Resumo
As enfermidades transmitidas por artrópodes vêm sendo recentemente estudadas em animais selvagens brasileiros, os quais podem atuar como hospedeiros tanto para os vetores quanto para os patógenos, muitos dos quais apresentam potencial zoonótico. O presente estudo tem como objetivo investigar a ocorrência de agentes transmitidos por artrópodes (agentes Anaplasmataceae, Bartonella spp., mycoplasmas hemotróficos, Rickettsia spp., Hepatozoon spp. e piroplasmideos) em animais selvagens, cães domésticos e seus respectivos ectoparasitos, amostrados na região do Pantanal sul matogrossense, por meio de métodos sorológicos e moleculares. Para tal, 31 Nasua nasua, 78 Cerdocyon thous, sete L. pardalis, 42 cães, 110 roedores e 30 marsupiais foram capturados. Os carrapatos recolhidos (1582) dos animais pertenciam às espécies Amblyomma sculptum, Amblyomma parvum, Amblyomma ovale, Amblyomma tigrinum, Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus sanguineus sensu lato e Amblyomma auricularium. Adicionalmente, 80 pulgas Polygenis (Polygenis) bohlsi bohlsi foram recolhidas. Quatorze (17,9%) C. thous, sete (16,6%) cães e um (3,2%) N. nasua mostraram-se soropositivos (títulos80) para Ehrlichia canis, com títulos de anticorpos variando de 80 a 1280. Nenhum animal mostrou-se soropositivo Anaplasma phagocytophilum. Nove cães, dois C. thous, um N. nasua, oito roedores, cinco marsupiais e um pool de pulgas P. (P.) b. bohlsi mostram-se positivos para Ehrlichia spp. Todos os cães e o pool de pulgas P. (P.) b. bohlsi positivos para Ehrlichia spp. foram também positivos em para o ensaio em tempo real quantitativo (qPCR) para E. canis, baseado no gene dsb. Sete N. nasua, dois C. thous, um L. pardalis, quatro roedores, três marsupiais, 15 carrapatos A. sculptum, dois A. ovale, dois A. parvum e um pool de larvas de Amblyomma spp. foram positivos para Anaplasma spp. Co-positividade ou co-soropositividade para Ehrlichia spp. e Anaplasma spp. foi observada em dois cães, um N. nasua, um C. thous e dois marsupiais. Trinta e cinco roedores selvagens e três pools de pulgas P. (P.) b. bohlsi, mostraram-se positivos nos ensaios moleculares para Bartonella spp. A análise filogética revelou que pelo menos dois genótipos diferentes estão circulando entre os roedores amostrados no bioma Pantanal. Os resultados parciais sugerem que a pulga P. (P.) b. bohlsi possa estar atuando como um possível vetor de Bartonella nesta região. Vinte e quatro N. nasua, três C. thous, dois cães e um roedor mostraram-se positivos para Mycoplasma spp. A análise filogenética apontou que os cães, C. thous e N. nasua aparentam estar sendo parasitados pela mesma espécie de Mycoplasma spp., filogenéticamente relacionada a M. haemocanis/M. haemofelis e que provavelmente um novo genótipo de Mycoplasma spp. está circulando entre os N. nasua e C. thous amostrados no bioma Pantanal. Vinte e sete (64,2%) cães, 59 (7,6%) C. thous e seis (85,7%) L. pardalis mostraram-se soropositivas para pelo menos uma espécie de Rickettsia. Para 17 (40,4%) cães, 33 (42,3%) C. thous e dois (33,3%) L. pardalis, foram observadas reações homólogas para Rickettsia amblyommatis. Cento e dezesseis carrapatos (93 A. parvum, 14 A. sculptum, três A. auricularim e seis pools de larvas de Amblyomma) e uma amostra de sangue obtida de C. thous, mostraram-se postivas nos ensaios para as espécies de Rickettsia do grupo da febre maculosa. As amostras seqüenciadas obtidas dos carrapatos A. parvum, mostraram-se filogenéticamente relacionadas com 'Candidatus Rickettsia andeanae'. Uma alta ocorrência de Hepatozoon foi encontrada nos carnívoros amostrados (C. thous [91,02%], cães [45,23%], N. nasua [41,9%] e L. pardalis [71,4%]), porém nenhum artrópode mostrou-se positivo. Adicionalmente, 24 roedores e um marsupial também mostraram-se positivos para Hepatozoon spp. Com base na análise filogenética, os C. thous, L. pardalis, N. nasua, cães, roedores e marsupiais aparentam não estar sendo parasitados pela mesma espécie de Hepatozoon spp. Sete cães, um C. thous, cinco L. pardalis, três N. nasua, seis roedores, oito carrapatos A. parvum, dois A. sculptum e um A. ovale mostraram-se positivos para os ensaios PCR de piroplasmídeos. Genótipos filogeneticamente relacionados com Babesia canis vogeli foram detectados em seis cães e cinco roedores. Genótipos filogeneticamente relacionados com Babesia caballi foram detectados em um C. thous, um cão, um carrapato A. ovale e um A. sculptum e genótipos relacionados com Babesia bigemina e Babesia bovis foram detectados em quatro carrapatos A. parvum. Quatro sequências obtidas de A. parvum, três N. nasua e um roedor mostraram-se filogeneticamente relacionadas com Theileria equi. Por fim, Cytauxzoon spp. foi detectado em quatro L. pardalis .O presente trabalho mostra, portanto, a ocorrência de agentes transmitidos por artrópodes vetores em animais selvagens e domésticos no Panatanal sul matogrossense.
