Evaluation of three classification methods of antral follicle count and fertility to the timed artificial insemination in cattle

The controversial data about antral follicle count (AFC) may be partially explained by the different criteria used to determine what is high, intermediate and low AFC. This study evaluated different classification methods for AFC groups, relating them to the conception rate, dominant follicle size and body condition score (BCS) in cows submitted to timed artificial insemination (TAI). Nelore cows (Bos indicus; n = 935), received a reproductive program consisting of TAI and natural breeding. Conception rate, BCS and dominant follicle size during TAI were evaluated by three AFC methodologies: i) mean and standard deviation: low (≤ 15 follicles); intermediate (≥ 16 to ≤ 44 follicles) or high (≥ 45 follicles); ii) quartiles: low (≤ 15 follicles); intermediate (≥ 16 to ≤ 39 follicles), or high (≥ 40 follicles); and iii) AFC score: I (low; ≤ 15 follicles); II (intermediate; ≥ 16 to ≤ 30 follicles); III (high; ≥ 31 to ≤ 44 follicles) or IV (very high; ≥ 45 follicles). Data were analyzed by a GLIMMIX and Tukey test or binary logistic regression model (P ≤ 0.05). The conception rate to TAI was influenced (P < 0.05) by AFC in the three methods classification, being the highest conception rate observed in the low AFC group regardless of method utilized: Mean (low 61.73%a, intermediate 54.02%ab and high 49.48%b), Quartiles (low 61.73%a, intermediate 53.59%ab and 51.46%b) and Score (I 61.73%a, II 54.80%ab, III 53.23%ab and IV 49.48%b). There were variations (P < 0.05) in the conception rate within the 2.50 to 2.75 BCS range for all AFC classification methods, with the low AFC females presenting the best results, regardless of the method used. Also, females with low AFC showed larger (P < 0.05) diameters of dominant follicles at the TAI regardless of method. The different methodologies used (Mean, Quartile and Score) to AFC classification showed a consistency between the main findings, and we believe that this standardization will facilitate the interpretation of data involving AFC.(AU)

Antral follicle count, productive and reproductive parameters in Bos indicus and Bos indicus-taurus prepubertal heifers with early puberty induction / Contagem de folículos antrais, parâmetros produtivos e reprodutivos em novilhas pré-púberes Bos indicus e Bos indicus-taurus com indução precoce de puberdade

Prepubertal Nelore (G-N = 15) and crossbred Nelore x Aberdeen Angus heifers (G-NA = 15) were used for this study. AFC, live weight, body condition score (BCS), ovary and dominant follicle (DF) diameters were determined in each animal. Puberty induction was performed by insertion of a 4th use progesterone device (D0) which was removed on D12. Also, 1 mg estradiol benzoate was administered, and estrus intensity was classified (D12). At D21, the presence and diameter of the corpus luteum (CL) were registered. AFC was highly repeatable, regardless of hormone induction in both G-N (r=0.79) and G-NA (r=0.90). The mean AFC was greater in G-N compared to G-NA (24.2±8.5 vs. 17.7±9.0 follicles). A variation in BCS throughout the study occurred in G-NA, but not in G-N. The average weight gain (AWG) was greater in G-NA compared to G-N (0.69±0.33 vs. 0.40±0.29kg/day). The G-NA resulted in a larger diameter of DF at D12 than G-N (11.6±2.7 vs. 9.3±1.5mm). In conclusion, AFC was greater in Nelore heifers, although in both breeds this count was highly repeatable during puberty induction. Crossbred heifers had greater BCS and AWG with greater diameter of DF, indicating higher precocity when compared to Nelore heifers.

Novilhas pré-púberes Nelore (G-N=15) e mestiças Nelore x Aberdeen Angus (G-NA=15) foram utilizadas neste estudo. CFA, peso vivo, escore de condição corporal (ECC), diâmetros do ovário e folículo dominante (FD) foram determinados em cada animal. A indução da puberdade foi realizada pela inserção de um dispositivo de progesterona de quarto uso (D0), que foi retirado no D12. Além disso, 1mg de benzoato de estradiol foi administrado e a intensidade do estro foi classificada (D12). No D21, foram registrados a presença e o diâmetro do corpo lúteo (CL). A CFA foi altamente repetível, independentemente da indução hormonal em G-N (r=0,79) e G-NA (r=0,90). A CFA média foi maior em G-N em comparação com G-NA (24,2±8,5 vs. 17,7±9,0 folículos). Uma variação no ECC ao longo do estudo ocorreu em G-NA, mas não em G-N. O ganho de peso médio (GPM) foi maior em G-NA em comparação com G-N (0,69±0,33 vs. 0,40±0,29kg/dia). O G-NA resultou em um diâmetro maior de FD em D12 do que o G-N (11,6±2,7 vs. 9,3±1,5mm). Em conclusão, a CFA foi maior em novilhas Nelore, embora em ambas as raças essa contagem tenha sido altamente repetível durante a indução da puberdade. Novilhas mestiças apresentaram maior ECC e GPM com maior diâmetro de FD, indicando maior precocidade quando comparadas às novilhas Nelore.

