4-hydroxy-2-nonenal as a marker of the oxidative stress in brains of dogs with canine distemper / 4-hidroxi-2-nonenal como marcador de estresse oxidativo no cérebro de cães com cinomose

Canine Distemper is a disease caused by Canine morbillivirus (CM), a pantropic virus that can affect the central nervous system (CNS), causing demyelination. However, the pathogenesis of this lesion remains to be clarified. Brain samples of 14 naturally infected dogs by CM were analyzed to evaluate the presence of oxidative stress and demyelination. RT-PCR assay was performed to confirm a diagnosis of canine distemper in the brain, immunohistochemistry anti-CM was used to localize the viral proteins in the tissue, and anti-4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) was a marker of a product of lipid peroxidation. The results showed the presence of viral proteins in the demyelinated area with the presence of 4-HNE. Our results suggest that the CM virus infection causes oxidative stress leading to lipid peroxidation, which causes tissue damage and demyelination. In conclusion, oxidative stress plays a significant role in canine distemper pathogenesis in the CNS.(AU)

A cinomose canina é uma doença causada pelo Morbilivírus canino (CM), um vírus pantrópico que pode afetar o sistema nervoso central (SNC), causando desmielinização. No entanto, a patogênese dessa lesão não está totalmente esclarecida. RT-PCR e imuno-histoquímica foram realizadas para confirmação do diagnóstico de cinomose em amostras de encéfalo de 14 cães naturalmente infectados. Após confirmação, foi realizada uma avaliação do estresse oxidativo por imuno-histoquímica com uso de anti-4-hidroxi-nonenal (4HNE) como marcador de produtos resultantes da peroxidação lipídica. Os resultados sugerem que a infecção pelo CM causa estresse oxidativo no tecido, levando a peroxidação lipídica, a qual causa danos ao tecido, culminando com desmielinização. Conclui-se que o estresse oxidativo tem papel importante na patogênese da cinomose canina no sistema nervoso central.(AU)

Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) and coinfections with feline viral pathogens in domestic cats in Brazil / Ocorrência de Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) e coinfecções com patógenos virais felinos em gatos domésticos no Brasil

Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) may causes an asymptomatic infection that result in an efficient transmission and subsequently dissemination of the virus in feline population. This study used molecular detection by qPCR (quantitative PCR) based on DNA polymerase gene fragment amplification to evaluate the occurrence of FcaGHV1 and its correlation with other feline viral pathogens, such as Carnivore protoparvovirus 1 (CPPV-1), Felid alphaherpesvirus 1 (FeHV-1), and feline retroviruses such as feline immunodeficiency virus (FIV) and feline leukemia virus (FeLV). Of the 182 blood samples evaluated 23.6% (43/182) were positives for FcaGHV1. Approximately 37.9% (33/87) of the samples that tested positive for retrovirus were also were positive for FcaGHV1 infection (P 0.0001). Among FIV-infected samples, 49% (24/49) were positive for FcaGHV1 (P 0.0001). FcaGHV1 infection was not associated with FeLV (P>0.66) or CPPV-1 (P>0.46) coinfection. All samples were negative for FeHV-1. Male felines were significantly associated to FcaGHV1 (P 0.0001) and their risk of infection with FcaGHV1 was about of 7.74 times greater compared to females. Kittens ( 1year) were the least affected by FcaGHV1 infection, being verified a rate of 7.7% (4/52). Therefore, male cats over one year old and infected with FIV were considerably more likely to be infected with FcaGHV1. To our knowledge, this is the first study to report the occurrence and molecular detection of FcaGHV1 infection in domestic cats in Brazil and in South America.(AU)

Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) pode causar uma infecção assintomática, que resulta em uma transmissão eficiente e consequente disseminação do virus na população felina. Este estudo utilizou a detecção molecular por qPCR (PCR quantitativa) baseado na amplificação de um fragmento do gene da DNA polimerase para avaliar a ocorrência de FcaGHV1, sendo correlacionado a outros patógenos virais felinos como Carnivore protoparvovirus 1 (CPPV-1), Felid alphaherpesvirus 1 (FeHV-1) e aos retrovírus felinos como vírus da imunodeficiência felina (FIV) e vírus da leucemia felina (FeLV). Das 182 amostras de sangue avaliadas, 23,6% (43/182) foram positivas para FcaGHV1. Aproximadamente 37,9% (33/87) das amostras positivas para retrovirus também foram positivas para FcaGHV1 (P 0,0001). Entre as amostras FIV-infectadas, 49% (24/49) foram positivas para FcaGHV1 (P 0,0001). A infecção por FcaGHV1 não foi associada à coinfecção por FeLV (P>0,66) e CPPV-1 (P>0,46). Todas as amostras foram negativas para FeHV-1. Felinos machos foram significativativamente associados à infecção por FcaHV1 (P 0,0001) e o risco de infecção com FcaGHV1 foi aproximadamente 7,74 vezes maior comparados às femeas. Os filhotes (1 ano) foram os menos acometidos pela infecção por FcaGHV1 sendo verificado uma proporção de 7.7% (4/52). Assim, gatos machos com mais de um ano de idade e infectados por FIV foram, consideravelmente, mais susceptíveis a serem infectados com FcaGHV1. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que relata a ocorrência de infecção e detecção molecular de FcaGHV1 em gatos domésticos no Brasil e na América do Sul.(AU)

Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) and coinfections with feline viral pathogens in domestic cats in Brazil / Ocorrência de Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) e coinfecções com patógenos virais felinos em gatos domésticos no Brasil

Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) may causes an asymptomatic infection that result in an efficient transmission and subsequently dissemination of the virus in feline population. This study used molecular detection by qPCR (quantitative PCR) based on DNA polymerase gene fragment amplification to evaluate the occurrence of FcaGHV1 and its correlation with other feline viral pathogens, such as Carnivore protoparvovirus 1 (CPPV-1), Felid alphaherpesvirus 1 (FeHV-1), and feline retroviruses such as feline immunodeficiency virus (FIV) and feline leukemia virus (FeLV). Of the 182 blood samples evaluated 23.6% (43/182) were positives for FcaGHV1. Approximately 37.9% (33/87) of the samples that tested positive for retrovirus were also were positive for FcaGHV1 infection (P 0.0001). Among FIV-infected samples, 49% (24/49) were positive for FcaGHV1 (P 0.0001). FcaGHV1 infection was not associated with FeLV (P>0.66) or CPPV-1 (P>0.46) coinfection. All samples were negative for FeHV-1. Male felines were significantly associated to FcaGHV1 (P 0.0001) and their risk of infection with FcaGHV1 was about of 7.74 times greater compared to females. Kittens ( 1year) were the least affected by FcaGHV1 infection, being verified a rate of 7.7% (4/52). Therefore, male cats over one year old and infected with FIV were considerably more likely to be infected with FcaGHV1. To our knowledge, this is the first study to report the occurrence and molecular detection of FcaGHV1 infection in domestic cats in Brazil and in South America.

