Effects of BMP-4 and FSH on growth, morphology and mRNA expression of oocyte-secreted factors in cultured bovine secondary follicles

This study evaluated the effect of different concentrations of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), as well as the interaction of BMP-4 and follicle stimulating hormone (FSH) on growth, ultrastructural integrity, and expression of mRNA for growth differentiation factor-9 (GDF-9), BMP-15, maternal antigen that the embryo requires (Mater) and nucleoplasmin-2 (Npm-2) in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Follicles cultured in the presence of 50 ng/ml BMP-4 had a progressive increase in their diameters with the increase of culture period from 0 to 6 and 12 days, but no significant differences were observed among treatments. The presence of both FSH and BMP-4 in a culture medium did not stimulate follicle growth when compared to the control medium. After 12 days, the percentage of normal follicles was maintained similar to that of day 0 in the medium supplemented with both FSH and BMP-4, but no significant differences among treatments were observed after 18 days of culture. BMP-4 maintained the ultrastructural integrity of follicles after 18 days of culture, while follicles cultured in medium supplemented with FSH or both BMP-4 and FSH had oocyte with irregular zona pellucida, vesicular bodies, and an abundance of vacuoles. Follicles cultured in the presence of BMP-4 had an increase in the levels of BMP-15 mRNA, when compared to those cultured in medium supplemented with FSH alone. In conclusion, the addition of BMP-4 in culture medium contributes to preserve follicular ultrastructure, but BMP-4 did not interact positively with FSH. Regarding secondary follicles cultured in the presence of FSH, BMP-4 increases the expression of mRNA for BMP-15.(AU)

Effects of BMP-4 and FSH on growth, morphology and mRNA expression of oocyte-secreted factors in cultured bovine secondary follicles

This study evaluated the effect of different concentrations of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), as well as the interaction of BMP-4 and follicle stimulating hormone (FSH) on growth, ultrastructural integrity, and expression of mRNA for growth differentiation factor-9 (GDF-9), BMP-15, maternal antigen that the embryo requires (Mater) and nucleoplasmin-2 (Npm-2) in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Follicles cultured in the presence of 50 ng/ml BMP-4 had a progressive increase in their diameters with the increase of culture period from 0 to 6 and 12 days, but no significant differences were observed among treatments. The presence of both FSH and BMP-4 in a culture medium did not stimulate follicle growth when compared to the control medium. After 12 days, the percentage of normal follicles was maintained similar to that of day 0 in the medium supplemented with both FSH and BMP-4, but no significant differences among treatments were observed after 18 days of culture. BMP-4 maintained the ultrastructural integrity of follicles after 18 days of culture, while follicles cultured in medium supplemented with FSH or both BMP-4 and FSH had oocyte with irregular zona pellucida, vesicular bodies, and an abundance of vacuoles. Follicles cultured in the presence of BMP-4 had an increase in the levels of BMP-15 mRNA, when compared to those cultured in medium supplemented with FSH alone. In conclusion, the addition of BMP-4 in culture medium contributes to preserve follicular ultrastructure, but BMP-4 did not interact positively with FSH. Regarding secondary follicles cultured in the presence of FSH, BMP-4 increases the expression of mRNA for BMP-15.

Participação das proteínas morfogenéticas ósseas no crescimento folicular final, ovulação e função luteal