The diseases transmitted by arthropods have been recently studied in Brazilian wildlife, which can act as hosts for vectors and pathogens, many of which have zoonotic potential. The present work aimed to investigate the occurrence of tick-borne agents (Anaplasmataceae agents, Bartonella spp., hemotropic mycoplasmas, Rickettsia spp., Hepatozoon spp. and piroplasms) in wild animals, domestic dogs and their respective ectoparasites, in southern Pantanal region, central-western Brazil, by serological and molecular assays. For this reason, 31 Nasua nasua, 78 Cerdocyon thous, seven L. pardalis, 42 dogs, 110 rodents and 30 marsupials were captured. The ticks collected (1582) from animals belonged to the species Amblyomma sculptum, Amblyomma parvum, Amblyomma ovale, Amblyomma tigrinum, Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus sanguineus sensu lato and Amblyomma auricularium. Additionally, 80 Polygenis (Polygenis) bohlsi bohlsi fleas were collected. Overall, 14 (17.9%) C. thous, seven (16.6%) dogs and one (3.2%) N. nasua were seroreactive (titer80) to Ehrlichia canis, with titers ranging from 80 to 1280. No animal showed to be seroreactive for A. phagocytophilum antigen. Nine dogs, two C. thous, one N. nasua, eight rodents, five marsupials and one P. (P.) b. bohlsi pool were positive for Ehrlichia spp. All positive dogs and the only P. (P.) b. bohlsi pool positive for Ehrlichia spp. were also positive in specific E. canis-qPCR based on dsb gene. Seven N. nasua, two dogs, one C. thous, one L. pardalis, four rodents, three marsupials, 15 A. sculptum, two A. ovale, two A. parvum and one Amblyomma larvae pool were positive for Anaplasma spp. Co-positivity or co-seropositivity for Ehrlichia spp. and Anaplasma spp. was observed in two dogs, one N. nasua, one C. thous and two marsupials. Thirty-five rodents and three P. (P.) b. bohlsi flea pools, showed to be positive to Bartonella spp. in the molecular assays. The phylogenetic analysis revealed that at least two different genotypes are circulating among the rodents sampled in the Pantanal biome. Partial results suggest that the flea P. (P.) b. bohlsi may be acting as a possible Bartonella vector in this region. Twenty-four N. nasua, three C. thous, two dogs and one rodent, were positive for Mycoplasma spp. Phylogenetic analysis indicated that dogs, C. thous and N. nasua appear to share the same Mycoplasma spp. species, closely related to M. haemocanis / M. haemofelis and probably a new genotype of Mycoplasma spp. is circulating among the N. nasua and C. thous sampled in the Pantanal biome. Overall, 27 (64.2%) dogs, 59 (75.6%) C. thous and six (85.7%) L. pardalis were seroreactive to at least one Rickettsia species. For 17 (40.4%) dogs, 33 (42.3%) C. thous, and two (33.3%) L. pardalis, homologous reactions to Rickettsia amblyommatis were suggested. One hundred and sixteen ticks (93 A. parvum, 14 A. sculptum, three A. auricularim and six Amblyomma larvae pools) and one blood sample obtained from C. thous showed positive results for Rickettsia spotted fever group species. The sequenced samples obtained from A. parvum ticks showed to be closely related to 'Candidatus Rickettsia andeanae'. A high occurrence of Hepatozoon was found in carnivores (C. thous [91.02%], dogs [45.23%], N. nasua [41.9%] and L. pardalis [71.4%]), however no arthropod showed positive results. Additionally, twenty-four rodents and a marsupial also showed positivity to Hepatozoon spp. Based on phylogenetic analysis, C. thous, L. pardalis, N . nasua, dogs, rodents and marsupials appear not to share the same of Hepatozoon species. Seven dogs, one C. thous, five L. pardalis, three N. nasua, six rodents, eight A. parvum, two A. sculptum and one A. ovale were positive for piroplasmids-PCR assays. Genotypes closely related to Babesia vogeli were detected in six dogs and five rodents. While genotypes closely related to Babesia caballi were detected in one C. thous, one dog, one A. ovale and one A. sculptum, genotypes closely related to Babesia bigemina and Babesia bovis were detected in four A. parvum ticks. Four sequences obtained from A. parvum, three N. nasua and one wild rodent were closely related to Theileria equi. Lastly, Cytauxzoon spp. was detected in four L. pardalis. The present work shows the occurrence of vector-borne agents in wild and domestic animals in southern mato grosso Pantanal.