Felis catus gammaherpesvirus 1 (FcaGHV1) pode causar uma infecção assintomática, que resulta em uma transmissão eficiente e consequente disseminação do virus na população felina. Este estudo utilizou a detecção molecular por qPCR (PCR quantitativa) baseado na amplificação de um fragmento do gene da DNA polimerase para avaliar a ocorrência de FcaGHV1, sendo correlacionado a outros patógenos virais felinos como Carnivore protoparvovirus 1 (CPPV-1), Felid alphaherpesvirus 1 (FeHV-1) e aos retrovírus felinos como vírus da imunodeficiência felina (FIV) e vírus da leucemia felina (FeLV). Das 182 amostras de sangue avaliadas, 23,6% (43/182) foram positivas para FcaGHV1. Aproximadamente 37,9% (33/87) das amostras positivas para retrovirus também foram positivas para FcaGHV1 (P 0,0001). Entre as amostras FIV-infectadas, 49% (24/49) foram positivas para FcaGHV1 (P 0,0001). A infecção por FcaGHV1 não foi associada à coinfecção por FeLV (P>0,66) e CPPV-1 (P>0,46). Todas as amostras foram negativas para FeHV-1. Felinos machos foram significativativamente associados à infecção por FcaHV1 (P 0,0001) e o risco de infecção com FcaGHV1 foi aproximadamente 7,74 vezes maior comparados às femeas. Os filhotes (1 ano) foram os menos acometidos pela infecção por FcaGHV1 sendo verificado uma proporção de 7.7% (4/52). Assim, gatos machos com mais de um ano de idade e infectados por FIV foram, consideravelmente, mais susceptíveis a serem infectados com FcaGHV1. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que relata a ocorrência de infecção e detecção molecular de FcaGHV1 em gatos domésticos no Brasil e na América do Sul.

Development and validation of a modified TaqMan based real-time PCR assay targeting the lipl32 gene for detection of pathogenic Leptospira in canine urine samples

A modified TaqMan real-time polymerase chain reaction targeting a 138 bp fragment within the lipl32 gene was developed to identify exclusively pathogenic Leptospira spp. in dog urine samples. Thirty-five samples from dogs with suspected clinical leptospirosis and 116 samples from apparently healthy dogs were tested for presence of leptospiral DNA using the TaqMan-based assay. The results were compared with those from a well-established conventional PCR targeting the 16S RNA encoding gene associated with nucleotide sequencing analysis. The overall agreement between the assays was 94.8% (confidence interval [CI] 95% 88-100%). The newly developed assay presented 91.6% (CI 95% 71.5-98.5%) relative sensitivity (22[+] lipl32 PCR/24[+] 16S RNA and sequencing), 100% (CI 95% 96.3-100%) relative specificity and 98.7% accuracy (CI 95% 94.8-100%). The lipl32 assay was able to detect and quantify at least 10 genome equivalents/reaction. DNA extracted from 17 pathogenic Leptospira spp., 8 intermediate/saprophytic strains and 21 different pathogenic microorganisms were also tested using the lipl32 assay, resulting in amplification exclusively for pathogenic leptospiral strains. The results also demonstrated high intra and inter-assay reproducibility (coefficient of variation 1.50 and 1.12, respectively), thereby qualifying the newly developed assay as a highly sensitive, specific and reliable diagnostic tool for leptospiral infection in dogs using urine specimens.(AU)

Short interfering RNAs targeting a vampire-bat related rabies virus phosphoprotein mRNA

The aim of this study was to assess the in vitro and in vivo effects of short-interfering RNAs (siRNAs) against rabies virus phosphoprotein (P) mRNA in a post-infection treatment for rabies as an extension of a previous report (Braz J Microbiol. 2013 Nov 15;44(3):879-82). To this end, rabies virus strain RABV-4005 (related to the Desmodus rotundus vampire bat) were used to inoculate BHK-21 cells and mice, and the transfection with each of the siRNAs was made with Lipofectamine-2000™. In vitro results showed that siRNA 360 was able to inhibit the replication of strain RABV-4005 with a 1 log decrease in virus titter and 5.16-fold reduction in P mRNA, 24 h post-inoculation when compared to non-treated cells. In vivo, siRNA 360 was able to induce partial protection, but with no significant difference when compared to non-treated mice. These results indicate that, despite the need for improvement for in vivo applications, P mRNA might be a target for an RNAi-based treatment for rabies.(AU)

Molecular stability of a vaccine strain of Canine coronavirus after serial passages in A72 cells / Estabilidade molecular de uma amostras vacinal de Coronavírus canino após passagens seriadas em células A72