Fatores produzidos no ovário, como os membros da família dos fatores de crescimento transformantes beta (TGF) e seus receptores, exercem papel essencial durante a divergência folicular e ovulação. Interações entre ligantes e seus receptores estão envolvidas em distintas funções ovarianas sob condições fisiológicas ou patológicas. Em especial os fatores produzidos pelos oócitos como a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15) e o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9), desempenham papéis importantes na regulação das funções ovarianas como crescimento e diferenciação folicular. Entretanto, grande parte do conhecimento sobre esses fatores tem sido obtido em modelos in vitro ou através da observação de mutações espontâneas em ovelhas e, apesar da grande relevância, a função destes na fisiologia ovariana ainda é pouco conhecida. Além disso, o papel do sistema TGF na modulação do processo de regressão do corpo lúteo ainda não foi investigado nas espécies domésticas. Neste contexto, esta tese apresenta uma série de estudos acerca da participação de membros da família TGF, em especial das BMPs, na regulação de eventos ovarianos envolvendo o crescimento folicular final, ovulação, formação do corpo lúteo e luteólise. O primeiro estudo trata-se de uma revisão que teve por objetivo reunir a informação disponível na literatura sobre o tema. Posteriormente, um segundo estudo objetivou investigar o nível de transcritos de membros da família TGF e seus receptores durante a luteólise induzida in vivo. Foram utilizadas amostras de corpos lúteos bovinos coletados in vivo nos momentos 0, 2, 12, 24 e 48 h após a administração de uma dose de PGF2 no dia 10 do ciclo estral. Os níveis de RNAm de BMP4, BMP6 e INHBA foram regulados positivamente às 2 h após a administração de PGF2 (P<0,05) em comparação com 0 h. A expressão relativa de RNAm de BMP2, BMP4, ACVR1B, INHBA e INHBB foi regulada positivamente 12 h após a aplicação de PGF2 (P<0,05), enquanto que o TGFBR3 teve uma regulação negativa às 48 h. Coletivamente os dados demonstram que os RNAm de membros da família TGF são regulados pelo tratamento com PGF2, sugerindo um envolvimento no processo de luteólise funcional e morfológica em bovinos. Em um terceiro estudo, objetivou-se determinar o efeito da injeção intrafolicular da BMP15 sobre o crescimento folicular final e ovulação/luteinização. Ainda, avaliou-se o efeito do tratamento com gonadotrofinas em células da granulosa cultivadas in vitro, sobre o nível de transcritos dos receptores da BMP15. Foi realizada a injeções intrafoliculares de BMP15rh nas concentrações de 100 ng/mL, em folículos dominantes, e de 500 ng/mL, em folículos pré-ovulatórios. Os resultados da injeção intrafolicular de BMP15rh demonstram uma tendência (P=0,09) de inibição do crescimento folicular. Já os resultados em folículos pré-ovulatórios suportam a hipótese de um efeito inibitório sobre o crescimento folicular e ovulação, sem inibir a luteinização. Folículos tratados com BMP15 não ovularam e deram origem a estruturas císticas luteinizadas, o que foi confirmado através de dosagens de progesterona sérica. No cultivo das células da granulosa in vitro, a expressão de RNAm de BMPR2 e BMPR1B não foi alterada pelo tratamento com LH ou FSH. Conclui-se que o tratamento com BMP15 inibe o desenvolvimento folicular e a ovulação, induzindo à luteinização e formação de cistos em bovinos. Estudos moleculares futuros são necessários para elucidar os mecanismos de ação da BMP15. Um quarto estudo foi conduzido com o objetivo de validar um método de coleta in vivo de células da granulosa bovinas, para estudos de expressão gênica. Foram testados seis protocolos distintos de separação das células após a coleta, buscando a forma mais adequada para a extração do RNA, sem interferência de outras células eventualmente presentes nas amostras. A partir dos resultados sugerese que o tratamento dos pellets celulares obtidos após aspiração folicular com tampão de lise de eritrócitos possibilita uma melhor qualidade de RNA. Com um protocolo adequado de processamento das células, pode-se dar continuidade à investigação dos efeitos dos fatores foliculares nas células da granulosa in vivo. Coletivamente, os estudos acima descritos, além da gerar conhecimento básico para compreensão do papel dos fatores locais na fisiologia ovariana, podem contribuir no entendimento de processos patológicos e no desenvolvimento de tecnologias que tenham por finalidade a contracepção ou aumento da taxa ovulatória.