Resumo
Agentes das Ordens Rickettsiales, Haemosporida e Rhizobiales são causadores de enfermidades que acometem várias espécies animais, podendo representar um risco à saúde dos mesmos, inclusive de seres humanos. Aves carnívoras podem infestar-se e infectar-se com muitas espécies de parasitas, incluindo-se carrapatos e hemoparasitas, sendo os hábitos de predação fatores de favorecimento à transmissão e translocação de diversos agentes etiológicos. O objetivo deste estudo foi pesquisar, por meio de métodos indiretos (Reação de Imunofluorescência Indireta RIFI) e diretos (esfregaços sanguíneos, PCR em Tempo Real e PCR Convencional) os agentes das Famílias Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) e Ordem Haemosporida (Plasmodium, Haemoproteus e Leucocytozoon) em ectoparasitas e amostras de sangue de aves carnívoras, realizando-se um estudo filogenético dos agentes encontrados. Para tanto, procedeu-se à colheita de 121 amostras de sangue total e 88 amostras de soro de aves pertencentes às Ordens Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes e Cathartiformes, capturadas nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro. Em relação aos ectoparasitas, foram recolhidas três larvas e uma ninfa ingurgitada de carrapatos do gênero Amblyomma de um gavião carijó (Rupornis magnirostris) no Estado de São Paulo. Na RIFI para E. chaffeensis e A. phagocytophilum, 03 (3,41%) e 05 (5,68%) amostras apresentaram sororreatividade, respectivamente. Todas as amostras testadas na RIFI para E. canis mostraram-se negativas. Na avaliação de esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, não foram encontradas estruturas compatíveis com hemoparasitas. Em relação a PCR em Tempo Real (qPCR), não foram encontrados animais PCR positivos para Ehrlichia chaffeensis (gene vlpt) e Anaplasma phagocytophilum (gene msp-2). Na qPCR Multiplex para Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (gene groE) e Bartonella spp. (gene nuoG) observamos 12 amostras positivas para Anaplasma spp. (9,91%). Na PCR convencional baseada no gene 16SrRNA de Anaplasmataceae e no gene citocromo B para hemosporídeos, oito aves foram PCR positivas para Ehrlichia spp (6,61%, sendo cinco na PCR para E. chaffeensis e três na PCR para E. canis), três para Haemoproteus spp (2,48%) e uma para Plasmodium spp (0,83%). Na análise filogenética, quatro amostras de Ehrlichia spp. posicionaram-se no mesmo ramo de Ehrlichia identificadas em animais selvagens no Brasil e de um isolado humano nos EUA. Para os agentes estudados, a diversidade genética entre as linhagens dos hemoparasitas em estudo interferem enormemente no diagnóstico específico, sobretudo quando apenas é utilizado o diagnóstico molecular. Apesar da baixa frequência de aves infectadas pelos referidos patógenos e infestadas por carrapatos, as aves carnívoras estão expostas à infecção por agentes da Família Anaplasmataceae e Ordem Haemosporida, podendo carreá-los em seu habitat.
Rickettsiales, Haemosporida and Rhizobiales agents cause diseases that affect various animal species, including humans. Carnivorous birds become infested and infected with many species of parasites, including ticks and hemoparasites, and the predation habits favoring transmission and translocation of various etiological agents. The aim of this study was to investigate, using indirect methods (Immunofluorescence - IFAT) and direct methods (blood smears, Real-Time PCR and Conventional PCR) agents of Families Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) and Haemosporida Order (Plasmodium, Haemoproteus and Leucocytozoon) in ectoparasites and blood samples carnivorous birds, performing a phylogenetic study of these agents. Therefore, we collected 121 blood samples and 88 serum samples from birds belonging to the Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes and Cathartiformes Orders, captured in the states of São Paulo and Rio de Janeiro. Regarding the ectoparasites, we collected three larvae and one engorged nymphal Amblyomma ticks of a Rupornis magnirostris in São Paulo. At IFAT for E. chaffeensis and A. phagocytophilum, 03 (3.41%) and 05 (5.68%) samples showed seroreactivity, respectively. Blood smears stained by Giemsa were analyzed and hemoparasites were not found. Regarding the Real-Time PCR (qPCR), in multiplex qPCR for Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (groE gene) and Bartonella spp. (nuoG gene) observed 12 samples positive for Anaplasma spp. (9.91%). In conventional PCR-based 16SrRNA gene for Anaplasmataceae and cytochrome B gene for hemosporidia, eight birds were PCR positive for Ehrlichia spp (6.61%, five in PCR for E. chaffeensis and three in PCR for E. canis), three for Haemoproteus spp (2.48%) and Plasmodium spp (0.83%). In phylogenetic analysis, four samples of Ehrlichia spp. positioned on the same branch Ehrlichia identified in wild animals in Brazil and the US human isolate. The genetic diversity between strains of hemoparasites in these study interfere greatly in the specific diagnosis. Despite the low frequency of birds infected by these pathogens and infested with ticks, carnivorous birds are exposed to infection by agents of Anaplasmataceae Family and Haemosporida Order, and may carrea them in their habitat.