Atividade antiviral e virucida de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente ao herpersvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e ao vírus da diarreia viral bovina (BVDV) / Antiviral and virucidal activity of hydroalcoholic extracts of propolis brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula) against Bovine Herpesvirus Type-1 (BoHV-1) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV)

Dentre as propriedades biológicas da própolis, a atividade antimicrobiana tem merecido destacada atenção. No presente trabalho, descreve-se a ação antiviral e virucida de três extratos hidroalcoólicos de própolis (marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), frente ao Herpesvírus Bovino tipo (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV). Os três extratos hidroalcoólicos foram obtidos de extração etanólica e são oriundos do sul do Brasil. A composição química dos extratos de própolis foi determinada pela cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) que identificou e quantificou compostos como: ácido cafeico e ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico, além de flavonoides como a rutina. A toxicidade celular bem como a atividade antiviral dos extratos de própolis em monocamadas de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) foi avaliada através de observação microscópica e quantificada pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo). O extrato de própolis de abelhas jataí demonstrou ser menos citotóxico (1,57µg/mL), quando comparado aos extratos verde (0,78µg/mL) e marrom (0,39µg/mL). Quanto a atividade antiviral, a própolis verde demostrou maior eficácia em ambos os tratamentos celulares (pós e pré-exposição) frente ao BoHV-1 em relação aos outros extratos, ou seja, houve maior viabilidade celular quando comparada aos controles de células e vírus. Já a de jataí apresentou atividade frente aos dois vírus (BoHV-1 e BVDV) no método pré-infecção, enquanto a própolis marrom demonstrou ação apenas frente ao BoHV-1 também no método pré-infecção. Para determinação da atividade virucida foram utilizadas diferentes diluições dos vírus, bem como temperaturas e tempos distintos de incubação. A própolis verde a 37°C propiciou a maior redução no título viral (4,33log) em relação a marrom (log = 3,5log) e de jataí (log = 3,24log). No entanto, frente ao BVDV a própolis jataí apresentou os melhores resultados em ambas as temperaturas (22oC e 37oC). Portanto, os extratos avaliados apresentaram atividade antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e BVDV, o que os torna alvo para o desenvolvimento de novos biofármacos como alternativa ao uso de antivirais comerciais em Medicina Veterinária.(AU)

Among the biological properties of propolis, the antimicrobial activity has received prominent attention. In this paper, we describe the antiviral and virucidal effect of three hydroalcoholic extracts of propolis (brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula), against bovine herpesvirus type-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea Virus (BVDV). All hydroalcoholic extracts were obtained from ethanol extraction. The chemical composition of propolis extracts was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometer (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) to identify and quantify compounds such as caffeic acid and p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic, and flavonoids such as rutin. Cell toxicity and antiviral activity of propolis extracts in monolayers of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney) were assessed by microscopic observation and quantified by the MTT assay (3- (4.5 dimethylthiazol-2yl) -2- 5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine). Propolis extract from Jataí bees proved to be less cytotoxic (1.57mg / ml) when compared to green extracts (0.78mg / ml) and brown (0.39mg/mL). Regarding antiviral activity, propolis has shown greater efficacy in both cellular treatments (post and pre-exposure) against BoHV-1 when compared to other extracts, ie, there was increased cell viability compared to cell and virus controls. Extracts from Jataí showed activity against both viruses (BoHV-1 and BVDV) infection in the pre-test, whereas brown propolis demonstrated action only against the BoHV-1 in the pre-infection method. To determine the virucidal activity, it were used different dilutions of virus, as well as different temperatures and incubation times. The green propolis at 37°C led to a greater reduction in viral titer (4.33log) compared to brown (3.5log) and jataí (3.24log). Jataí propolis showed the best results in both temperatures (22oC and 37oC) when tested against BVDV. In summary, the evaluated extracts showed antiviral and virucidal activity against BoHV-1 and BVDV, and may be important targets for the development of new compounds as an alternative to commercial antivirals.(AU)

Atividade antiviral e virucida de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente ao herpersvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e ao vírus da diarreia viral bovina (BVDV) / Antiviral and virucidal activity of hydroalcoholic extracts of propolis brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula) against Bovine Herpesvirus Type-1 (BoHV-1) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV)

Dentre as propriedades biológicas da própolis, a atividade antimicrobiana tem merecido destacada atenção. No presente trabalho, descreve-se a ação antiviral e virucida de três extratos hidroalcoólicos de própolis (marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), frente ao Herpesvírus Bovino tipo (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV). Os três extratos hidroalcoólicos foram obtidos de extração etanólica e são oriundos do sul do Brasil. A composição química dos extratos de própolis foi determinada pela cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) que identificou e quantificou compostos como: ácido cafeico e ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico, além de flavonoides como a rutina. A toxicidade celular bem como a atividade antiviral dos extratos de própolis em monocamadas de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) foi avaliada através de observação microscópica e quantificada pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo). O extrato de própolis de abelhas jataí demonstrou ser menos citotóxico (1,57µg/mL), quando comparado aos extratos verde (0,78µg/mL) e marrom (0,39µg/mL). Quanto a atividade antiviral, a própolis verde demostrou maior eficácia em ambos os tratamentos celulares (pós e pré-exposição) frente ao BoHV-1 em relação aos outros extratos, ou seja, houve maior viabilidade celular quando comparada aos controles de células e vírus. Já a de jataí apresentou atividade frente aos dois vírus (BoHV-1 e BVDV) no método pré-infecção, enquanto a própolis marrom demonstrou ação apenas frente ao BoHV-1 também no método pré-infecção. Para determinação da atividade virucida foram utilizadas diferentes diluições dos vírus, bem como temperaturas e tempos distintos de incubação. A própolis verde a 37°C propiciou a maior redução no título viral (4,33log) em relação a marrom (log = 3,5log) e de jataí (log = 3,24log). No entanto, frente ao BVDV a própolis jataí apresentou os melhores resultados em ambas as temperaturas (22oC e 37oC). Portanto, os extratos avaliados apresentaram atividade antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e BVDV, o que os torna alvo para o desenvolvimento de novos biofármacos como alternativa ao uso de antivirais comerciais em Medicina Veterinária.(AU)