Increased antral follicle population and in vitro embryo production in pregnant Holstein / Aumento da população folicular antral e produção in vitro de embriões em fêmeas gestantes da raça Holandesa

This study used Holstein cattle to evaluate the following: I) the productive and reproductive characteristics of cows with low, intermediate and high antral follicle counts (AFCs) that were subjected to artificialin semination (AI) and comparison of AFC variability at the time of AI (nonpregnant) and at two time points during pregnancy (30 and 60 days), and II) whether the pregnancy status and different pregnancy periods in heifers improves the efficiency at in vitro embryo production (IVEP). In study I, 75 high-milk production cows with body condition scores (BCSs) of 2.75 to 4.75 and ages of 23 to 99 months were selected. Onthe day of estrus, AFCs (follicles ≥ 3 mm), BCS, body weight, and diameters of the dominant follicle, ovaries and the corpus luteum were evaluated. Posteriorly, AFC was monitored in pregnant cows at 30 days (n =35) and at 60 days for comparison of AFC before pregnancy versus different periods. In study II, heifers (n = 9) with BCS of 2.5 to 3.5 and ages of 10 to 16 months were selected for ovum pick-up and an IVEP program before AI (nonpregnant) as well as at 0 to 30, 31 to 60, and > 60 days of pregnancy. Statistical analysis was performed using PROC GLM and binary logistic regression model (P ≤ 0.05). In study I, AFC was not associated with variations in productive and reproductive parameters. However, AFCs in the low group increased following pregnancy (AI: 14.82 ± 1.36, 30 days: 23.45 ± 2.31 and 60 days: 35.18 ± 3.17 follicles). AFCs increased from AI to 60 days in the intermediate group but did not vary among time points in the high group. AFCs varied among AFC groups in AI and at 30 days of pregnancy but not at 60 days. In study II, the mean of total oocytes (17.43 ± 4.52 vs. 41.67 ± 3.79) and viable oocytes (13.77 ± 3.63 vs. 30.56± 3.45) increased from AI (nonpregnant) to the first 30 days of pregnancy. [...]

Este estudo utilizou fêmeas da raça Holandesa para avaliar: i) variação da contagem de folículos antrais na gestação; ii) resultado da produção in vitro de embriões em doadoras antes e depois da gestação. No estudo I, 75 vacas de alta produção de leite com escores de condição corporal (ECC) de 2,75 a 4,75 e idades de 23 a 99 meses foram selecionadas. No dia do estro a CFA foi avaliada (folículos ≥ 3 mm) além do escore corporal, peso corporal e diâmetros do folículo dominante, ovários e corpo lúteo. Posteriormente, a CFA foi monitorada nas vacas gestantes (n = 35) aos 30 e 60 dias. No estudo II, novilhas (n = 9) com ECC de 2,5 a 3,5 e idades de 10 a 16 meses foram selecionadas para obtenção de oócitos antes e depois da gestação, no primeiro, segundo e acima dos dois meses de gestação. A análise estatística foi realizada usando PROC GLM e modelo de regressão logística binária (P ≤ 0,05). No estudo I, a CFA não foi associada a variações nos parâmetros produtivos e reprodutivos. No entanto, as vacas de baixa CFA apresentaram aumento no número de folículos após início da gestação (IA: 14,82 ± 1,36, 30 dias: 23,45 ± 2,31 e 60 dias:35,18 ± 3,17 folículos). A CFA aumentou da IA para 60 dias no grupo de CFA intermediária, mas não variou ao longo do tempo no grupo de alta CFA. A CFA variou entre os grupos comparando-se o momento da IA e 30 dias de gestação. No estudo II, entre a IA e o primeiro mês de gestação, houve aumento do total de oócitos (17,43 ± 4,52 vs. 41,67 ± 3,79), bem como de oócitos viáveis (13,77 ± 3,63 vs. 30,56 ± 3,45). O número médio de embriões produzidos aumentou durante a gestação, [...]

Increased antral follicle population and in vitro embryo production in pregnant Holstein / Aumento da população folicular antral e produção in vitro de embriões em fêmeas gestantes da raça Holandesa

This study used Holstein cattle to evaluate the following: I) the productive and reproductive characteristics of cows with low, intermediate and high antral follicle counts (AFCs) that were subjected to artificialin semination (AI) and comparison of AFC variability at the time of AI (nonpregnant) and at two time points during pregnancy (30 and 60 days), and II) whether the pregnancy status and different pregnancy periods in heifers improves the efficiency at in vitro embryo production (IVEP). In study I, 75 high-milk production cows with body condition scores (BCSs) of 2.75 to 4.75 and ages of 23 to 99 months were selected. Onthe day of estrus, AFCs (follicles ≥ 3 mm), BCS, body weight, and diameters of the dominant follicle, ovaries and the corpus luteum were evaluated. Posteriorly, AFC was monitored in pregnant cows at 30 days (n =35) and at 60 days for comparison of AFC before pregnancy versus different periods. In study II, heifers (n = 9) with BCS of 2.5 to 3.5 and ages of 10 to 16 months were selected for ovum pick-up and an IVEP program before AI (nonpregnant) as well as at 0 to 30, 31 to 60, and > 60 days of pregnancy. Statistical analysis was performed using PROC GLM and binary logistic regression model (P ≤ 0.05). In study I, AFC was not associated with variations in productive and reproductive parameters. However, AFCs in the low group increased following pregnancy (AI: 14.82 ± 1.36, 30 days: 23.45 ± 2.31 and 60 days: 35.18 ± 3.17 follicles). AFCs increased from AI to 60 days in the intermediate group but did not vary among time points in the high group. AFCs varied among AFC groups in AI and at 30 days of pregnancy but not at 60 days. In study II, the mean of total oocytes (17.43 ± 4.52 vs. 41.67 ± 3.79) and viable oocytes (13.77 ± 3.63 vs. 30.56± 3.45) increased from AI (nonpregnant) to the first 30 days of pregnancy. [...](AU)