Factors produced in the ovary, such as transforming growth factors beta members (TGF) and their receptors, play a key role during follicular deviation and ovulation. The interactions between ligands and receptors are involved in different ovarian functions under physiological or pathological conditions. In particular, factors produced by oocytes such as bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and growth and differentiation factor 9 (GDF9) are involved in the regulation of ovarian functions such as follicular development and differentiation. However, most of the knowledge about these factors has been obtained using in vitro models or through spontaneous mutations in ewes and, despite the great relevance, little is known about the function of the oocyte factors in the ovarian physiology. In addition, the regulation and function of the TGF system in the regression process of the corpus luteum has not been evaluated in domestic species. In this regard, this thesis presents a series of studies about the involvement of TGF family members, specially BMPs, in the regulation of ovarian function including final follicular growth, ovulation, corpus luteum formation and luteolysis. The first study aimed to review the information available in the literature on the regulation and function of TGF family members in ovarian function. The objective of the second study was to investigate mRNA regulation of some TGF family ligands and their receptors during induced-luteolysis in vivo. Cows received an injection of prostaglandin F2 (PGF2) on day 10 of the estrous cycle and luteal samples were obtained at 0, 2, 12, 24 or 48 h after treatment. The mRNA levels of BMP4, BMP6 and INHBA were upregulated at 2 h after administration of PGF2 (P<0.05) in comparison to 0 h. The relative mRNA expression of BMP2, BMP4, ACVR1B, INHBA and INHBB was upregulated at 12 h post PGF2 (P<0.05), whereas TGFBR3 was downregulated at 48 h. Collectively, the findings demonstrate that mRNA encoding several TGF family members are regulated after PGF2 administration in a time-specific manner, which suggests that this system is involved in both functional and morphological luteolysis in cattle. The objective of the third study was to evaluate the effect of BMP15 intrafollicular treatment on final follicular growth, ovulation and luteinization in cattle. Furthermore, it was evaluated the effect of gonadotrophins treatment in granulosa cells in vitro on the levels of transcripts encoding BMP15 receptors. Intrafollicular injections of rhBMP15 were performed at concentrations of 100 ng/mL, in dominant follicles, and 500 ng/mL, in preovulatory follicles. The intrafollicular injection of rhBMP15 tended (P=0.09) to inhibit follicular growth, whereas the treatment of preovulatory follicles support the hypothesis of an inhibitory effect on follicular growth and ovulation, without inhibiting luteinization. Follicles treated with BMP15 did not ovulate and became luteinized cysts, which was confirmed by serum progesterone levels. The mRNA expression of BMPR2 and BMPR1B in granulosa cells in vitro was not altered by the treatment with LH or FSH. In conclusion, the treatment with BMP15 inhibits follicular development and ovulation, inducing luteinization and cysts formation in cattle. Future molecular studies are needed to elucidate the mechanism of action of BMP15. The fourth study was conducted to validate a technique for in vivo granulosa cells collection for gene expression studies. Six different protocols for granulosa cells isolation after follicular aspiration were evaluated aiming to identify the more appropriate procedure to extract RNA without the interference of other cells potentially present in the samples. The results suggest that the treatment of granulosa cells pellets with red blood cell lysis buffer, just after follicular aspiration, allows obtaining samples with higher RNA quality. With a well-validated protocol for cells isolation, it will be possible to continue the investigation of the function of follicular factors on granulosa cells in vivo. Taken together, the above-described studies besides generating basic knowledge to understand the role of local factors in ovarian physiology, may contribute to the understanding of pathological processes and to the development of technologies to promote contraception or to increase ovulation rate.

EFEITO DA PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSSEA 15 (BMP15), DO FATOR DE CRESCIMENTO E DIFERENCIACÃO 9 (GDF9) NA PRESENÇA DE BAIXA OU ALTA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS INCLUSOS EM TECIDO OVARIANO

O objetivo do presente estudo foi investigar a influência da concentração de insulina sobre o efeito da adição do Fator de Crescimento e Diferenciação 9 (GDF9) e a Proteína Morfogenética Óssea 15 (BMP15) isoladamente ou em associação sobre o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos inclusos em tecido ovariano. Fragmentos oriundos de um mesmo par ovariano foram distribuídos aletoriamente para o grupo controle não cultivado ou cultivados in vitro por 7 dias em meios de cultivo contendo baixas (10 ng/mL) ou altas (10 g/mL) concentrações de insulina na ausência de GDF9 e BMP15 isoladamente ou em associação. O tratamento com insulina baixa mostrou uma porcentagem significativamente maior de folículos normais do que o tratamento com insulina alta. A adição de BMP15 sozinho ou em associação com GDF9 ao meio contendo insulina baixa reduziu a percentagem de folículos normais (P <0,05). Contudo, a adição de BMP15 e GDF9 isoladamente ou em associação a um meio de cultivo contendo de insulina alta aumentou significativamente a percentagem de folículos normais. O meio contendo somente insulina baixa ou insulina alta suplementada com BMP15 e BMP15 + GDF9 após sete dias de cultivo mostrou uma maior percentagem de folículos secundários do que o controle não cultivado. Em conclusão, na presença de concentração fisiológica de insulina (10 ng/mL), a suplementação do meio com GDF9 e BMP15 isoladamente ou em combinação não mostrou qualquer vantagem. Entretanto, para a manutenção de um padrão de desenvolvimento folicular (diâmetro nas diferentes categorias) semelhante ao in vivo, a concentração de 10 g/mL de insulina é indicada.