Canine coronavirus (CCoV) exists in types I and II and infects dogs leading mainly to enteritis, though type II has already been associated with generalized and highly lethal infection. A CCoV-type II inactivated vaccine produced in A72 canine cells is available worldwide and largely used, though the molecular stability after serial passages of vaccine seeds is unknown. This article reports the evolution of the CCoV-II vaccine strain 1-71 in A72 cells based on partial S gene sequencing, showing the predominance of neutral evolution and the occurrence of four sites under purifying selection. Thus, cell-adapted strains of CCoV-II may be genetically stable after serial passages in a same cell line due to a stable virus-host relationship.(AU)

O Coronavírus canino (CCoV) ocorre como tipos I e II e infecta cães, levando principalmente a enterite, apesar do tipo II já ter sido associado à infecção generalizada e altamente letal. Uma vacina de CCoV-II inativada produzida em células caninas A72 é disponível mundialmente e largamente utilizada, apesar da sua estabilidade molecular após passagens seriadas de sementes vacinais ser desconhecida. Este artigo relata a evolução da amostra vacinal CCoC-II 1-71 em células A-72 com base em sequenciamento parcial do gene S, demonstrando predomínio de evolução neutra e a ocorrência de quaro sítios sob seleção purificante. Portanto, amostras de CCoV-II adaptadas a cultivos celulares podem ser estáveis geneticamente após passagens seriadas em uma mesma linhagem celular devido à existência de uma relação estável vírus-hospedeiro.(AU)

Molecular stability of a vaccine strain of Canine coronavirus after serial passages in A72 cells / Estabilidade molecular de uma amostras vacinal de Coronavírus canino após passagens seriadas em células A72

Canine coronavirus (CCoV) exists in types I and II and infects dogs leading mainly to enteritis, though type II has already been associated with generalized and highly lethal infection. A CCoV-type II inactivated vaccine produced in A72 canine cells is available worldwide and largely used, though the molecular stability after serial passages of vaccine seeds is unknown. This article reports the evolution of the CCoV-II vaccine strain 1-71 in A72 cells based on partial S gene sequencing, showing the predominance of neutral evolution and the occurrence of four sites under purifying selection. Thus, cell-adapted strains of CCoV-II may be genetically stable after serial passages in a same cell line due to a stable virus-host relationship.(AU)

O Coronavírus canino (CCoV) ocorre como tipos I e II e infecta cães, levando principalmente a enterite, apesar do tipo II já ter sido associado à infecção generalizada e altamente letal. Uma vacina de CCoV-II inativada produzida em células caninas A72 é disponível mundialmente e largamente utilizada, apesar da sua estabilidade molecular após passagens seriadas de sementes vacinais ser desconhecida. Este artigo relata a evolução da amostra vacinal CCoC-II 1-71 em células A-72 com base em sequenciamento parcial do gene S, demonstrando predomínio de evolução neutra e a ocorrência de quaro sítios sob seleção purificante. Portanto, amostras de CCoV-II adaptadas a cultivos celulares podem ser estáveis geneticamente após passagens seriadas em uma mesma linhagem celular devido à existência de uma relação estável vírus-hospedeiro.(AU)

Evidence of heterozygosity and recombinant alleles in single cysts of Giardia duodenalis / Evidência de heterozigose e alelos recombinantes em cistos individualizados de Giardia duodenalis

Giardia duodenalis is divided into eight assemblages (named A to H). Isolates of assemblage A are divided into four sub-assemblages (AI, AII, AIII and AIV). While isolates of sub-assemblage AII are almost exclusively detected in human hosts, isolates of assemblage B are encountered in a multitude of animal hosts and humans. Here, we isolated single cysts of G. duodenalis from a human stool sample and found that one of them had overlaps of assemblage AII and B alleles and an unexpectedly high number of variants of the beta-giardin (Bg) and GLORF-C4 (OrfC4) alleles. In addition, one of the Bg alleles of that cyst had a fragment of sub-assemblage AII interspersed with fragments of assemblage B, thus indicating that this allele may be a recombinant between sequences A and B. Our results are unprecedented and put a check on the statement that different assemblages of G. duodenalis represent species with different host specificities.(AU)