Among the biological properties of propolis, the antimicrobial activity has received prominent attention. In this paper, we describe the antiviral and virucidal effect of three hydroalcoholic extracts of propolis (brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula), against bovine herpesvirus type-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea Virus (BVDV). All hydroalcoholic extracts were obtained from ethanol extraction. The chemical composition of propolis extracts was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometer (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) to identify and quantify compounds such as caffeic acid and p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic, and flavonoids such as rutin. Cell toxicity and antiviral activity of propolis extracts in monolayers of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney) were assessed by microscopic observation and quantified by the MTT assay (3- (4.5 dimethylthiazol-2yl) -2- 5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine). Propolis extract from Jataí bees proved to be less cytotoxic (1.57mg / ml) when compared to green extracts (0.78mg / ml) and brown (0.39mg/mL). Regarding antiviral activity, propolis has shown greater efficacy in both cellular treatments (post and pre-exposure) against BoHV-1 when compared to other extracts, ie, there was increased cell viability compared to cell and virus controls. Extracts from Jataí showed activity against both viruses (BoHV-1 and BVDV) infection in the pre-test, whereas brown propolis demonstrated action only against the BoHV-1 in the pre-infection method. To determine the virucidal activity, it were used different dilutions of virus, as well as different temperatures and incubation times. The green propolis at 37°C led to a greater reduction in viral titer (4.33log) compared to brown (3.5log) and jataí (3.24log). Jataí propolis showed the best results in both temperatures (22oC and 37oC) when tested against BVDV. In summary, the evaluated extracts showed antiviral and virucidal activity against BoHV-1 and BVDV, and may be important targets for the development of new compounds as an alternative to commercial antivirals.(AU)

Atividade antiviral e virucida de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente ao herpersvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e ao vírus da diarreia viral bovina (BVDV)

ABSTRACT: Among the biological properties of propolis, the antimicrobial activity has received prominent attention. In this paper, we describe the antiviral and virucidal effect of three hydroalcoholic extracts of propolis (brown, green and jataí bees (Tetragonisca angustula), against bovine herpesvirus type-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea Virus (BVDV). All hydroalcoholic extracts were obtained from ethanol extraction. The chemical composition of propolis extracts was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometer (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) to identify and quantify compounds such as caffeic acid and p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic, and flavonoids such as rutin. Cell toxicity and antiviral activity of propolis extracts in monolayers of MDBK cells (Madin-Darby Bovine Kidney) were assessed by microscopic observation and quantified by the MTT assay (3- (4.5 dimethylthiazol-2yl) -2- 5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine). Propolis extract from Jataí bees proved to be less cytotoxic (1.57mg / ml) when compared to green extracts (0.78mg / ml) and brown (0.39mg/mL). Regarding antiviral activity, propolis has shown greater efficacy in both cellular treatments (post and pre-exposure) against BoHV-1 when compared to other extracts, ie, there was increased cell viability compared to cell and virus controls. Extracts from Jataí showed activity against both viruses (BoHV-1 and BVDV) infection in the pre-test, whereas brown propolis demonstrated action only against the BoHV-1 in the pre-infection method. To determine the virucidal activity, it were used different dilutions of virus, as well as different temperatures and incubation times. The green propolis at 37°C led to a greater reduction in viral titer (4.33log) compared to brown (3.5log) and jataí (3.24log). Jataí propolis showed the best results in both temperatures (22oC and 37oC) when tested against BVDV. In summary, the evaluated extracts showed antiviral and virucidal activity against BoHV-1 and BVDV, and may be important targets for the development of new compounds as an alternative to commercial antivirals.