The aim of the present study was to investigate the influence of medium with different insulin levels on the in vitro effect of GDF9 and BMP15 related to the survival and development of caprine preantral follicles enclosed in ovarian tissue. Fragments from the same ovarian pair were randomly assigned to non-cultured control treatment or in vitro cultured for 7 days in -MEM containing 10 ng/mL (Low) or 10 g/mL (High) insulin concentrations in the absence or presence of BMP15 and/or GDF9. Low insulin treatment showed a significant higher percentage of normal follicles than High insulin treatment. The addition of BMP15 alone or in association with GDF9 to the medium containing low insulin reduced (P<0.05) the percentage of normal follicles. However, the addition of BMP15 and GDF9 alone or in association to high insulin medium significantly enhanced the percentage of normal follicles. The medium containing Low insulin alone or High insulin supplemented with BMP15 and BMP15+GDF9 treatments after seven days of culture showed a higher percentage of secondary follicles than noncultured control. In conclusion, in the presence of physiological concentration of insulin (10 ng/mL), the medium supplementation with GDF9 and BMP15 alone or in combination did not showed any advantage. However, for a follicular development close to in vivo scenario, a concentration of 10 g/mL insulin is indicated.

Genes relacionados à prolificidade em uso de programas de conservação e melhoramento de ovinos.

A prolificidade (número de cordeiros nascidos por ovelhas expostas à reprodução) está relacionada à taxa de ovulação e pode ser considerada como um parâmetro importante no aumento da produtividade. Atualmente, a fenotipagem dessa característica só pode ser avaliada em fêmeas em idade reprodutiva e, em geral, apresenta um custo relativamente alto para espécie. No entanto, esta é uma característica controlada por poucos genes de forma que pode ser factível a implementação de esquemas de seleção por marcadores moleculares. Três genes de efeito principal tem sido considerados para explicar grande parte dos fenótipos de partos múltiplos: GDF9, BMP15 e BMPR1- b. O presente trabalho foi executado de forma a aumentar o conhecimento dos polimorfismos existentes nestes genes em raças localmente adaptadas de ovinos bem como avaliar a possibilidade de aplicar conhecimento adquirido em programas de conservação e melhoramento no Brasil. No primeiro experimento, 252 animais da raça Morada Nova provenientes de testes de desempenho do Programa de Melhoramento genético participativo da raça foram genotipados para presença ou ausência do alelo FecGE do gene GDF9, inicialmente descrito apenas na raça Santa Inês. A referida mutação foi identificada em alta frequência na raça Morada Nova e ela não aparenta estar associada a características de produção/crescimento usadas nos testes de desempenho da raça Morada Nova. No segundo experimento, sequências completas dos genes: BMP15, BMPR1-b e GDF9 foram obtidas por dados de sequenciamento de nova geração de 75 ovinos de diferentes raças provenientes do repositório do Consórcio Internacional do Genoma Ovino (ISGC). Foram identificados um total de 1610 SNPs a partir de dados de sequenciamento de nova geração de 75 genomas ovinos. Pelo menos três SNPs foram identificados na região de exon dos genes BMPR1-b e BMP15, que resultaram em alterações não conservativa de aminoácidos e, portanto, são candidatos imediatos a serem testados em raças com históricos de partos múltiplos. A identificação e seleção destes SNPs serão usadas para compor um painel de baixa densidade para a prolificidade e, depois de validados em raças prolíficas com histórico de parto simples e múltiplos, poderão ser usados para otimizar programas de conservação e melhoramento de ovinos.

