)

Por apresentar prolongada vida útil e facilidade de estocagem, o leite Ultra Alta Temperatura (UAT) é o leite fluido mais consumido no Brasil. O processamento térmico ao qual o leite UHT é submetido provoca alterações na estrutura micelar da caseína favorecendo a precipitação proteica e a gelatinização; por isso, a legislação vigente autoriza a adição de estabilizantes (citrato e/ou fosfatos de sódio) na quantidade de até 0,1%. A adição de estabilizantes ao leite UHT é a razão pela qual não se inclui o índice crioscópico e a densidade como parâmetros de qualidade para o leite UHT. A avaliação do índice crioscópico é a prova de eleição para detecção de fraudes por adição de água ao leite, no entanto a adição de estabilizantes interfere nos seus resultados. O presente estudo teve como objetivo aferir as alterações promovidas por estabilizantes no ponto de congelamento e densidade em amostras de leite pasteurizado adicionado de citrato de sódio ou fosfatos de sódio, para sugerir padrões de crioscopia e densidade para o leite UHT. Para avaliar as alterações provocadas pela adição dos estabilizantes no leite, 16 alíquotas de leite foram preparadas em nove repetições, com diferentes concentrações (0%, 0,001%, 0,01%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,125% e 0,15%) de citrato de sódio chamado de substância 1 e da substância 2: um mix comercial de mono, di e tri fosfato de sódio. As alíquotas foram submetidas à prova da densidade e crioscopia. Como esperado a adição de estabilizantes reduziu o ponto de congelamento do leite. A concentração de 0,1% de citrato e do mix comercial provocou uma redução média da crioscopia do leite de –0,021°H (±0,001) e –0,017°H (±0,002), respectivamente. Em relação à densidade, a adição dos estabilizantes não provocou alterações significativas.[...](AU)