Este estudo utilizou fêmeas da raça Holandesa para avaliar: i) variação da contagem de folículos antrais na gestação; ii) resultado da produção in vitro de embriões em doadoras antes e depois da gestação. No estudo I, 75 vacas de alta produção de leite com escores de condição corporal (ECC) de 2,75 a 4,75 e idades de 23 a 99 meses foram selecionadas. No dia do estro a CFA foi avaliada (folículos ≥ 3 mm) além do escore corporal, peso corporal e diâmetros do folículo dominante, ovários e corpo lúteo. Posteriormente, a CFA foi monitorada nas vacas gestantes (n = 35) aos 30 e 60 dias. No estudo II, novilhas (n = 9) com ECC de 2,5 a 3,5 e idades de 10 a 16 meses foram selecionadas para obtenção de oócitos antes e depois da gestação, no primeiro, segundo e acima dos dois meses de gestação. A análise estatística foi realizada usando PROC GLM e modelo de regressão logística binária (P ≤ 0,05). No estudo I, a CFA não foi associada a variações nos parâmetros produtivos e reprodutivos. No entanto, as vacas de baixa CFA apresentaram aumento no número de folículos após início da gestação (IA: 14,82 ± 1,36, 30 dias: 23,45 ± 2,31 e 60 dias:35,18 ± 3,17 folículos). A CFA aumentou da IA para 60 dias no grupo de CFA intermediária, mas não variou ao longo do tempo no grupo de alta CFA. A CFA variou entre os grupos comparando-se o momento da IA e 30 dias de gestação. No estudo II, entre a IA e o primeiro mês de gestação, houve aumento do total de oócitos (17,43 ± 4,52 vs. 41,67 ± 3,79), bem como de oócitos viáveis (13,77 ± 3,63 vs. 30,56 ± 3,45). O número médio de embriões produzidos aumentou durante a gestação, [...](AU)

Contagem de folículos antrais: relação com a eficiência das biotécnicas e fertilidade / Antral follicle count: relationship with the efficiency of biotechniques and fertility

A implementação das biotécnicas reprodutivas juntamente com os programas de melhoramento genético tem contribuído expressivamente para uma rápida disseminação de indivíduos melhoradores, tanto pelo uso da inseminação artificial, quanto pela produção in vivo e in vitro de embriões. No entanto, a eficiência destes programas está condicionada a uma série de fatores que podem afetar de maneira significativa a performance reprodutiva tanto em bovinos de corte, como de leite. Neste contexto, a contagem de folículos antrais (CFA) se destaca como um dos fatores de maior influência e ainda pouco compreendido. Empregando a ultrassonografia, fêmeas podem ser classificada em baixa, intermediária ou alta CFA, devido à alta variabilidade desta contagem no rebanho. Além disso, a alta repetibilidade desta característica possibilita realizar esta classificação em diferentes momentos da vida reprodutiva da fêmea. De maneira geral, doadoras de alta CFA tem proporcionado maiores rendimentos embrionários tanto na técnica in vivo quanto in vitro. Entretanto, fêmeas de baixa CFA têm apresentado maiores diâmetros foliculares e maior taxa de prenhez quando submetidas à IATF. Embora a CFA atue como um fator de grande influência, sua herdabilidade é baixa e não há relação com características zootécnicas de programas de melhoramento. Finalmente, a CFA tem se destacado como uma importante ferramenta de seleção de matrizes e que tem contribuído significativamente para um maior sucesso nos programas reprodutivos.

The implementation of reproductive biotechniques and genetic improvement programs has significantly contributed to a fast dissemination of animals with high genetic, both by artificial insemination and in vivo and in vitro embryo production. However, the efficiency of these programs is conditioned to several factors that can considerably affect the reproductive performance in both beef and dairy cattle. In this context, the antral follicle count (AFC) stands out as one of the most influential and still poorly understood factors. Females can be classified as low, intermediate, or high AFC by ultrasonography due to the high variability of this count in the herd. In addition, the high repeatability of this characteristic allows high confidence in carrying out this classification at different times of the reproductive life. In general, high AFC donors have provided higher embryo yields both in vivo and in vitro. However, females with low AFC have shown larger follicular diameters and higher pregnancy rate when submitted to TAI. Although AFC is a factor of great influence, its heritability is low and there is no relationship with zootechnical characteristics of breeding programs. Finally, AFC has emerged as an important tool to female’s selection and has significantly contributed to greater success in breeding programs.

Oogênese e Foliculogênese em Bovinos / Oogenesis and Folliculogenesis in Cattle

Os ovários desempenham papéis relevantes para o sistema reprodutivo, no qual a função exócrina (ou gametogênica) realiza a maturação e liberação do oócito para a fecundação e a função endócrina (ou esteroidogênica) afeta a síntese, secreção de hormônios e fatores de crescimento. Além disso, existe uma interação entre os fatores endócrinos, autócrinos e parácrinos, atuando em associação com o processo de desenvolvimento folicular e oocitário durante a vida reprodutiva da fêmea. O córtex, porção mais externa do ovário, representa a região funcional onde se localizam os folículos ovarianos e as estruturas lúteas, em diferentes estágios de desenvolvimento e/ou atresia. A região medular localiza-se mais internamente, na maioria das espécies, e sua principal função é nutrir e sustentar o ovário. Apesar da numerosa população folicular presente nos ovários, estabelecida durante a vida fetal, quase todos os folículos encontrados no pool de reserva ovariana, ou seja, 99,9%, não atingem a ovulação. Esses folículos passam por um processo de morte celular conhecido como atresia folicular, tornando o ovário um órgão de baixa produtividade. A elucidação dos mecanismos que regulam a foliculogênese, incluindo o processo de atresia, é importante para o melhor aproveitamento dos folículos na melhoria da eficiência reprodutiva de animais de produção.

The ovaries play roles relevant to the reproductive system, in which the exocrine (or gametogenic) function carries out the maturation and release of the oocyte for fertilization and the endocrine (or steroidogenic) function effects the synthesis and secretion of hormones and growth factors. In addition, there is an interaction between endocrine, autocrine and paracrine factors, acting in association with the follicular and oocyte development process during the female's reproductive life. The cortex, the outermost portion of the ovary, represents the functional region where the ovarian follicles and luteal structures are located, at different stages of development and/or atresia. The medullary region is located more internally, in most species, and its main function is to nourish and support the ovary. Despite the numerous follicular population present in the ovaries, established during fetal life, almost all follicles found in the ovarian reserve pool, i.e., 99.9%, do not reach ovulation. These follicles undergo a process of cell death known as follicular atresia, making the ovary a low-productivity organ. The elucidation of the mechanisms that regulate folliculogenesis, including the atresia process, is important for the better use of follicles in improving the reproductive efficiency of production animals.