The prolificacy (number of lambs per sheep exposed to reproduction) is mainly related to ovulation rate and can be considered as an important parameter in sheep productivity. This phenotype can only be evaluated in reproductive age female and still has a reasonable cost. On the other hand, it is know this trait is controlled by few genes and it might be feasible to implement marker assisted selection scheme. Three major genes have been recognized to explain phenotypes related to litter size: GDF9, BMP15 and BMPR1-b. The objective of the present study was to increase the knowledge of existing polymorphisms in genes related to prolificacy in locally adapted sheep breeds and evaluate its use in conservation and breeding programs in Brazil. In the first experiment it was genotyped, for the FecGE mutation (GDF9), 252 Morada Nova animals who participated in breed performance tests The FecGE mutation is not restricted to Santa Ines breed and it was found in high frequency in Morada Nova sheep. In addition, this mutation does not appear to be associated with production traits used on performance tests of Morada Nova sheep breed. The second experiment was analyze the complete sequence of genes: BMP15, BMPR1-b and GDF9 from 75 sheep of different breeds from the International Consortium repository Genome Ovine (ISGC). It was identified a total of 1610 SNPs from 75 sheep genomes. Three SNPs from BMP15, BMPR1-b genes change in non-conservative amino acid. The identification and selection of these SNPs will be used to develop a low density panel for prolificacy that might be applied to conservation and breeding programs.

Papel da Proteína Morfogenética Óssea 15 (BMP-15) e Kit Ligand (KL) na regulação da foliculogênese em mamíferos / Role of Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP-15) and Kit Ligand (KL) in the regulation of folliculogenesis in mammalian

A foliculogênese é coordenada por diversos fatores de crescimento e hormônios responsáveis por garantir o sucesso do desenvolvimento folicular e oocitário. Para a obtenção de oócitos competentes, é necessária uma perfeita interação entre as células somáticas foliculares e o oócito, sendo esta potencialmente regulada por fatores parácrinos produzidos no ovário. Dentre estes fatores, destacam-se a BMP-15 e o KL, sintetizados pelo oócito e pelas células da granulosa, respectivamente. Este artigo revisa o importante papel da BMP-15 e do KL na foliculogênese, enfocando suas características, sítios de expressão, receptores e vias de sinalização, bem como a interação entre estas duas substâncias(AU)

Folliculogenesis is coordinated by many growth factors and hormones responsible for ensuring the success of follicular and oocyte development. To obtain competent oocytes is necessary to have a perfect interaction between follicular somatic cells and the oocyte, which is potentially regulated by paracrine factors produced in the ovary. Among these factors, we highlight BMP-15 and KL, synthesized by the oocyte and granulosa cells, respectively. This article reviews the important role of BMP-15 and KL in folliculogenesis, focusing on their characteristics, sites of expression, receptors and signaling pathways, as well as the interaction between these two substances(AU)

Papel da Proteína Morfogenética Óssea 15 (BMP-15) e Kit Ligand (KL) na regulação da foliculogênese em mamíferos / Role of Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP-15) and Kit Ligand (KL) in the regulation of folliculogenesis in mammalian

A foliculogênese é coordenada por diversos fatores de crescimento e hormônios responsáveis por garantir o sucesso do desenvolvimento folicular e oocitário. Para a obtenção de oócitos competentes, é necessária uma perfeita interação entre as células somáticas foliculares e o oócito, sendo esta potencialmente regulada por fatores parácrinos produzidos no ovário. Dentre estes fatores, destacam-se a BMP-15 e o KL, sintetizados pelo oócito e pelas células da granulosa, respectivamente. Este artigo revisa o importante papel da BMP-15 e do KL na foliculogênese, enfocando suas características, sítios de expressão, receptores e vias de sinalização, bem como a interação entre estas duas substâncias

Folliculogenesis is coordinated by many growth factors and hormones responsible for ensuring the success of follicular and oocyte development. To obtain competent oocytes is necessary to have a perfect interaction between follicular somatic cells and the oocyte, which is potentially regulated by paracrine factors produced in the ovary. Among these factors, we highlight BMP-15 and KL, synthesized by the oocyte and granulosa cells, respectively. This article reviews the important role of BMP-15 and KL in folliculogenesis, focusing on their characteristics, sites of expression, receptors and signaling pathways, as well as the interaction between these two substances

