Anti-Ehrlichia properties of the dichloromethane fraction of Ageratum conyzoides associated with doxycycline: In vitro study / Propriedades anti-Ehrlichia da fração diclorometânica de Ageratum conyzoides associada com doxiciclina: estudo in vitro

ABSTRACT: The increasing number of cases of canine ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis in hospitals and veterinary clinics has demonstrated the need for a new drug protocol for this disease. Doxycycline is used to treat ehrlichiosis, but the resistance of the microorganism to this treatment protocol, as well as the various side effects to the animals, has become a concern. Several studies have shown a positive interaction with extracts of plants and drugs, which allow for the reduction of the concentration necessary to produce the desired effect, minimizing adverse effects. This study determined the efficiency of the combination of the dichloromethane (DCM) fraction of Ageratum conyzoides L. with anti-Ehrlichia activity and doxycycline by using the checkerboard assay. Plant material was collected in São Luís, northeastern Brazil, followed by extraction in MeOH: H2O (8:2) and partitioning of the DCM fraction. After determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the fraction under study against DH82 cells infected with Ehrlichia canis, it was combined with doxycycline to derive the Fractional Inhibitory Concentration Index (CIF Index). A reduction of 5.83 times the doxycycline minimum inhibitory concentration was observed, showing that this fraction of A. conyzoides composed predominantly by the class of lignans, identified by mass spectrometry notably intensified the activity of doxycycline against E. canis, resulting in a synergistic effect.

RESUMO: O crescente número de casos de erliquiose canina por Ehrlichia canis em hospitais e clínicas veterinárias tem demonstrado a necessidade de um novo protocolo de medicamentos para essa doença. A doxiciclina é usada para tratar a erliquiose, mas a resistência do microrganismo a esse protocolo de tratamento, bem como os diversos efeitos colaterais para os animais, tornou-se uma preocupação. Vários estudos têm demonstrado interação positiva com extratos de plantas e fármacos, que permitem a redução da concentração necessária para produzir o efeito desejado, minimizando os efeitos adversos. Este estudo determinou a eficiência da combinação da fração diclorometânica (DCM) de Ageratum conyzoides L. com atividade anti-Ehrlichia canis associada com doxiciclina por meio do ensaio de Checkerboard. O material vegetal foi coletado em São Luís, Maranhão, nordeste do Brasil, seguido pela extração em MeOH:H2O (8:2) e partição da fração diclorometânica. Após a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da fração em estudo frente às células DH82 infectadas com Ehrlichia canis, a mesma foi combinada com a doxiciclina para derivação do Índice de Concentração Inibitória da Fração (Índice CIF). Observou-se uma redução de 5,83 vezes a concentração inibitória mínima da doxiciclina mostrando que esta fração de A. conyzoides, composta predominantemente por lignanas identificadas por espectrometria de massas, notavelmente intensificou a atividade desse fármaco contra E. canis, resultando em um efeito sinérgico.

Anti-Ehrlichia properties of the dichloromethane fraction of Ageratum conyzoides associated with doxycycline: In vitro study / Propriedades anti-Ehrlichia da fração diclorometânica de Ageratum conyzoides associada com doxiciclina: estudo in vitro

The increasing number of cases of canine ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis in hospitals and veterinary clinics has demonstrated the need for a new drug protocol for this disease. Doxycycline is used to treat ehrlichiosis, but the resistance of the microorganism to this treatment protocol, as well as the various side effects to the animals, has become a concern. Several studies have shown a positive interaction with extracts of plants and drugs, which allow for the reduction of the concentration necessary to produce the desired effect, minimizing adverse effects. This study determined the efficiency of the combination of the dichloromethane (DCM) fraction of Ageratum conyzoides L. with anti-Ehrlichia activity and doxycycline by using the checkerboard assay. Plant material was collected in São Luís, northeastern Brazil, followed by extraction in MeOH: H2O (8:2) and partitioning of the DCM fraction. After determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the fraction under study against DH82 cells infected with Ehrlichia canis, it was combined with doxycycline to derive the Fractional Inhibitory Concentration Index (CIF Index). A reduction of 5.83 times the doxycycline minimum inhibitory concentration was observed, showing that this fraction of A. conyzoides composed predominantly by the class of lignans, identified by mass spectrometry notably intensified the activity of doxycycline against E. canis, resulting in a synergistic effect.