RESUMO: Dentre as propriedades biológicas da própolis, a atividade antimicrobiana tem merecido destacada atenção. No presente trabalho, descreve-se a ação antiviral e virucida de três extratos hidroalcoólicos de própolis (marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), frente ao Herpesvírus Bovino tipo (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV). Os três extratos hidroalcoólicos foram obtidos de extração etanólica e são oriundos do sul do Brasil. A composição química dos extratos de própolis foi determinada pela cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (UFLC-PDA-ESI-TOF/MS) que identificou e quantificou compostos como: ácido cafeico e ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico, além de flavonoides como a rutina. A toxicidade celular bem como a atividade antiviral dos extratos de própolis em monocamadas de células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) foi avaliada através de observação microscópica e quantificada pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo). O extrato de própolis de abelhas jataí demonstrou ser menos citotóxico (1,57g/mL), quando comparado aos extratos verde (0,78g/mL) e marrom (0,39g/mL). Quanto a atividade antiviral, a própolis verde demostrou maior eficácia em ambos os tratamentos celulares (pós e pré-exposição) frente ao BoHV-1 em relação aos outros extratos, ou seja, houve maior viabilidade celular quando comparada aos controles de células e vírus. Já a de jataí apresentou atividade frente aos dois vírus (BoHV-1 e BVDV) no método pré-infecção, enquanto a própolis marrom demonstrou ação apenas frente ao BoHV-1 também no método pré-infecção. Para determinação da atividade virucida foram utilizadas diferentes diluições dos vírus, bem como temperaturas e tempos distintos de incubação. A própolis verde a 37°C propiciou a maior redução no título viral (4,33log) em relação a marrom (log = 3,5log) e de jataí (log = 3,24log). No entanto, frente ao BVDV a própolis jataí apresentou os melhores resultados em ambas as temperaturas (22oC e 37oC). Portanto, os extratos avaliados apresentaram atividade antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e BVDV, o que os torna alvo para o desenvolvimento de novos biofármacos como alternativa ao uso de antivirais comerciais em Medicina Veterinária.

Caracterização dos isolados bacteriocinogênicos Enterococcus hirae e Pediococcus pentosaceus obtidos de queijo artesanal e suas bacteriocinas

Os produtos lácteos possuem uma microbiota autóctone bastante diversificada, na qual o grupo das Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é de notável relevância devido às suas características benéficas, tecnológicas e bioconservantes, atraindo o interesse para sua utilização em diversos segmentos biotecnológicos, em especial na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar BAL bacteriocinogênicas de queijos artesanais, caracterizando aspectos ligados à produção e purificação das bacteriocinas, inocuidade, potencial benéfico dos isolados e propriedades inibitórias contra Listeria spp. As cepas bacteriocinogênicas Enterococcus hirae ST57ACC e Pediococcus pentosaceus ST65ACC foram isoladas a partir da técnica de tripla camada e identificadas por metodologias fenotípicas e moleculares. As bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC demostraram estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, e foram inativadas após tratamento com enzimas proteolíticas, comprovando sua natureza proteica. Tratamentos com EDTA, SDS, NaCl e Tween 80 não afetaram a atividade das bacteriocinas. Os sobrenadantes de ambos os isolados foram capazes de inibir Listeria innocua e diversas cepas de L. monocytogenes pertencentes à diferentes sorogrupos e obtidas de fontes distintas, inibindo completamente o desenvolvimento de L. monocytogenes após 12 h. Em co-culturas das cepas bacteriocinogênicas com a cepa indicadora L. monocytogenes 422 em leite desnatado, observou-se que E. hirae ST57ACC foi capaz de controlar a multiplicação do patógeno após 48 h. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus não apresentaram resultados positivos para 25 genes relacionados a bacteriocinas conhecidas, indicando que podem produzir novas bacteriocinas. As cepas de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram também avaliadas quanto ao seu potencial benéfico e segurança: ambos os isolados permaneceram viáveis após tratamento em condições gastrointestinais simuladas, exibindo altos níveis de auto e co-agregação com L. monocytogenes e níveis variados de hidrofobicidade, demonstrando que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC podem prevenir potencialmente o estabelecimento de infecções pelo patógeno. Por meio da metodologia de agar-spot, avaliou-se a possibilidade de interferência de 33 medicamentos comerciais, de diferentes grupos sobre a multiplicação de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC, revelando que apenas antiinflamatórios e medicamentos contendo loratadina e cloridrato de propranolol apresentaram atividade inibitória sobre as cepas. Testes fenotípicos para determinação da susceptibilidade antimicrobiana demonstraram que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram resistentes à vancomicina, oxacilina e sulfa/trimetoprim dentre os 11 antibióticos testados pelo método de disco difusão. Com relação à PCR, poucos genes relacionados à resistência a antibióticos foi foram identificados. Nenhum dos isolados amplificou genes de produção de aminas biogênicas e nem apresentou produção das mesmas. A expressão de diferentes elementos do sistema de transporte ABC e metabolismo de açúcares foi identificada para ambos os isolados. Variações na proporção de inóculo não influenciaram a taxa de multiplicação de E. hirae ST57ACC nem de P. pentosaceus ST65ACC, no entanto, a produção de bacteriocinas foi detectada apenas 9 horas após a inoculação das cepas, quando inoculadas nas proporções de 5% e 10%. Adicionalmente, verificou-se que a densidade celular das cepas bacteriocinogênicas esteve correlacionada à produção de bacteriocinas em sistemas de fermentação tradicional e fermentação com controle de pH a 5,5 e agitação. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram capazes de se multiplicar e produzir bacteriocinas na presença de xilo-oligossacarídeos após 6 horas de incubação, porém em níveis reduzidos quando comparados ao cultivo em meio MRS. Por fim, as bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram purificadas a partir de diferentes metodologias. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus ST65ACC foi purificada em duas etapas, com rendimento final de 101,33 revelandose um peptídeo com massa molecular de 3,5 a 8,5 kDa, determinado por SDS-PAGE. Em contrapartida, um protocolo de três etapas foi empregado na purificação da bacteriocina produzida por E. hirae ST57ACC, com rendimento final de 3,05. Adicionalmente, uma fração semi-purificada foi testada com a linhagem celular HT29, demonstrando que a bacteriocina não apresenta efeitos citotóxicos contra células humanas, sendo considerada segura neste aspecto. Os dados obtidos neste trabalho indicam que os isolados E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST57ACC podem ser considerados importantes ferramentas biotecnológicas na produção de bacteriocinas de interesse ao controle de L. monocytogenes e na biopreservação de alimentos.