Influência da contagem de folículos antrais na produção in vitro de embriões bovinos de doadoras Bos indicus e Bos taurus Revisão de literatura / Influence of the antral follicle count on bovine in vitro embryo production from Bos indicus and Bos taurus donors

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica que se consolidou nos últimos anos e seu uso em bovinos continua a expandir-se, especialmente no Brasil. A facilidade em obter oócitos e as características do rebanho brasileiro foram determinantes para este crescimento. É conhecido que animais Bos taurus indicus e Bos taurus taurus possuem diferenças fisiológicas, metabólicas, endócrinas e comportamentais que impactam diretamente a reprodução. Além disso, a contagem de folículos antrais (CFA) é um parâmetro conhecidamente repetível no indivíduo, mas seu impacto na reprodução das fêmeas ainda não está completamente elucidado, especialmente considerando suas interações com a subespécie. O objetivo da presente revisão é destacar os mecanismos pelos quais estas características influenciam o rendimento e aplicabilidade da produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

In vitro embryo production (IVP) is a well stablished biotechnic, and its use in bovines is still expanding, especially in Brazil. The facility to obtain oocytes associated to the breed characteristics of the Brazilian herd were decisive for this expansion. It is known that the physiology, metabolism, endocrinal system and behavior are different for Bos taurus indicus and Bos taurus taurus animals, and these differences may impact directly on the characteristics of reproduction of these animals. Furthermore, the antral follicle count (AFC) is known to present high repeatability on the same female, but its impact on the female reproduction remains unclear, either in the interaction between AFC and subspecies. The aim of this review is to highlight the mechanisms through which the AFC and subspecies may influence the income and feasibility of bovine in vitro embryo production.(AU)

Influência da contagem de folículos antrais na produção in vitro de embriões bovinos de doadoras Bos indicus e Bos taurus – Revisão de literatura / Influence of the antral follicle count on bovine in vitro embryo production from Bos indicus and Bos taurus donors

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica que se consolidou nos últimos anos e seu uso em bovinos continua a expandir-se, especialmente no Brasil. A facilidade em obter oócitos e as características do rebanho brasileiro foram determinantes para este crescimento. É conhecido que animais Bos taurus indicus e Bos taurus taurus possuem diferenças fisiológicas, metabólicas, endócrinas e comportamentais que impactam diretamente a reprodução. Além disso, a contagem de folículos antrais (CFA) é um parâmetro conhecidamente repetível no indivíduo, mas seu impacto na reprodução das fêmeas ainda não está completamente elucidado, especialmente considerando suas interações com a subespécie. O objetivo da presente revisão é destacar os mecanismos pelos quais estas características influenciam o rendimento e aplicabilidade da produção in vitro de embriões bovinos.

In vitro embryo production (IVP) is a well stablished biotechnic, and its use in bovines is still expanding, especially in Brazil. The facility to obtain oocytes associated to the breed characteristics of the Brazilian herd were decisive for this expansion. It is known that the physiology, metabolism, endocrinal system and behavior are different for Bos taurus indicus and Bos taurus taurus animals, and these differences may impact directly on the characteristics of reproduction of these animals. Furthermore, the antral follicle count (AFC) is known to present high repeatability on the same female, but its impact on the female reproduction remains unclear, either in the interaction between AFC and subspecies. The aim of this review is to highlight the mechanisms through which the AFC and subspecies may influence the income and feasibility of bovine in vitro embryo production.

Ovarian antral follicle populations and embryo production in cattle

Reproductive biotechniques such as embryo production are important tools to increase the reproductive performance in cattle in a short time. In this context, the antral follicle count (AFC), which reflects the population of antral follicles present in an ovary, has been indicated as an important phenotypic characteristic related to female fertility and closely correlated to the performance of in vivo and in vitro embryo production (IVEP). A positive correlation was evidenced between AFC and oocyte retrieval by ovum pick up (OPU) sessions and and with the number of embryos produced. Several studies have reported that females with a high AFC had greater embryo yields compared to those with medium and low AFC. However, controversial results were obtained by studies conducted in different bovine breeds. Many conflicting data may be due to the differences in the experimental design, particularly regarding the classification of animals in AFC groups, subspecies particularities, herd aptitude or even issues related to animal management. Therefore, aspects such as the choice of donor, type of aspirated follicles and the stage of follicular wave need to be clarified. Thus, this text aims to discuss the use of AFC as a reproductive tool and its applications in the in vivo and in vitro production of embryos, besides describing consistent results and new challenges regarding AFC and embryo production.

Ovarian antral follicle populations and embryo production in cattle

Reproductive biotechniques such as embryo production are important tools to increase the reproductive performance in cattle in a short time. In this context, the antral follicle count (AFC), which reflects the population of antral follicles present in an ovary, has been indicated as an important phenotypic characteristic related to female fertility and closely correlated to the performance of in vivo and in vitro embryo production (IVEP). A positive correlation was evidenced between AFC and oocyte retrieval by ovum pick up (OPU) sessions and and with the number of embryos produced. Several studies have reported that females with a high AFC had greater embryo yields compared to those with medium and low AFC. However, controversial results were obtained by studies conducted in different bovine breeds. Many conflicting data may be due to the differences in the experimental design, particularly regarding the classification of animals in AFC groups, subspecies particularities, herd aptitude or even issues related to animal management. Therefore, aspects such as the choice of donor, type of aspirated follicles and the stage of follicular wave need to be clarified. Thus, this text aims to discuss the use of AFC as a reproductive tool and its applications in the in vivo and in vitro production of embryos, besides describing consistent results and new challenges regarding AFC and embryo production.(AU)