O crescente número de casos de erliquiose canina por Ehrlichia canis em hospitais e clínicas veterinárias tem demonstrado a necessidade de um novo protocolo de medicamentos para essa doença. A doxiciclina é usada para tratar a erliquiose, mas a resistência do microrganismo a esse protocolo de tratamento, bem como os diversos efeitos colaterais para os animais, tornou-se uma preocupação. Vários estudos têm demonstrado interação positiva com extratos de plantas e fármacos, que permitem a redução da concentração necessária para produzir o efeito desejado, minimizando os efeitos adversos. Este estudo determinou a eficiência da combinação da fração diclorometânica (DCM) de Ageratum conyzoides L. com atividade anti-Ehrlichia canis associada com doxiciclina por meio do ensaio de Checkerboard. O material vegetal foi coletado em São Luís, Maranhão, nordeste do Brasil, seguido pela extração em MeOH:H2O (8:2) e partição da fração diclorometânica. Após a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da fração em estudo frente às células DH82 infectadas com Ehrlichia canis, a mesma foi combinada com a doxiciclina para derivação do Índice de Concentração Inibitória da Fração (Índice CIF). Observou-se uma redução de 5,83 vezes a concentração inibitória mínima da doxiciclina mostrando que esta fração de A. conyzoides, composta predominantemente por lignanas identificadas por espectrometria de massas, notavelmente intensificou a atividade desse fármaco contra E. canis, resultando em um efeito sinérgico.

Anti-Ehrlichia properties of the dichloromethane fraction of Ageratum conyzoides associated with doxycycline: In vitro study / Propriedades anti-Ehrlichia da fração diclorometânica de Ageratum conyzoides associada com doxiciclina: estudo in vitro

The increasing number of cases of canine ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis in hospitals and veterinary clinics has demonstrated the need for a new drug protocol for this disease. Doxycycline is used to treat ehrlichiosis, but the resistance of the microorganism to this treatment protocol, as well as the various side effects to the animals, has become a concern. Several studies have shown a positive interaction with extracts of plants and drugs, which allow for the reduction of the concentration necessary to produce the desired effect, minimizing adverse effects. This study determined the efficiency of the combination of the dichloromethane (DCM) fraction of Ageratum conyzoides L. with anti-Ehrlichia activity and doxycycline by using the checkerboard assay. Plant material was collected in São Luís, northeastern Brazil, followed by extraction in MeOH: H2O (8:2) and partitioning of the DCM fraction. After determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the fraction under study against DH82 cells infected with Ehrlichia canis, it was combined with doxycycline to derive the Fractional Inhibitory Concentration Index (CIF Index). A reduction of 5.83 times the doxycycline minimum inhibitory concentration was observed, showing that this fraction of A. conyzoides composed predominantly by the class of lignans, identified by mass spectrometry notably intensified the activity of doxycycline against E. canis, resulting in a synergistic effect.(AU)