Dairy products present a rich and diverse autochthonous microbiota, in which Lactic Acid Bacteria (LAB) are relevant, due to their beneficial, technological and biopreservative features, attracting the interest for their biotechnological application, in food industry, pharmaceutic area and human and veterinary medicine fields. The aim of this study was to isolate and to identify bacteriocinogenic LAB from artisanal cheeses, characterizing some aspects linked to bacteriocin production and purification, safety and beneficial potential of the isolates, as well as their inhibitory properties against Listeria spp. Bacteriocinogenic strains Enterococcus hirae ST57ACC and Pediococcus pentosaceus ST65ACC were isolated by using the triplelayer technique and identified by phenotypical and molecular methods. Bacteriocins produced by E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were stable in a wide range of pH and temperature, losing their activity after treatment with proteolytic enzymes, confirming their proteinaceous nature. Treatments with EDTA, SDS, NaCl and Tween 80 did not affect bacteriocin activity. Cell-free supernatants from both isolates were able to inhibit Listeria innocua and several L. monocytogenes strains, from different serogroups obtained from diverse sources, eliminating L. monocytogenes after 12 h. In co-culture experiments conducted in skimmed milk with the bacteriocinogenic isolates and the target strain L. monocytogenes 422, E. hirae ST57ACC controlled the target strain growth after 48 h. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC did not present positive results for 25 known bacteriocin related genes, indicating that they might express new bacteriocins. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC were also evaluated for their beneficial and safety features: both isolates remained viable after treatment replicating gastrointestinal conditions, showing high levels of auto and co-aggregation with L. monocytogenes and diverse levels of hydrophobicity, demonstrating that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC might prevent the establishment of infections caused by this pathogen. Interference of 33 commercial drugs from different groups on growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC was tested by agar-spot method, revealing that only anti-inflammatories and drugs xv containing loratadine and propranolol hydrochloride influenced the growth of bacteriocinogenic strains. Phenotypical tests employed to determine antibiotic susceptibility have shown that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were resistant to vancomycin, oxacillin and sulfa/trimethoprim out of 11 antibiotics tested by disk-diffusion test, nonetheless low number of antibiotic resistance genes was observed by PCR analysis. None of the isolates amplified biogenic amines encoding genes neither presented phenotypical evidence of their production. Expression of different ABC transporters linked to bacteriocin export and sugar metabolism was detected, for both isolates. Changes in inoculum size did not influenced the growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC; however, bacteriocin production was affected, and bacteriocins were detected only after 9 h with inoculation at 5% and 10% of bacteriocinogenic strains. Additionally, it was observed that cell density of both bacteriocinogenic strains was linked to bacteriocin production in traditional and pH at 5.5 and agitation controlled fermentation continuous. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were capable to grow and produce bacteriocins in the presence of xylo-oligossacharides after 6 h of incubation, but in lower levels than those obtained with cultivation in MRS broth. Finally, E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were purified from different methods. The bacteriocin produced by P. pentosaceus ST65ACC was purified in two-steps, with final yield of 101.33, recognized as a 3.5 to 8.5 kDa peptide, determined by Tricine-SDS-PAGE. In contrast, a three-step-protocol was used to purify the bacteriocin produced by E. hirae ST57ACC, with final yield of 3.05. Moreover, a semi-purified fraction of E. hirae ST57ACC bacteriocin was tested in HT-29 cell-line, demonstrating no-cytotoxic effects in human cells, which means the bacteriocin can be considered safe in this aspect. Obtained data from this study indicate that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST57ACC may be considered as important biotechnological tools for bacteriocin production to control L. monocytogenes and as biopreservatives in food.

In vitro evaluation of the antiviral potential of Guettarda angelica against animal herpesviruses / Avaliação in vitro do potencial antiviral de Guettarda angelica contra herpesvírus animais

Background: The number of antiviral studies using plant extracts has increased in the last decades, and the results have shown that plants are potential sources of compounds that are able to inhibit and/or decrease viral infections. The selection of these plants by ethnopharmacological criteria increases the probability of fi nding new substances with signifi cant pharmacological and biological activities. Hence, Brazil has an advantage in this area due to its extensive biodiversity and ethnological diversity. Guettarda angelica is a plant from the Brazilian Caatinga region the roots of which are popularly used for various therapeutic purposes, including veterinary use. The aim of this work was to investigate the in vitro antiviral activity of extracts of plant parts from G. angelica against three animal herpesviruses: bovine (BoHV-1), suid (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses type 1.Materials, Methods & Results: The extracts of roots, leaves and seeds of G. angelica were initially screened for in vitro antiviral activity against these herpesviruses using the virus yield reduction assay. The MDBK cells were used in assays with BoHV-1 and SuHV-1, and the Vero cells with EHV-1. For these assays, the cells previously treated with the extracts in non-cytotoxic concentrations were inoculated with logarithmic dilutions of each virus. The viral inhibitory activity of extracts