Utilização do cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em tecido ovariano (in situ) como modelo de avaliação da eficiência de medicamentos homeopáticos na foliculogênese inicial / In situ cultured preantral follicles is a useful model to evaluate the effect of homeopathy medicine on early folliculogenesis

Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito dos medicamentos homeopáticos (Pulsatilla nigricans e hormônio folículo estimulante homeopático - FSH) e um complexo homeopático (Bos Stress Fertilis) na foliculogênese inicial, utilizando o cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos como modelo in vitro. Para tanto, fragmentos ovarianos foram cultivados por um ou sete dias em α-MEM+ na ausência (controle cultivado) ou presença de FSH homeopático (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), álcool cereal (50% - v/v) ou FSH recombinante (50 ng/ml) adicionados diariamente. Os fragmentos ovarianos não cultivados (controle fresco) ou cultivados por um e sete dias foram processados para histologia clássica. Somente o composto homeopático Bos Stress Fertilis foi eficiente em manter o percentual de sobrevivência folicular após sete dias de cultivo semelhante ao controle não cultivado e α-MEM+. Em relação ao crescimento folicular, somente a adição de FSH homeopático aumentou o diâmetro folicular quando comparado ao controle não cultivado e α-MEM+ após um dia de cultivo. Dessa forma, pode-se concluir que a adição dos medicamentos homeopáticos Bos Stress fertilis e FSH homeopático (6 CH) melhoraram, respectivamente, a sobrevivência e o crescimento in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em fragmentos de tecido ovariano.

This study investigated the effect of homeopathic medicine (Pulsatilla nigricans and homeopathic follicle stimulating hormone - FSH) and the complex (Bos Stress Fertilis) on the initial folliculogenesis, using the in vitro culture of preantral follicles as in vitro model. For this, swine ovarian fragments were cultured for one or seven days in α-MEM+ in the absence (cultured control) or presence of homeopathic FSH (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), grain alcohol (50% v / v) or recombinant FSH (50 ng / ml) added daily. Uncultured ovarian fragments (fresh control) or cultured for one and seven days were processed for classical histology. Only the homeopathic complex Bos Stress Fertilis maintained the percentage of follicular survival after seven days of culture in relation to the uncultured control and α-MEM+. Regarding follicular growth, only the addition of homeopathic FSH increased the follicular diameter when compared to the uncultured control and a-MEM+. Thus, it can be concluded that the addition of the homeopathic remedies Bos Stress fertilis and homeopathic FSH (6 CH) improved, respectively, survival and in vitro growth of swine preantral follicles included in ovarian tissue.

Utilização do cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em tecido ovariano (in situ) como modelo de avaliação da eficiência de medicamentos homeopáticos na foliculogênese inicial / In situ cultured preantral follicles is a useful model to evaluate the effect of homeopathy medicine on early folliculogenesis

Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito dos medicamentos homeopáticos (Pulsatilla nigricans e hormônio folículo estimulante homeopático - FSH) e um complexo homeopático (Bos Stress Fertilis) na foliculogênese inicial, utilizando o cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos como modelo in vitro. Para tanto, fragmentos ovarianos foram cultivados por um ou sete dias em α-MEM+ na ausência (controle cultivado) ou presença de FSH homeopático (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), álcool cereal (50% - v/v) ou FSH recombinante (50 ng/ml) adicionados diariamente. Os fragmentos ovarianos não cultivados (controle fresco) ou cultivados por um e sete dias foram processados para histologia clássica. Somente o composto homeopático Bos Stress Fertilis foi eficiente em manter o percentual de sobrevivência folicular após sete dias de cultivo semelhante ao controle não cultivado e α-MEM+. Em relação ao crescimento folicular, somente a adição de FSH homeopático aumentou o diâmetro folicular quando comparado ao controle não cultivado e α-MEM+ após um dia de cultivo. Dessa forma, pode-se concluir que a adição dos medicamentos homeopáticos Bos Stress fertilis e FSH homeopático (6 CH) melhoraram, respectivamente, a sobrevivência e o crescimento in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em fragmentos de tecido ovariano.(AU)

This study investigated the effect of homeopathic medicine (Pulsatilla nigricans and homeopathic follicle stimulating hormone - FSH) and the complex (Bos Stress Fertilis) on the initial folliculogenesis, using the in vitro culture of preantral follicles as in vitro model. For this, swine ovarian fragments were cultured for one or seven days in α-MEM+ in the absence (cultured control) or presence of homeopathic FSH (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), grain alcohol (50% v / v) or recombinant FSH (50 ng / ml) added daily. Uncultured ovarian fragments (fresh control) or cultured for one and seven days were processed for classical histology. Only the homeopathic complex Bos Stress Fertilis maintained the percentage of follicular survival after seven days of culture in relation to the uncultured control and α-MEM+. Regarding follicular growth, only the addition of homeopathic FSH increased the follicular diameter when compared to the uncultured control and a-MEM+. Thus, it can be concluded that the addition of the homeopathic remedies Bos Stress fertilis and homeopathic FSH (6 CH) improved, respectively, survival and in vitro growth of swine preantral follicles included in ovarian tissue.(AU)

Number of oocytes retrieved per donor during OPU and its relationship with in vitro embryo production and field fertility following embryo transfer