Regulação da divergência folicular in vivo: uma abordagem molecular / Regulation of follicular deviation in vivo: a molecular approach

O controle local da seleção folicular em mamíferos ainda é pouco compreendido. O objetivo do presente estudo foi identificar fatores locais, receptores e rotas de sinalização envolvidas na seleção do folículo dominante e atresia dos subordinados em bovinos. Em um primeiro estudo, avaliou-se a regulação e função do FGF10 e do seu receptor FGFR2b durante a divergência folicular. A expressão de FGF10 e FGFR2b foi significativamente maior nas células da teca e granulosa, respectivamente, provenientes dos folículos subordinados. A injeção intrafolicular de FGF10 inibiu o crescimento folicular de maneira dose dependente e reduziu significativamente a síntese de estradiol. Nas células da granulosa, a injeção de FGF10 diminuiu a expressão de RNAm de CYP19A1 e ciclina D2, enquanto que uma tendência de aumento da expressão do receptor FGFR2b foi observada. Nas células da teca, um aumento significativo na expressão de FGF10 foi observado nos folículos tratados com FGF10. Em um segundo estudo, o padrão de expressão dos receptores de BMPs e das proteínas BMP15 e GDF9 foram avaliados em vacas ovariectomizadas em diferenes dias em relação ao inicio da onda folicular, comparando os dois maiores folículos antes (dia 2), durante (dia 3) ou após a divergência folícular (dia 4). No dia 2 da onda folicular, foi observada maior expressão do receptor BMPR-1A e tendências a maior expressão dos receptores BMPR-2 e -1B nos futuros folículos subordinados. No dia 3, quando os folículos dominantes e subordinados são identificados, a expressão de BMPR-1B e -2 foi maior nos folículos subordinados. No dia 4, o receptor BMPR1B (RNAm e proteína) foi significativamente mais expresso nas células da granulosa de folículos atrésicos. O aumento da expressão do BMPR1B durante a atresia folicular foi confirmado nas células da granulosa de folículos induzidos à atresia através do tratamento com FGF10 ou inibidor dos receptores de estradiol. A abundância de BMP15 e GDF9 no fluído folicular não diferiu entre folículos dominantes e subordinados. Em um terceiro estudo, buscou-se identificar rotas de sinalização diferentemente ativas nas células da granulosa durante a divergência. Os níveis de MAPK fosforilada foram significativamente superiores nos futuros folículos dominantes (dia 2), mas não diferiram entre os dois maiores folículos durante ou após a divergência. Folículos subordinados apresentaram maiores níveis de STAT3 fosforilada em relação aos seus respectivos dominantes em todos os pares de folículos coletados, sendo observado um aumento significativo em folículos atrésicos coletados no dia 4. Em conclusão, os resultados sugerem que a expressão reduzida de FGF10 e do receptor FGFR2b possibilitam o crescimento e diferenciação do folículo dominante, enquanto que o aumento da sinalização do FGF10 no folículo subordinado está associado com a atresia. O perfil de expressão dos receptores BMPR-2, -1B e -1A indica que os mesmos apresentam funções na regulação da divergência folicular em bovinos. A fosforilação da MAPK é um marcador inicial de dominância folicular, mas não é diferentemente regulada durante e após a divergência, enquanto que o padrão de ativação da STAT3 sugere que essa via está envolvida na morte das células da granulosa