Background: The number of antiviral studies using plant extracts has increased in the last decades, and the results have shown that plants are potential sources of compounds that are able to inhibit and/or decrease viral infections. The selection of these plants by ethnopharmacological criteria increases the probability of fi nding new substances with signifi cant pharmacological and biological activities. Hence, Brazil has an advantage in this area due to its extensive biodiversity and ethnological diversity. Guettarda angelica is a plant from the Brazilian Caatinga region the roots of which are popularly used for various therapeutic purposes, including veterinary use. The aim of this work was to investigate the in vitro antiviral activity of extracts of plant parts from G. angelica against three animal herpesviruses: bovine (BoHV-1), suid (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses type 1.Materials, Methods & Results: The extracts of roots, leaves and seeds of G. angelica were initially screened for in vitro antiviral activity against these herpesviruses using the virus yield reduction assay. The MDBK cells were used in assays with BoHV-1 and SuHV-1, and the Vero cells with EHV-1. For these assays, the cells previously treated with the extracts in non-cytotoxic concentrations were inoculated with logarithmic dilutions of each virus. The viral inhibitory activity of extracts

Avaliação in vitro do potencial antiviral de Guettarda angelica contra herpesvírus animais / In vitro evaluation of the antiviral potential of Guettarda angelica against animal herpesviruses

Background: The number of antiviral studies using plant extracts has increased in the last decades, and the results have shown that plants are potential sources of compounds that are able to inhibit and/or decrease viral infections. The selection of these plants by ethnopharmacological criteria increases the probability of fi nding new substances with significant pharmacological and biological activities. Hence, Brazil has an advantage in this area due to its extensive biodiversity and ethnological diversity. Guettarda angelica is a plant from the Brazilian Caatinga region the roots of which are popularly used for various therapeutic purposes, including veterinary use. The aim of this work was to investigate the in vitro antiviral activity of extracts of plant parts from G. angelica against three animal herpesviruses: bovine (BoHV-1), suid (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses type 1. Materials, Methods & Results: The extracts of roots, leaves and seeds of G. angelica were initially screened for in vitro antiviral activity against these herpesviruses using the virus yield reduction assay. The MDBK cells were used in assays with BoHV-1 and SuHV-1, and the Vero cells with EHV-1. For these assays, the cells previously treated with the extracts in non-cytotoxic concentrations were inoculated with logarithmic dilutions of each virus. The viral inhibitory activity of extracts was calculated by difference of virus titer between treated infected cells and non-treated infected cells. Only the aqueous extract from seeds (AEs) showed a significant antiviral activity (P < 0.01, ANOVA followed by Tukey test) against all herpesviruses leading continuous studies. Thus, the selectivity index (SI) of this extract was determined by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] colorimetric assay by calculating the ratio CC50 over IC50. The 50% cytotoxic concentration (CC50) was defined as the extract concentration that reduced the cell viability by 50% when compared to untreated controls; the 50% inhibitory concentration (IC50) was defined as the concentration of the extract that inhibited 50% of viral replication when compared to the virus control. The CC50 and IC50 were obtained from nonlinear regression analysis of concentration-effect curves by the GraphPad Prism 5 Demo program and represented the means ± standard deviation of three independent experiments. The CC50 for Vero cells was 400.60 ± 0.20 µg/mL, while the CC50 for MDBK cells was 920.50 ± 0.19 µg/mL. The IC50 values of the AEs on the BoHV-1, SuHV-1 and EHV-1 were 22.79 µg/mL, 91.30 µg/mL and 19.95 µg/mL, respectively. The SI values of this extract for each virus obtained from these data were 40.39, 10.08 and 20.08 for BoHV-1, SuHV-1, and EHV-1, respectively. Discussion: To ensure the antiviral activity of a plant extract and consequently its future use as antiviral agent is crucial the obtainment of its selectivity index or safety index. It is guarantee of a true antiviral effect and not the result of cytotoxicity of the extract on cells, and that could be confused with an antiviral activity. Other important point are the extract IC50 values less than 100 µg/mL. The results of the AEs of G. angelica are in accordance with these considerations indicating that the G. angelica seeds may be a potential source of antiviral compounds insurance and encouraging further investigation of them.