The association of OPU-IVEP is an important instrument to drive genetic progress. In vitro embryo production (IVEP) has remarkably expanded in the last decade compared to in vivo embryo production. Because of the high repeatability of oocyte retrieval within oocyte-donors, studies exploring the relationship between the number of oocytes recovered per OPU section with IVEP efficiency, as well as with field fertility (pregnancy results following embryo transfer; P/ET) are extremely important to guide cow-donor selection and optimize field reproduction efficiency and the herd’s genetic gain. Based on this rationale, our group conducted a retrospective analysis of a large database comprising IVEP records from several cattle breeds, including Bos indicus and Bos taurus for either beef or dairy purposes. A total of 205,140 oocytes recovered from 7,906 OPU procedures of 6,902 donors (5,227 beef and 1,675 dairy) of Brazilian farms were analyzed. Beef breeds analyzed were Nelore (Bos indicus) and Senepol (Bos taurus) and dairy breeds Were Gyr (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus). According to our analysis, the IVEP in beef cattle had a great improvement throughout the last years, with a remarkable increase in numbers of pregnancies per OPU compared to late 90’s (averaging only 1 pregnancy per OPU in 1998 vs 2,4 in 2014). As for the distribution of oocytes retrieved, both Bos indicus beef (Nelore = 27.2) and dairy (Gyr = 23.8) breeds seem to yield greater average numbers of oocytes per OPU compared to Bos taurus (Senepol = 21.8; Holstein = 19.3).

Number of oocytes retrieved per donor during OPU and its relationship with in vitro embryo production and field fertility following embryo transfer

The association of OPU-IVEP is an important instrument to drive genetic progress. In vitro embryo production (IVEP) has remarkably expanded in the last decade compared to in vivo embryo production. Because of the high repeatability of oocyte retrieval within oocyte-donors, studies exploring the relationship between the number of oocytes recovered per OPU section with IVEP efficiency, as well as with field fertility (pregnancy results following embryo transfer; P/ET) are extremely important to guide cow-donor selection and optimize field reproduction efficiency and the herds genetic gain. Based on this rationale, our group conducted a retrospective analysis of a large database comprising IVEP records from several cattle breeds, including Bos indicus and Bos taurus for either beef or dairy purposes. A total of 205,140 oocytes recovered from 7,906 OPU procedures of 6,902 donors (5,227 beef and 1,675 dairy) of Brazilian farms were analyzed. Beef breeds analyzed were Nelore (Bos indicus) and Senepol (Bos taurus) and dairy breeds Were Gyr (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus). According to our analysis, the IVEP in beef cattle had a great improvement throughout the last years, with a remarkable increase in numbers of pregnancies per OPU compared to late 90s (averaging only 1 pregnancy per OPU in 1998 vs 2,4 in 2014). As for the distribution of oocytes retrieved, both Bos indicus beef (Nelore = 27.2) and dairy (Gyr = 23.8) breeds seem to yield greater average numbers of oocytes per OPU compared to Bos taurus (Senepol = 21.8; Holstein = 19.3).(AU)

Antral follicle count in cattle: advantages, challenges, and controversy

The antral follicle count (AFC) represents the number of follicles visualized by ultrasonography in the ovaries. Antral follicle count tends to be variable among cows but with high repeatability within the same individual. In the last decade, AFC has been considered a biological marker of fertility with many positive aspects of reproductive efficiency for those animals with high AFC. For instance, a larger number and better-quality embryos, better pregnancy rates, increased concentrations of circulating progesterone, in addition to other characteristics linked to fertility, are all responses observed in individuals with high compared with those with low AFC in Bos taurus cattle. However, the positive association between AFC and fertility did not follow the same pattern for Bosindicus. Recent articles showed no connection between fertility and number of antral follicles or better reproductive efficiency for high AFC group in Zebu cows. Thus, the aim of this review is to discuss the various data concerning AFC between indicus and taurus cattle. Additionally, we consider AFC to be a possible tool to improve cattle performance in reproductive biotechnology.

Antral follicle count in cattle: advantages, challenges, and controversy

The antral follicle count (AFC) represents the number of follicles visualized by ultrasonography in the ovaries. Antral follicle count tends to be variable among cows but with high repeatability within the same individual. In the last decade, AFC has been considered a biological marker of fertility with many positive aspects of reproductive efficiency for those animals with high AFC. For instance, a larger number and better-quality embryos, better pregnancy rates, increased concentrations of circulating progesterone, in addition to other characteristics linked to fertility, are all responses observed in individuals with high compared with those with low AFC in Bos taurus cattle. However, the positive association between AFC and fertility did not follow the same pattern for Bosindicus. Recent articles showed no connection between fertility and number of antral follicles or better reproductive efficiency for high AFC group in Zebu cows. Thus, the aim of this review is to discuss the various data concerning AFC between indicus and taurus cattle. Additionally, we consider AFC to be a possible tool to improve cattle performance in reproductive biotechnology.(AU)

Effect of ovarian tissue storage in Morus nigra extract on the morphology and DNA fragmentation of ovine preantral follicles / Efeito da conservação de tecido ovariano em extrato de Morus nigra sobre a morfologia e fragmentação de DNA de folículos pré-antrais ovinos

This study demonstrated the effect of Morus nigra leaf extract during ovine ovarian tissue transportation on the survival and apoptosis of preantral follicles in vitro. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was used to determine the fingerprint chromatogram of the crude ethanolic extract. Four pairs of ovaries from four sheep were collected. The ovarian cortex was fragmented and one fragment was fixed in 10% buffered formaldehyde and processed for histological and TUNEL analysis (fresh control). The other fragments were placed in Minimal Essential Medium (MEM control medium) or M. nigra extract (0.025; 0.05 or 0.1 mg/mL) and stored (simulating transport) at 4ºC for 6, 12 or 24 h. Preserved fragments (6 h) were also destined to histological and TUNEL analysis. HPLC analysis confirmed the presence of antioxidant compounds (rutin, isoquercetin e kaempferitrin) in the extract. There was a decrease (P < 0.05) in the percentage of morphologically normal preantral follicles after preservation in all treatments compared to the fresh control. The percentage of normal preantral follicles after preservation in M. nigra at 0.05 mg/mL for 6 h was higher (P < 0.05) than in MEM or 0.025 mg/mL M. nigra and similar (P > 0.05) to 0.1 mg/mL of the extract. Apoptosis increased (P < 0.05) after conservation for 6 h in all treatments compared to the fresh control. Moreover, TUNEL positive cells decreased (P < 0.05) after preservation in 0.05 or 0.1 mg/mL M. nigra compared to MEM or 0.025 mg/mL M. nigra. In conclusion, 0.05 mg/mL M. nigra extract can be used as a preservation medium for ovine ovarian tissue at 4°C for up to 6 h.(AU)