O crescente número de casos de erliquiose canina por Ehrlichia canis em hospitais e clínicas veterinárias tem demonstrado a necessidade de um novo protocolo de medicamentos para essa doença. A doxiciclina é usada para tratar a erliquiose, mas a resistência do microrganismo a esse protocolo de tratamento, bem como os diversos efeitos colaterais para os animais, tornou-se uma preocupação. Vários estudos têm demonstrado interação positiva com extratos de plantas e fármacos, que permitem a redução da concentração necessária para produzir o efeito desejado, minimizando os efeitos adversos. Este estudo determinou a eficiência da combinação da fração diclorometânica (DCM) de Ageratum conyzoides L. com atividade anti-Ehrlichia canis associada com doxiciclina por meio do ensaio de Checkerboard. O material vegetal foi coletado em São Luís, Maranhão, nordeste do Brasil, seguido pela extração em MeOH:H2O (8:2) e partição da fração diclorometânica. Após a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da fração em estudo frente às células DH82 infectadas com Ehrlichia canis, a mesma foi combinada com a doxiciclina para derivação do Índice de Concentração Inibitória da Fração (Índice CIF). Observou-se uma redução de 5,83 vezes a concentração inibitória mínima da doxiciclina mostrando que esta fração de A. conyzoides, composta predominantemente por lignanas identificadas por espectrometria de massas, notavelmente intensificou a atividade desse fármaco contra E. canis, resultando em um efeito sinérgico.(AU)

Fungicidal activity and constituents of Ageratum conyzoides essential oil from three regions in São Paulo state, Brazil / Atividade fungicida e constituintes químicos do óleo essencial de Ageratum conyzoides de três regiões do estado de São Paulo, Brasil

The chemical composition and antifungal activity of the Ageratum conyzoides essential oils, obtained from the leaves collected in Ibiúna (1), Ribeirão Pires (2) and Campinas (3) in the São Paulo state, Brazil, were investigated. The essential oils were obtained from A. conyzoides leaves by hydrodestilation and analyzed by GC/MS. The chemical composition of the A. conyzoides oil collected in Ribeirão Pires and Ibiúna consisted mainly of precocene I and II. The essential oil from leaves collected in Campinas had only traces of precocene II and a highest proportion of precocene I, α-humulene and (E)-caryophyllene than the oils (1) and (2). The Aspergillus flavus growth was inhibited by essential oils (1) and (2) at 60 and 64%, respectively, and the oil (3) was inactive. On the other hand, the three essential oils inhibited the sporulation of the fungus for more than 120 days. The essential oils of leaves collected in sites that show similarities in the latitude, altitude and average temperatures, as Ribeirão Pires and Ibiúna, showed chemical composition and antifungal activity similar, either, which showed the importance of geo-ecological factors in production of metabolites of the plant.(AU)

A composição química e a atividade antifúngica do óleo essencial de folhas de Ageratum conyzoides, coletadas em Ibiúna (1), Ribeirão Pires (2) e Campinas (3) no estado de São Paulo, foram investigadas. Os óleos essenciais foram obtidos a partir de folhas de A. conyzoides por hidrodestilação e analisados ​​por CG/EM. A composição química do óleo essencial de A. conyzoides coletadas em Ribeirão Pires e Ibiúna consiste principalmente de precoceno I e II. O óleo essencial das folhas coletadas em Campinas possui apenas traços de precoceno II e uma maior proporção de precoceno I, α-humuleno e (E)-cariofileno quando comparado com os óleos (1) e (2). O crescimento de Aspergillus flavus foi inibido pelos óleos essenciais (1) e (2) em 60 e 64%, respectivamente, enquanto que o óleo (3) foi inativo. Por outro lado, os três óleos essenciais inibiram a esporulação do fungo por mais de 120 dias. Os óleos essenciais de folhas coletadas em locais que mostram semelhanças na latitude, altitude e temperatura média, como Ribeirão Pires e Ibiúna, mostraram composição química e atividade antifúngica semelhante. Isso mostrou a importância dos fatores geo-ecológicos na produção de metabólitos da planta.(AU)

Fungicidal activity and constituents of Ageratum conyzoides essential oil from three regions in São Paulo state, Brazil / Atividade fungicida e constituintes químicos do óleo essencial de Ageratum conyzoides de três regiões do estado de São Paulo, Brasil