Atividade antimicrobiana de extratos hidroalcoólicos de própolis marrom, verde e de abelhas Jataí (Tetragonisca angustula) frente a micro-organismos infecciosos de interesse em Medicina Veterinária e Humana

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana (antibacteriana, antifúngica e antiviral), toxicidade celular e composição química de extratos hidroalcoólicos da própolis marrom (PM), verde (PV) e de abelhas nativas jataí (PJ). A atividade antibacteriana da própolis foi analisada pelo método de Microdiluição frente à Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli. Para a atividade antifúngica, foi utilizada metodologia semelhante, frente à Candida lipolytica, Candida parapsilosis, Sporothrix schenckii e Sporothrix brasiliensis. A atividade antiviral foi avaliada através de dois métodos distintos de tratamento das células com os extratos: antes e depois da inoculação viral, frente ao Herpes Vírus Bovino (BoHV-1) e ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) e quantificado pelo teste de MTT (3-(4,5 dimetiltiazol2yl)- 2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo) e a atividade virucida, avaliada através de diferentes diluições dos vírus, temperaturas e tempos de incubações e analisadas por observação microscópica e quantificadas através da Dose Infectante (D.I.) 50%. A toxicidade foi avaliada através de diferentes concentrações e a viabilidade celular quantificada por MTT. À composição química das própolis foi determinada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Os resultados da atividade antibacteriana demonstraram que PM obteve valores menores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM), quando testados frente à S. aureus (6,7 mg/mL; 13,4 mg/mL, respectivamente), e E. coli (29,4 mg/mL; 54,3 mg/mL) quando comparados ao PV e PJ. Contudo frente Streptococcus sp., os menores valores de CIM e CBM encontrados foram da PV (p<0,01). Na atividade antifúngica as PM, PV e PJ apresentaram eficácia à Candida sp. eSporotrix sp. A PJ apresentou menor toxicidade, em sequência PV e PM. Na atividade antiviral, os extratos foram mais eficazes quando acrescentados no pré-tratamento e a PM e PV foram mais eficazes ao BoHV-1, enquanto a PJ ao BVDV. Na virucida, a PVa 37°C obteve valores diferentes e menores (log = 2,67) em relação a PM (log = 3,5) e PJ (log = 3,76). No entanto, para BVDV a PJ apresentou os melhores resultados para ambas temperaturas. Os resultados demonstram o potencial da própolis como antimicrobiano no tratamento de doenças em Medicina Veterinária e Humana.

The objective of this study was to evaluate the antimicrobial activity (antibacterial, antifungal and antiviral), cell toxicity and chemical composition of hydroalcoholic extracts of brown propolis (PM), green (PV) and native bees jataí (PJ). The antibacterial activity of propolis was analyzed by microdilution method against the Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae and Escherichia coli. For the antifungal activity, similar methodology was used, compared to Candida lipolytica, Candida parapsilosis, Sporothrix schenckii and Sporothrix brasiliensis. The antiviral activity was measured using two different methods of treatment of the cells with the extracts: before and after the viral inoculation against Bovine Herpes virus (bovine herpesvirus type 1) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) and quantitated by assaying MTT (3- (4,5 dimethylthiazol-2yl) - 2,5-diphenyl-2H-tetrazolato bromine) and virucidal activity, measured using different dilutions of virus, temperatures and incubation times and analyzed by microscopic observation and quantified by the infective dose (ID) 50%. Toxicity was evaluated using different concentrations and cell viability measured by MTT. In the chemical composition of propolis was determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods. The results demonstrated that the antibacterial activity had lower values PM Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) when tested against S. aureus (6.7 mg/mL; 13.4 mg/mL, respectively) and E. coli (29.4 mg/mL, 54.3 mg/mL) compared to the PV and PJ. However front Streptococcus sp., the lowest values of MIC and MBC were found of PV (p <0.01). In the antifungal activity PM, PV and PJ showed efficacy to Candida sp. and Sporotrix spp. The PJ showed lower toxicity in PV and PM sequence. In the antiviral activity, the extracts were more effective when added in the pre treatment and the PM and PV were more effective in BoHV-1, while the PJ to BVDV. In virucidal, PV obtained at 37°C and under different values (log = 2.67) compared to PM (log = 3.5) and PJ (log = 3.76). However, for BVDV PJ showed the best results for both temperatures. Results show the potential of propolis as an antimicrobial in the treatment of diseases in Veterinary Medicine and Human.

In vitro evaluation of antiviral effect of bauer-7-en-3b-yl acetate, the major constituent of a sample of Brazilian propolis, against Alphaherpesviruses / Avaliação in vitro do efeito antiviral do acetato de bauer-7-en-3b -ILA, o principal constituinte de uma amostra de própolis brasileira, contra o alphaherpesvirus

There is an increasing need for substances with antiviral activity since the treatment of viral infections with most antivirals is often unsatisfactory due to the problem of, amongst other things, viral latency and the likelihood of new viral agents arising. Previously we isolated bauer-7-en-3b-yl acetate (BA), a pentacyclic triterpenoid obtained from the chloroform extract of an sample of propolis from southeast Brazil (TEIXEIRA, et al., 2006). Here we investigated the antiviral activity of BA against the alphaherpesviruses bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and pseudorabiesvirus (SuHV-1, suid herpesvirus) during infection of Madin-Darby bovine kidney (MDBK) and African green monkey kidney (VERO) cells cultures, respectively. In short, BA was tested for its cytotoxic properties and antiviral effect through virus yield reduction and virucidal activity in both cells. Results showed that BA 20µg mL-1 and 15µg mL-1 were the maximal non-cytotoxic concentration (MNCC) to VERO and MDBK cells, respectively. BA reduced significantly SuHV-1 titrers in both antiviral tests (p 0.05) while inhibition was not observed against BoHV-1. However, how BA interferes on the virus multiplication still need to be elucidated.