Este estudo demonstrou o efeito do extrato das folhas de Morus nigra durante o transporte na sobrevivência e apoptose de folículos pré-antrais in vitro. A CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) foi usada para determinar a impressão digital cromatográfica do extrato etanólico. Foram coletados 4 pares de ovários de 4 ovelhas. O córtex ovariano foi fragmentado e um dos fragmentos foi fixado em formaldeído tamponado a 10% e destinado à histologia clássica e análise de TUNEL (controle fresco). Os demais fragmentos foram colocados em Meio Essencial Mínimo (MEM - meio controle) ou extrato de M. nigra (0,025, 0,05 ou 0,1 mg/mL) e conservados (simulando transporte) à 4 ºC por 6, 12 ou 24 h. Os fragmentos conservados (6h) também foram destinados à análise histológica e de TUNEL. A análise de CLAE confirmou a presença de compostos antioxidantes (rutina, isoquercetina e canferitrina) no extrato. Houve uma redução (P < 0,05) na percentagem de folículos pré-antrais morfologicamente normais após conservação em todos os tratamentos em comparação com o controle fresco. A percentagem de folículos pré-antrais normais após conservação em M. nigra a 0,05 mg/mL por 6 h foi maior (P < 0,05) do que em MEM ou M. nigra a 0,025 mg/mL e similar (P > 0,05) ao extrato a 0,1 mg/mL. A apoptose aumentou (P < 0,05) após conservação durante 6 horas em todos os tratamentos em comparação com o controle fresco. Além disso, as células TUNEL positivas diminuíram (P < 0,05),após conservação em 0,05 ou 0,1mg/mL de M. nigra em comparação com MEM ou 0,025 mg/mL de M. nigra. Em conclusão, 0,05 mg/mL de M. nigra pode ser usado como meio de conservação de tecido ovariano ovino a 4 °C durante até 6 h.(AU)

EFEITO DA ADIÇÃO DE GDF-9 NO CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS ANTRAIS INICIAIS CAPRINOS

O presente estudo teve como objetivo investigar o efeito do GDF-9 durante o cultivo in vitro de folículos antrais iniciais caprinos isolados em meio contendo anetol. Os folículos antrais iniciais selecionados foram cultivados individualmente e os seguintes tratamentos foram testados: -MEM+ sozinho (tratamento de controle) ou -MEM+ suplementado com 200 ng/mL de GDF-9 (tratamento de GDF-9) por 18 dias a 38,5 °C e 7,5% de CO2 em óleo mineral. No final do cultivo, complexos cumulos-oócito foram recuperados e selecionados para MIV. Os seguintes parâmetros foram avaliados: (1) crescimento e morfologia folicular, (2) produção de estradiol, (3) maturação nuclear oocitária e (4) expressão relativa de genes referentes à esteroidogênese e remodelação da membrana basal. Em ambos os tratamentos, foi observada diminuição na porcentagem de folículos intactos com concomitante aumento nas taxas de extrusão e degeneração (P < 0,05). Comparado ao tratamento controle, o tratamento com GDF-9 apresentou maiores taxas de extrusão folicular apenas no dia 6 de cultivo (P < 0,05). O diâmetro folicular aumentou progressivamente ao longo do período de cultivo (P < 0,05) com diâmetros semelhantes entre os tratamentos em todos os tempos de cultivo (P > 0,05). Por outro lado, o GDF-9 aumentou a taxa de crescimento do primeiro para o segundo terço do cultivo, sendo maior (P < 0,05) do que o controle no segundo terço. Todos os outros parâmetros avaliados no dia 18 foram semelhantes entre os dois tratamentos, ou seja, produção de estradiol, níveis de mRNA para receptor de insulina, CYP19A1, CYP17, MMP-9, TIMP-2, viabilidade, crescimento e taxas de maturação oocitária (P > 0,05). Em conclusão, este estudo mostrou pela primeira vez que o GDF-9 adicionado a um meio de cultivo contendo anetol aumentou a taxa de crescimento de folículos antrais iniciais isolados caprinos cultivados in vitro. No entanto, não teve efeito na produção de estradiol e na maturação oocitária in vitro.

The present study aimed to investigate the effect of GDF-9 during the in vitro culture of isolated caprine early antral follicles in a medium containing anethole. The early antral follicles selected were individually cultured and the following treatments were tested: -MEM+ alone (Control treatment) or -MEM+ supplemented with 200 ng/mL GDF-9 (GDF-9 treatment) for 18 days at 385°C and 7.5% de CO2 under mineral oil. At the end of culture, cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered and selected for IVM. The following endpoints were evaluated: (1) follicular growth and morphology, (2) estradiol production, (3) oocyte nuclear maturation, and (4) relative expression of genes related to steroidogenesis and basement membrane remodeling. In both treatments, it was observed a decrease in the percentage of morphologically intact follicles with a concomitant increase in the rates of extruded and degenerated follicles (P < 0.05). Compared to the control treatment, the GDF-9 treatment showed higher rates of extruded follicles only on day 6 of culture (P < 0.05). Follicle diameter increased progressively throughout the culture period (P < 0.05) with similar diameters between treatments at all culture times (P > 0.05). On the other hand, GDF-9 increased the daily growth rate from the first to the second third of culture, being higher (P < 0.05) than control in the second third. All other evaluated parameters on day 18 were comparable between the two treatments, i.e., estradiol production, mRNA levels for insulin receptor, CYP19A1, CYP17, MMP-9, TIMP-2, oocyte survival, growth, and maturation rates (P > 0.05). In conclusion, this study shows for the first time that GDF-9 added to a culture medium containing anethole increased the follicle growth rate of goat isolated early follicles cultured in vitro. Nonetheless, it had no effect on either estradiol production and oocyte in vitro maturation.