The chemical composition and antifungal activity of the Ageratum conyzoides essential oils, obtained from the leaves collected in Ibiúna (1), Ribeirão Pires (2) and Campinas (3) in the São Paulo state, Brazil, were investigated. The essential oils were obtained from A. conyzoides leaves by hydrodestilation and analyzed by GC/MS. The chemical composition of the A. conyzoides oil collected in Ribeirão Pires and Ibiúna consisted mainly of precocene I and II. The essential oil from leaves collected in Campinas had only traces of precocene II and a highest proportion of precocene I, -humulene and (E)-caryophyllene than the oils (1) and (2). The Aspergillus flavus growth was inhibited by essential oils (1) and (2) at 60 and 64%, respectively, and the oil (3) was inactive. On the other hand, the three essential oils inhibited the sporulation of the fungus for more than 120 days. The essential oils of leaves collected in sites that show similarities in the latitude, altitude and average temperatures, as Ribeirão Pires and Ibiúna, showed chemical composition and antifungal activity similar, either, which showed the importance of geo-ecological factors in production of metabolites of the plant.

A composição química e a atividade antifúngica do óleo essencial de folhas de Ageratum conyzoides, coletadas em Ibiúna (1), Ribeirão Pires (2) e Campinas (3) no estado de São Paulo, foram investigadas. Os óleos essenciais foram obtidos a partir de folhas de A. conyzoides por hidrodestilação e analisados por CG/EM. A composição química do óleo essencial de A. conyzoides coletadas em Ribeirão Pires e Ibiúna consiste principalmente de precoceno I e II. O óleo essencial das folhas coletadas em Campinas possui apenas traços de precoceno II e uma maior proporção de precoceno I, -humuleno e (E)-cariofileno quando comparado com os óleos (1) e (2). O crescimento de Aspergillus flavus foi inibido pelos óleos essenciais (1) e (2) em 60 e 64%, respectivamente, enquanto que o óleo (3) foi inativo. Por outro lado, os três óleos essenciais inibiram a esporulação do fungo por mais de 120 dias. Os óleos essenciais de folhas coletadas em locais que mostram semelhanças na latitude, altitude e temperatura média, como Ribeirão Pires e Ibiúna, mostraram composição química e atividade antifúngica semelhante. Isso mostrou a importância dos fatores geo-ecológicos na produ- ção de metabólitos da planta.

Fungicidal activity and constituents of Ageratum conyzoides essential oil from three regions in São Paulo state, Brazil / Atividade fungicida e constituintes químicos do óleo essencial de Ageratum conyzoides de três regiões do estado de São Paulo, Brasil

The chemical composition and antifungal activity of the Ageratum conyzoides essential oils, obtained from the leaves collected in Ibiúna (1), Ribeirão Pires (2) and Campinas (3) in the São Paulo state, Brazil, were investigated. The essential oils were obtained from A. conyzoides leaves by hydrodestilation and analyzed by GC/MS. The chemical composition of the A. conyzoides oil collected in Ribeirão Pires and Ibiúna consisted mainly of precocene I and II. The essential oil from leaves collected in Campinas had only traces of precocene II and a highest proportion of precocene I, -humulene and (E)-caryophyllene than the oils (1) and (2). The Aspergillus flavus growth was inhibited by essential oils (1) and (2) at 60 and 64%, respectively, and the oil (3) was inactive. On the other hand, the three essential oils inhibited the sporulation of the fungus for more than 120 days. The essential oils of leaves collected in sites that show similarities in the latitude, altitude and average temperatures, as Ribeirão Pires and Ibiúna, showed chemical composition and antifungal activity similar, either, which showed the importance of geo-ecological factors in production of metabolites of the plant.(AU)