O crescente interesse na busca por substâncias que apresentem atividade antiviral se deve, entre outros fatores, à dificuldade de tratamento de infecções virais, tanto em virtude da característica de latência viral quanto pelo surgimento de novos vírus. O triterpenóide acetato de bauer-7-en-3b-ila (BA) foi previamente isolado do extrato clorofórmico de uma amostra de própolis coletada em Minas Gerais, região sudeste do Brasil (TEIXEIRA et al., 2006). A atividade antiviral desta substância contra o herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e o herpesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1) foi investigada através da infecção de culturas de células de rim bovino (MDBK) e de células de rim de macaco verde africano (VERO). O efeito citotóxico do triterpenóide foi previamente avaliado e as concentrações máximas não tóxicas foram 20µg mL-1 e 15µg mL-1 para células VERO e MDBK, respectivamente. Os resultados mostraram atividade antiviral contra SuHV-1 (p 0,05), porém não contra BoHV-1. Todavia, a forma como o BA interfere na multiplicação do SuHV-1 ainda precisa ser elucidada.

Antiviral activity of Agaricus blazei Murrill ss. Heinem extract against human and bovine herpesviruses in cell culture

The aqueous extract of Agaricus blazei Murill ss. Heinem, a basidiomycete native from Brazil, frequently used by popular medicine, mainly in the form of tea, was assessed to its antiviral action against herpes simplex type 1 (HSV-1) and bovine herpes type 1 (BoHV-1) in HEp-2 cell culture. Viral replication inhibition was evaluated by plaque assay and immunofluorescence test. The extract demonstrated virucide action for both viruses, being more effective against HSV-1, inhibiting its infectivity in 78.4 and 73.9% at the concentrations of 50 and 100 µg/mL, respectively moreover, reduction in 47% the number of fluorescent cells was observed for both concentrations. The extract also showed discrete therapeutic activity. These results suggest that A. blazei extract acts mainly in the viral particle, however, the effect during virus replication can not be ruled out.

O extrato aquoso de Agaricus blazei Murill ss. Heinem, um basidiomiceto nativo do Brasil, usado na medicina popular, na forma de chá, foi avaliado quanto suas propriedades antivirais contra herpes simplex tipo 1 (HSV-1) e herpes bovino tipo 1 (BoHV-1) em cultura de células HEp-2. A inibição da replicação viral foi monitorada pelos ensaio de placa e reação de imunofluorescência. O extrato apresentou atividade virucida mais efetiva do que terapêutica para ambos os vírus, sendo mais efetivo portanto para HSV-1, inibindo em mais de 70% o número de plaques e em cerca de 47% o número de células apresentando fluorescência específica, nas concentrações de 50 e 100 µg/mL, nas duas técnicas utilizadas. Os resultados obtidos sugerem que o extrato aquoso de A. blazei deve agir principalmente sobre a partícula viral, embora a inibição durante o ciclo replicativo do vírus não deva ser excluída.

In vitro evaluation of antiviral effect of bauer-7-en-3b-yl acetate, the major constituent of a sample of Brazilian propolis, against Alphaherpesviruses / Avaliação in vitro do efeito antiviral do acetato de bauer-7-en-3b -ILA, o principal constituinte de uma amostra de própolis brasileira, contra o alphaherpesvirus

There is an increasing need for substances with antiviral activity since the treatment of viral infections with most antivirals is often unsatisfactory due to the problem of, amongst other things, viral latency and the likelihood of new viral agents arising. Previously we isolated bauer-7-en-3b-yl acetate (BA), a pentacyclic triterpenoid obtained from the chloroform extract of an sample of propolis from southeast Brazil (TEIXEIRA, et al., 2006). Here we investigated the antiviral activity of BA against the alphaherpesviruses bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and pseudorabiesvirus (SuHV-1, suid herpesvirus) during infection of Madin-Darby bovine kidney (MDBK) and African green monkey kidney (VERO) cells cultures, respectively. In short, BA was tested for its cytotoxic properties and antiviral effect through virus yield reduction and virucidal activity in both cells. Results showed that BA 20µg mL-1 and 15µg mL-1 were the maximal non-cytotoxic concentration (MNCC) to VERO and MDBK cells, respectively. BA reduced significantly SuHV-1 titrers in both antiviral tests (p 0.05) while inhibition was not observed against BoHV-1. However, how BA interferes on the virus multiplication still need to be elucidated.

O crescente interesse na busca por substâncias que apresentem atividade antiviral se deve, entre outros fatores, à dificuldade de tratamento de infecções virais, tanto em virtude da característica de latência viral quanto pelo surgimento de novos vírus. O triterpenóide acetato de bauer-7-en-3b-ila (BA) foi previamente isolado do extrato clorofórmico de uma amostra de própolis coletada em Minas Gerais, região sudeste do Brasil (TEIXEIRA et al., 2006). A atividade antiviral desta substância contra o herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e o herpesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1) foi investigada através da infecção de culturas de células de rim bovino (MDBK) e de células de rim de macaco verde africano (VERO). O efeito citotóxico do triterpenóide foi previamente avaliado e as concentrações máximas não tóxicas foram 20µg mL-1 e 15µg mL-1 para células VERO e MDBK, respectivamente. Os resultados mostraram atividade antiviral contra SuHV-1 (p 0,05), porém não contra BoHV-1. Todavia, a forma como o BA interfere na multiplicação do SuHV-1 ainda precisa ser elucidada.