XENOTRANSPLANTE DE FRAGMENTOS DE CÓRTEX OVARIANO BOVINO TRATADOS COM RESVERATROL

O processo de restabelecimento da circulação sanguínea após o transplante, tem influência na sobrevivência do tecido e no desenvolvimento folicular. O resveratrol tem sido utilizado em inúmeros estudos, por apresentar efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. No entanto, não existe informação sobre possíveis ações benéficas do resveratrol nos tecidos ovarianos que serão destinados ao transplante. Objetivou-se, no primeiro experimento, realizar a vitrificação de tecido ovariano com e sem resveratrol, e após o cultivo in vitro e xenotransplante de tecido ovariano de fêmeas bovinas, avaliar a morfologia e a capacidade de desenvolvimento dos folículos pré- antrais, e ainda, o estresse oxidativo, os níveis de degeneração celular e a apoptose no tecido, e no segundo experimento, realizar a incubação do tecido ovariano por 24 horas em meio de cultivo acrescido ou não com resveratrol, seguido do cultivo in vivo (xenotransplante) e avaliar a morfologia e a capacidade de desenvolvimento dos folículos préantrais. Observou-se que no primeiro experimento, os tecidos que foram vitrificados com resveratrol, apresentaram menores taxas de degeneração celular (p<0,05) quando comparado aos tecidos vitrificados sem resveratrol. O xenotransplante fresco por 7 dias, apresentou viabilidade folicular semelhante ao controle cultivado in vitro por 7 dias. A vitrificação com resveratrol seguida do xenotransplante apresentou maior taxa de degeneração celular e apoptose, do que os tecidos vitrificados sem resveratrol e xenotransplantados. No segundo experimento, o grupo de tecidos ovarianos incubados com resveratrol e xenotransplantados por 14 e 28 dias apresentou menor (P < 0,05) viabilidade e ativação folicular que os tecidos incubados sem adição do antioxidante resveratrol. O grupo xenotransplante fresco e o grupo xenotransplantes incubado sem resveratrol por 14 e 28 dias, apresentaram viabilidade folicular semelhante (P > 0,05) ao grupo controle fresco. Frente aos resultados obtidos, podemos concluir que o uso de resveratrol em soluções de vitrificação reduz a viabilidade folicular de tecidos ovarianos de fêmeas bovinas após xenotransplante por 7 dias. A utilização do cultivo in vivo (xenotransplante) sem resveratrol, demonstrou bons resultados na manutenção da viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano bovino, levando a manutenção folicular pelo período de 28 dias de transplante.

The process of reestablishing blood circulation after transplantation has an influence on tissue survival and follicular development. Resveratrol has been used in numerous studies, presenting antioxidant and anti-inflammatory effects. However, the possible beneficial actions of resveratrol in the ovarian tissues that will be aimed for transplantation is still not established. The aim of the first study was to vitrify ovarian tissue with resveratrol, and to evaluate the morphology and the developmental capacity of the preantral follicles after in vitro and in vivo cultivation (xenotransplantation) of ovarian tissue of bovine females. We also evaluate oxidative stress, levels of cell degeneration, and apoptosis in the tissue. In the second study we evaluate the morphology and the developmental capacity of the preantral follicles in the ovarian tissue that was incubate for 24 hours in cultivation medium with addition of resveratrol and after in vivo cultivation (xenotransplantation). The tissues that were vitrified with resveratrol, presented lower rates of cell degeneration (p <0.05) when compared to the vitrified tissues without resveratrol. Fresh xenotransplantation for 7 days presented follicular viability similar to the cultured control in vitro for 7 days. Resveratrol vitrification followed by xenotransplantation presented a higher rate of cell degeneration and apoptosis than vitrified tissues without resveratrol and xenotransplantation. The group of ovarian tissues incubated with resveratrol and xenotransplantation for 14 and 28 days presented less viability (P <0.05) and follicular activation than the tissues incubated without the addition of the antioxidant resveratrol. The fresh xenotransplantation and xenotransplantation groups incubated without resveratrol for 14 and 28 days presented similar follicular viability (P> 0.05) to the fresh control group. The use of resveratrol in vitrification solutions reduces the follicular viability of ovarian tissues of bovine females after xenotransplantation for 7 days. The use of in vivo cultivation (xenotransplantation) without resveratrol, demonstrated good results in maintaining the viability of pre-antral follicles included in bovine ovarian tissue, leading to follicular maintenance for the period of 28 days of transplantation.

Is the number of antral follicles an interesting selection criterium for fertility in cattle?

Recent studies indicate that the antral follicle population may be of paramount importance to improve reproductive performance in cows. There is already an agreement that the antral follicle count (AFC; follicles ≥3 mm in diameter) is a highly variable trait among animals, but with high repeatability in the same individual. Thus, females can be classified into low, intermediate or high AFC. Several studies in Bos taurus show a positive correlation between AFC and fertility parameters, such as increased quantity and quality of embryos, better pregnancy rates, higher progesterone levels, among others. However, there is still no consensus on AFC in Bos indicus females and indicus-taurus. This article aims to discuss the main aspects related to the population of antral follicles and its relation to the reproductive performance associated with the most common techniques in assisted reproduction (timed artificial insemination, in vitro embryo production, embryo transfer and superovulation).(AU)