A composição química e a atividade antifúngica do óleo essencial de folhas de Ageratum conyzoides, coletadas em Ibiúna (1), Ribeirão Pires (2) e Campinas (3) no estado de São Paulo, foram investigadas. Os óleos essenciais foram obtidos a partir de folhas de A. conyzoides por hidrodestilação e analisados por CG/EM. A composição química do óleo essencial de A. conyzoides coletadas em Ribeirão Pires e Ibiúna consiste principalmente de precoceno I e II. O óleo essencial das folhas coletadas em Campinas possui apenas traços de precoceno II e uma maior proporção de precoceno I, -humuleno e (E)-cariofileno quando comparado com os óleos (1) e (2). O crescimento de Aspergillus flavus foi inibido pelos óleos essenciais (1) e (2) em 60 e 64%, respectivamente, enquanto que o óleo (3) foi inativo. Por outro lado, os três óleos essenciais inibiram a esporulação do fungo por mais de 120 dias. Os óleos essenciais de folhas coletadas em locais que mostram semelhanças na latitude, altitude e temperatura média, como Ribeirão Pires e Ibiúna, mostraram composição química e atividade antifúngica semelhante. Isso mostrou a importância dos fatores geo-ecológicos na produ- ção de metabólitos da planta.(AU)

Composição química e toxicidade de óleos essenciais para o pulgão-verde Schizaphis graminum (Rondani, 1852) / Chemical composition and toxicity of essential oils to the green-aphid Schizaphis graminum (Rondani, 1852)

Este trabalho teve como objetivo identificar e quantificar os constituintes dos óleos essenciais de Illicum verum, Ageratum conyzoides, Piper hispidinervum e Ocotea odorifera, bem como avaliar a toxicidade para o pulgão-verde Schizaphis graminum. A qualificação dos constituintes foi realizada por meio de um cromatógrafo gasoso + espectrômetro de massas, e a quantificação, por um cromatógrafo gasoso + detector de ionização de chama, ambos com uma coluna DB5. O método de hidrodestilação promoveu um rendimento (p/p) de 3,81% para I. verum, 0,46% para A. conyzoides, 2,85% para P. hispidinervum e 0,68% para O. odorífera. Já os componentes majoritários foram: precoceno (87,0%) e (E)-cariofileno (7,1%) para A. conyzoides; (E)-anetol (90,4%), limoneno (2,6%) e metil-chavicol (1,3%) para I. verum; metil-eugenol (81,2%) e safrol (10,6%) para Ocotea odorífera; e safrol (82,5%) e α-terpinoleno (13,4%) para P. hispidinervum. Pelos testes de toxicidade aguda (24 horas) com folhas de sorgo ou papel-filtro contaminados, verificou-se que o óleo de A. conyzoides foi o mais tóxico para o pulgão, com CL50 de 7,13 e 7,08 µL óleo/cm2 respectivamente, seguido por O. odorifera com CL50 de 11,80 e 103,00 µL óleo/cm2 respectivamente; I. verum de 51,80 µL óleo/cm2 em ambos os substratos; e o menos tóxico foi o óleo essencial de P. hispidinervum, com CL50 de 62,50 e 143,00 µL óleo/cm2, respectivamente. Dessa maneira, sugere-se que o uso dos óleos essenciais pode representar uma nova ferramenta em programas de manejo integrado de pragas.(AU)

The aim of this study was to assess the chemical composition of essential oils of Illicum verum, Ageratum conyzoides, Piper hispidinervum and Ocotea odorífera, as well as their toxicity to the green-aphid Schizaphis graminum. Compound identification was carried out with gas chromatography + mass spectrometry, and quantification with gas chromatography + flame ionization detector, both with DB5 column. The hydrodistillation process promoted oil yield of 3.81% for I. verum; 0.46% for A. conyzoides; 2.85 % for P. hispidinervum; and 0.68 % for O. odorífera. The major components from the oils of A. conyzoides was precocene (87.0%) and (E)-caryophyllene (7.1%); (E)-anethol (90.4%), limonene (2.6%) and methyl-chavicol (1.3%) for I. verum; methyleugenol (81.2%) and safrole (10.6%) for O. odorifera; and safrole (82.5%) and α-terpinolene (13.4%) for P. hispidinervum. The acute toxicity test (24 hours) performed by contact in sorghum leaves or contaminated filter-paper showed that the higher toxicity occur with essential oils of A. conyzoides, with LC50 of 7.01 and 7.01 µg oil/cm2, respectively; followed by O. odorifera, with LC50 of 17.10 and 66.70 µg oil/cm2, respectively; I. verum, with LC50of 66.40 and 65.40 µg oil/cm2, respectively; and low toxicity was observed for the P. hispidinervum essential oil, with LC50 of 64.00 and 143.00 oil/cm2, respectively. With the results obtained in this research, we can state that the use of these essential oils can be a new tool in integrated pest management.(AU)