A espécie Giardia duodenalis é dividida em oito grupos (nomeados de A a H). Isolados do grupo A são divididos em quatro subgrupos (AI, AII, AIII and AIV). Enquanto isolados do subgrupo AII são detectados quase exclusivamente em hospedeiros humanos, isolados do subgrupo B são encontrados em uma grande variedade de hospedeiros entre animais e humanos. Neste trabalho, foi constatado que, dentre diversos cistos individualizados de G. duodenalis provenientes de fezes de origem humana, um cisto continha os alelos AII e B e um número inesperado de variantes de alelos codificadores de beta giardina e GLORF-C4. Ainda, um dos alelos beta giardina desse cisto possuía fragmentos AII intercalando um fragmento B, indicando que esse alelo pode ser um recombinante entre alelos AII e B. Os resultados aqui apresentados são inéditos e colocam em dúvida o conceito atual de que os diferentes grupos de G. duodenalis representam espécies distintas com diferentes graus de especificidade por hospedeiros.(AU)

Desenvolvimento e validação de testes sorológicos para o diagnóstico da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) utilizando antígenos recombinantes

A infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) é uma das mais importantes doenças infecciosas dos felinos domésticos. Os gatos infectados apresentam sinais clínicos inespecíficos, portanto para confirmar a infecção são necessários testes laboratoriais específicos. A detecção de anticorpos anti-FIV possui uma correlação direta com a infecção viral, pois uma vez infectado o gato permanece infectado permanentemente. No presente estudo, foram produzidos antígenos recombinantes do capsídeo viral (p24) e proteína de matriz (p17) do FIV. Os fragmentos codificantes da p24 e p17 foram amplificados a partir do DNA pró-viral extraído do sangue periférico de gatos naturalmente infectados pelo FIV (subtipo B), e clonados e expressos em fase com a cauda de histidina (6xHis) na porção amino ou carboxi-terminal. Os antígenos p24, p17, p24 fundido com o epítopo transmembrana (p24/TM) e peptídeo sintético TM do FIV foram utilizados na padronização e aplicação dos testes de ELISA indireto rápido e Western blot para detecção de anticorpos anti-FIV. A reatividade dos antígenos foi analisada separadamente no ELISA indireto rápido, e permitiu a comparação dos antígenos quanto aos valores de sensibilidade e especificidade relativa. O antígeno FIVp24/TM apresentou melhor desempenho, com concordância de 100% com o teste SNAP® FIV/FeLV Combo test (n=110). A validação do ELISA indireto rápido com o antígeno FIVp24/TM mostrou características desejáveis para o uso comercial, tais como alta precisão e manutenção da reatividade durante o armazenamento. Pode-se concluir que a produção de antígenos recombinantes do FIV foi eficiente e possibilitou o desenvolvimento de um teste rápido (ELISA indireto rápido) e um teste confirmatório (Western blot) para o diagnóstico da infecção pelo FIV

Infection with feline immunodeficiency virus (FIV) is one of the most important infectious diseases of domestic cats. Infected cats exhibit non-specific clinical signs, so specific laboratory assays are necessary to confirm the diagnosis of FIV infection. Detection of anti-FIV antibodies has a direct correlation with the viral infection, because once a cat has been infected it will remain infected permanently. In the present study, we produced FIV recombinant capsid antigen (p24) and matrix protein (p17). The coding fragments of p24 and p17 were obtained from proviral DNA extracted from peripheral blood of cats naturally infected with FIV (subtype B). These fragments were cloned and expressed in phase with amino or carboxi-terminal histidine tag (6xHis). The antigens FIVp24, FIVp17, p24 fused to transmembrane epitope (FIVp24/TM) and synthetic peptide TM were used for standardization and implementation of rapid indirect ELISA and Western blot assays for detection of anti-FIV antibodies. The reactivity of the antigens was analyzed separately in rapid indirect ELISA and allowed the determination of relative sensitivity and specificity of the antigens. The FIVp24/TM antigen has better performance, with 100% of agreement with SNAP® FIV/FeLV Combo test (IDEXX laboratories). The validation of the FIVp24/TM rapid indirect ELISA showed desirable characteristics for commercial use, such as high precision and maintenance of reactivity during storage. In conclusion, production of FIV recombinant antigens was efficient and allowed the development of a rapid test (rapid indirect ELISA) and a confirmatory test (Western blot) for diagnosis of FIV infection