The role of local factors in follicular selection in mammals is not fully understood. The aim of the present study was to identify local factors, receptors and intracellular signaling pathways involved in bovine dominant follicle selection and subordinate follicles atresia. In the first study, the pattern of mRNA expression and function of FGF10 and its receptor FGFR2b was evaluated during bovine follicle deviation. FGF10 and FGFR2b were significantly more expressed in theca and granulosa cells retrieved from subordinate follicles, respectively. Intrafollicular FGF10 treatment in the larger follicle dose-dependently inhibited follicle growth and significantly reduced estradiol secretion. In granulosa cells, FGF10 treatment decreased CYP19A1 and cyclin D2 mRNA expression whereas FGFR2b tended to be more expressed after treatment. In theca cells, a significant increase in FGF10 expression was observed in FGF10-treated follicles. In a second study, BMPRs, BMP15 and GDF9 expression was evaluated in cows ovariectomized when the size of the largest and second largest follicle did not have a significant difference (D2), had slight difference (D3) or marked difference (D4). At day 2 of follicular wave, it was observed a significant increase in BMPR1A expression whereas BMPR-2 and - 1B tended to be more expressed in future subordinate follicles. At day 3, when dominant and subordinate follicles are reliably identified, BMPR-2 and 1B were more expressed in subordinate follicles. At day 4, BMPR1B (mRNA and protein) was significantly more expressed in granulosa cells from atretic follicles. The increased BMPR1B expression during atresia was confirmed in granulosa cells from follicles induced to atresia with FGF10 or estradiol receptor antagonist treatment. Similar levels of BMP15 and GDF9 proteins were observed in follicular fluid from dominant and subordinate follicles. In a third study, we aimed to identify intracellular signaling pathways differentially activated in granulosa cells during deviation. Phosphorylated MAPK was more abundant in the future dominant follicle, but did not differ between follicles at the expected moment and after follicular deviation. Subordinate follicles phosphorylated STAT3 levels tended to increase at day 3 and were significantly greater at day 4 in comparison to dominant follicles. In conclusion, present results suggest that decreased FGF10 and FGFR2b expression allows dominant follicle growth and differentiation whereas increased FGF10 signaling in the subordinate follicle induces atresia. The patterns of BMPR- 2, -1B and -1A indicate that these receptors play roles during follicle deviation. Phosphorylated MAPK abundance is an early marker of follicle dominance, but is not differentially regulated during and after deviation. The functional status of STAT3 suggests that this pathway is involved in granulosa cell death

Desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos na presença de kit ligand (kl) e proteína morfogenética óssea 15 (bmp-15) / Development of in vitro preantral follicles goats in the presence of kit ligand (kl) and protein bone morphogenetic 15 (bmp-15)

Esse estudo teve como objetivos: 1) quantificar os níveis de RNAm para os receptores de kit ligand (KL) e proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15) em folículos ovarianos caprinos utilizando RT-PCR em tempo real; 2) investigar o papel do KL, associado ou não ao hormônio folículo estimulante (FSH) em meio dinâmico, sobre a sobrevivência, ativação e crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in situ; 3) avaliar os efeitos do KL e da BMP-15 sobre a sobrevivência, formação de antro e crescimento in vitro de folículos secundários caprinos isolados, bem como sobre a retomada da meiose de seus oócitos. [...] Verificou-se ainda níveis maiores de RNAm para o receptor tipo I da BMP-15 (BMPRIB) nas células da granulosa/teca de grandes folículos antrais em comparação àquelas de pequenos antrais. Após 16 dias de cultivo in situ, observou-se que o meio dinâmico contendo KL até o dia 8 e FSH do dia 8 ao dia 16 manteve a integridade ultraestrutural e induziu a ativação e o crescimento folicular. Quanto aos folículos isolados, a adição de 50 e/ou 100 ng/mL de KL ao cultivo, na ausência de FSH, promoveu a sobrevivência e melhorou a formação de antro, crescimento oocitário e retomada da meiose após 18 dias. Já 50 ng/mL de BMP-15 manteve a ultraestrutura e estimulou a formação de antro e o crescimento de folículos isolados. Em conclusão, os resultados deste estudo mostraram que os RNAm para c-kit, BMPRIB e BMPRII foram detectados em todas as categorias foliculares e tipos celulares investigados. A utilização de KL e FSH de forma dinâmica em cultivo in situ, bem como de KL (50 e/ou 100 ng/mL) e BMP-15 (50 ng/mL) em cultivo de folículos secundários isolados, promoveu a manutenção da sobrevivência folicular e o desenvolvimento de folículos pré-antrais caprinos.