In vitro evaluation of the antiviral potential of Guettarda angelica against animal herpesviruses / Avaliação in vitro do potencial antiviral de Guettarda angelica contra herpesvírus animais

Background: The number of antiviral studies using plant extracts has increased in the last decades, and the results have shown that plants are potential sources of compounds that are able to inhibit and/or decrease viral infections. The selection of these plants by ethnopharmacological criteria increases the probability of fi nding new substances with signifi cant pharmacological and biological activities. Hence, Brazil has an advantage in this area due to its extensive biodiversity and ethnological diversity. Guettarda angelica is a plant from the Brazilian Caatinga region the roots of which are popularly used for various therapeutic purposes, including veterinary use. The aim of this work was to investigate the in vitro antiviral activity of extracts of plant parts from G. angelica against three animal herpesviruses: bovine (BoHV-1), suid (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses type 1.Materials, Methods & Results: The extracts of roots, leaves and seeds of G. angelica were initially screened for in vitro antiviral activity against these herpesviruses using the virus yield reduction assay. The MDBK cells were used in assays with BoHV-1 and SuHV-1, and the Vero cells with EHV-1. For these assays, the cells previously treated with the extracts in non-cytotoxic concentrations were inoculated with logarithmic dilutions of each virus. The viral inhibitory activity of extracts

Background: The number of antiviral studies using plant extracts has increased in the last decades, and the results have shown that plants are potential sources of compounds that are able to inhibit and/or decrease viral infections. The selection of these plants by ethnopharmacological criteria increases the probability of fi nding new substances with signifi cant pharmacological and biological activities. Hence, Brazil has an advantage in this area due to its extensive biodiversity and ethnological diversity. Guettarda angelica is a plant from the Brazilian Caatinga region the roots of which are popularly used for various therapeutic purposes, including veterinary use. The aim of this work was to investigate the in vitro antiviral activity of extracts of plant parts from G. angelica against three animal herpesviruses: bovine (BoHV-1), suid (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses type 1.Materials, Methods & Results: The extracts of roots, leaves and seeds of G. angelica were initially screened for in vitro antiviral activity against these herpesviruses using the virus yield reduction assay. The MDBK cells were used in assays with BoHV-1 and SuHV-1, and the Vero cells with EHV-1. For these assays, the cells previously treated with the extracts in non-cytotoxic concentrations were inoculated with logarithmic dilutions of each virus. The viral inhibitory activity of extracts

Estudo químico e potencial antiviral de Mimosa xanthocentra (Mimosaceae), uma planta da dieta de cervídeos no Pantanal

Mimosa xanthocentra Mart. (dorme-dorme) é uma planta herbácea - pertencente a um gênero medicinal e utilizada na dieta de dois mamíferos ameaçados de extinção no Pantanal (cervos-do-pantanal e veados-campeiros) - para a qual não existem relatos de estudos químicos e biológicos. O presente estudo teve como objetivos conhecer a composição química e avaliar os possíveis efeitos benéficos, in vitro, que poderiam surgir da ingestão dessa planta pelos cervídeos, tendo como enfoque viroses de importância humana e veterinária. O estudo fitoquímico de M. xanthocentra levou à identificação de quatro flavonóides. Foram isoladas duas flavonas, isovitexina-2''-O-ramnopiranosídeo e vitexina-2''-O-ramnopiranosídeo, e uma mistura dos flavonóis avicularina e reinoutrina. Exceto pela avicularina, este é o primeiro relato dos demais flavonóides na família Mimosaceae. A isovitexina-2''-O-ramnopiranosídeo apresentou-se sob a forma de rotâmeros em solução de DMDO-d6, cujas conformações diferem essencialmente no arranjo da unidade dissacarídica em relação ao plano do esqueleto da aglicona. A elucidação estrutural dos flavonóides baseou-se nas análises de RMN de ¹H e 13C, mono e bidimensionais. O extrato aquoso de M. xanthocentra (MxEA) foi avaliado quanto à atividade antiviral, sendo possível evidenciar uma ação inibitória frente a HSV-1, HSV-2, SHV-1 e BHV-1. O fracionamento monitorado pelo ensaio antiviral permitiu a identificação de substâncias de classes químicas diferentes - flavonóides e carboidratos - contribuindo para a atividade antiviral, com destaque para a atividade anti-HSV-1 de isovitexina-2''-O-ramnopiranosídeo (200 microg/ml; 87,4% de inibição). Adicionalmente, verificou-se uma ação sinérgica entre as substâncias presentes em MxEA, o que poderia resultar em efeitos benéficos através do uso dessa espécie vegetal pelos cervídeos. Este é o primeiro relato de atividade antiviral no gênero Mimosa e de atividade anti-HSV de isovitexina-2''-O-ramnopiranosídeo. Os resultados obtidos contribuíram para o conhecimento da composição química e do potencial terapêutico de M. xanthocentra. Este trabalho reflete uma abordagem inovadora e otimista ao buscar substâncias bioativas em uma planta pertencente à dieta de mamíferos não-primatas e sem relato de uso medicinal