Composição química e toxicidade de óleos essenciais para o pulgão-verde Schizaphis graminum (Rondani, 1852) / Chemical composition and toxicity of essential oils to the green-aphid Schizaphis graminum (Rondani, 1852)

Este trabalho teve como objetivo identificar e quantificar os constituintes dos óleos essenciais de Illicum verum, Ageratum conyzoides, Piper hispidinervum e Ocotea odorifera, bem como avaliar a toxicidade para o pulgão-verde Schizaphis graminum. A qualificação dos constituintes foi realizada por meio de um cromatógrafo gasoso + espectrômetro de massas, e a quantificação, por um cromatógrafo gasoso + detector de ionização de chama, ambos com uma coluna DB5. O método de hidrodestilação promoveu um rendimento (p/p) de 3,81% para I. verum, 0,46% para A. conyzoides, 2,85% para P. hispidinervum e 0,68% para O. odorífera. Já os componentes majoritários foram: precoceno (87,0%) e (E)-cariofileno (7,1%) para A. conyzoides; (E)-anetol (90,4%), limoneno (2,6%) e metil-chavicol (1,3%) para I. verum; metil-eugenol (81,2%) e safrol (10,6%) para Ocotea odorífera; e safrol (82,5%) e α-terpinoleno (13,4%) para P. hispidinervum. Pelos testes de toxicidade aguda (24 horas) com folhas de sorgo ou papel-filtro contaminados, verificou-se que o óleo de A. conyzoides foi o mais tóxico para o pulgão, com CL50 de 7,13 e 7,08 µL óleo/cm2 respectivamente, seguido por O. odorifera com CL50 de 11,80 e 103,00 µL óleo/cm2 respectivamente; I. verum de 51,80 µL óleo/cm2 em ambos os substratos; e o menos tóxico foi o óleo essencial de P. hispidinervum, com CL50 de 62,50 e 143,00 µL óleo/cm2, respectivamente. Dessa maneira, sugere-se que o uso dos óleos essenciais pode representar uma nova ferramenta em programas de manejo integrado de pragas.(AU)

The aim of this study was to assess the chemical composition of essential oils of Illicum verum, Ageratum conyzoides, Piper hispidinervum and Ocotea odorífera, as well as their toxicity to the green-aphid Schizaphis graminum. Compound identification was carried out with gas chromatography + mass spectrometry, and quantification with gas chromatography + flame ionization detector, both with DB5 column. The hydrodistillation process promoted oil yield of 3.81% for I. verum; 0.46% for A. conyzoides; 2.85 % for P. hispidinervum; and 0.68 % for O. odorífera. The major components from the oils of A. conyzoides was precocene (87.0%) and (E)-caryophyllene (7.1%); (E)-anethol (90.4%), limonene (2.6%) and methyl-chavicol (1.3%) for I. verum; methyleugenol (81.2%) and safrole (10.6%) for O. odorifera; and safrole (82.5%) and α-terpinolene (13.4%) for P. hispidinervum. The acute toxicity test (24 hours) performed by contact in sorghum leaves or contaminated filter-paper showed that the higher toxicity occur with essential oils of A. conyzoides, with LC50 of 7.01 and 7.01 µg oil/cm2, respectively; followed by O. odorifera, with LC50 of 17.10 and 66.70 µg oil/cm2, respectively; I. verum, with LC50of 66.40 and 65.40 µg oil/cm2, respectively; and low toxicity was observed for the P. hispidinervum essential oil, with LC50 of 64.00 and 143.00 oil/cm2, respectively. With the results obtained in this research, we can state that the use of these essential oils can be a new tool in integrated pest management.(AU)