Clonage e expressão da proteína de capsídeoepítopo transmembrana do vírus da imunodeficiência felina para utilização no diagnóstico sorológico

A infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) é uma das mais importantes doenças infecciosas dos gatos. Os gatos infectados apresentam uma variedade de sinais clínicos inespecíficos e para confirmar a infecção são necessários testes laboratoriais específicos. A detecção de anticorpos anti-FIV circulantes possui uma correlação direta com a infecção viral, pois uma vez infectado o gato permanece infectado permanentemente. No presente estudo, foi desenvolvido um método para produzir um antígeno recombinante com a fusão da proteína de capsídeo viral (p24) e o epítopo transmembrana (TM). O fragmento completo que codifica a p24 fundido com a sequência do epítopo TM foi obtido a partir do DNA pró-viral extraído do sangue periférico de um gato naturalmente infectado pelo FIV (subtipo B), confirmado pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Esse fragmento foi clonado e expresso em fase com a cauda de histidina (6xHis) na porção amino terminal. Foram utilizadas diferentes concentrações de isopropil1 ?-tiogalactopiranisídeo (IPTG) e tempos de incubação para induzir a expressão da proteína recombinante. Após análise por SDS-PAGE observou-se que a concentração final de 0,1 mol/L de IPTG e 3 horas de incubação induziram maior produção da proteína recombinante (29 kDa) e, que a proteína viral recombinante se encontrava na fração insolúvel. Essa fração foi purificada e usada como antígeno no ELISA indireto. Cinquenta amostras de soros e/ou plasma de gatos FIV positivos e negativos foram testados, e todos foram concordantes com a PCR ou o teste SNAP® FIV/FeLV Combo (IDEXX laboratories). Esses resultados mostram que o método utilizado para produzir a proteína recombinante do FIV foi eficiente e que é possível o seu uso para o diagnóstico da infecção pelo FIV

Feline immunodeficiency virus (FIV) infection is one of the most important infectious diseases of cats. Infected cats exhibit a variety of non-specific clinical sign, so specific laboratory assay is necessary to confirm the diagnosis of FIV infection. Detection of anti-FIV circulate antibody has a direct correlation with the viral infection, because once a cat has been infected it will remain infected permanently. In this study, we developed a method to produce a recombinant fusion antigen with viral capsid protein (p24) and transmembrane (TM) epitope. Entire fragment that codify p24 fused with TM epitope sequence was obtained from pro-viral DNA extracted of peripheral blood of naturally FIV infected cat (subtype B), confirmed by polymerase chain reaction (PCR). This fragment was cloned and expressed in frame with a 6xHis N? terminal tag. Different final concentration of isopropyl ?-D thiogalactoside (IPTG) and incubation time was used to induce the expression of the recombinant protein. SDS-PAGE analysis demonstrated that IPTG final concentration of 0,1 mol/L and 3 hours after induction showed higher concentration of recombinant protein (29 kDa) and viral recombinant protein was located in the insoluble fraction. This fraction was purified and used as antigen in indirect ELISA. Fifty serums of FIV positive and negative cats were tested and all were concordant with PCR or SNAP® FIV/FeLV Combo test (IDEXX laboratories). These results demonstrate that the method used to produce the recombinant fused FIV protein was efficient and it is possible to use it for diagnostic of FIV infection