The aims of this study were: 1) to quantify the mRNA levels for kit ligand (KL) and bone morphogenetic protein 15 (BMP-15) receptors in goat ovarian follicles by real time RT-PCR; 2) to investigate the role of KL alone or associated with follicle stimulating hormone (FSH) in a dynamic medium on the survival, activation and growth of goat preantral follicles cultured in situ; 3) to evaluate the effects of KL and BMP-15 on the in vitro survival, antrum formation and growth of goat isolated secondary follicles, and on the meiotic resumption of their oocytes. [...] Moreover, higher mRNA levels were observed for ckit in cumulus-oocyte complexes from small and large antral follicles compared with their respective granulosa/theca cells, which also occurred for BMPRII in the large antral follicles. Higher mRNA levels were also seen for BMP-15 type I receptor (BMPRIB) in the granulosa/theca cells from large antral follicles compared with those from small antral follicles. After 16 days of in situ culture, the dynamic medium containing KL until day 8 and FSH from day 8 to day 16 maintained the ultrastructural integrity and induced activation and follicular growth. For the isolated follicles, the addition of 50 and/or 100 ng/mL of KL to the culture, in the absence of FSH, promoted follicle survival and improved antrum formation,oocyte growth and meiotic resumption after 18 days. BMP-15 (50 ng/mL) maintained the ultrastructure and stimulated antrum formation and growth in isolated follicles. In conclusion, the results of this study showed that mRNAs for c-kit, BMPRIB and BMPRII were detected in all follicular categories and cellular types investigated. The use of KL and FSH dynamically in in situ culture, and the use of KL (50 and/or 100 ng/mL) and BMP-15 (50 ng/mL) in culture of isolated secondary follicles, promoted the maintenance of follicular survival and the development of caprine preantral follicles.

Desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos na presença de kit ligand (kl) e proteína morfogenética óssea 15 (bmp-15) / Development of in vitro preantral follicles goats in the presence of kit ligand (kl) and protein bone morphogenetic 15 (bmp-15)

Esse estudo teve como objetivos: 1) quantificar os níveis de RNAm para os receptores de kit ligand (KL) e proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15) em folículos ovarianos caprinos utilizando RT-PCR em tempo real; 2) investigar o papel do KL, associado ou não ao hormônio folículo estimulante (FSH) em meio dinâmico, sobre a sobrevivência, ativação e crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in situ; 3) avaliar os efeitos do KL e da BMP-15 sobre a sobrevivência, formação de antro e crescimento in vitro de folículos secundários caprinos isolados, bem como sobre a retomada da meiose de seus oócitos. [...] Verificou-se ainda níveis maiores de RNAm para o receptor tipo I da BMP-15 (BMPRIB) nas células da granulosa/teca de grandes folículos antrais em comparação àquelas de pequenos antrais. Após 16 dias de cultivo in situ, observou-se que o meio dinâmico contendo KL até o dia 8 e FSH do dia 8 ao dia 16 manteve a integridade ultraestrutural e induziu a ativação e o crescimento folicular. Quanto aos folículos isolados, a adição de 50 e/ou 100 ng/mL de KL ao cultivo, na ausência de FSH, promoveu a sobrevivência e melhorou a formação de antro, crescimento oocitário e retomada da meiose após 18 dias. Já 50 ng/mL de BMP-15 manteve a ultraestrutura e estimulou a formação de antro e o crescimento de folículos isolados. Em conclusão, os resultados deste estudo mostraram que os RNAm para c-kit, BMPRIB e BMPRII foram detectados em todas as categorias foliculares e tipos celulares investigados. A utilização de KL e FSH de forma dinâmica em cultivo in situ, bem como de KL (50 e/ou 100 ng/mL) e BMP-15 (50 ng/mL) em cultivo de folículos secundários isolados, promoveu a manutenção da sobrevivência folicular e o desenvolvimento de folículos pré-antrais caprinos.(AU)

The aims of this study were: 1) to quantify the mRNA levels for kit ligand (KL) and bone morphogenetic protein 15 (BMP-15) receptors in goat ovarian follicles by real time RT-PCR; 2) to investigate the role of KL alone or associated with follicle stimulating hormone (FSH) in a dynamic medium on the survival, activation and growth of goat preantral follicles cultured in situ; 3) to evaluate the effects of KL and BMP-15 on the in vitro survival, antrum formation and growth of goat isolated secondary follicles, and on the meiotic resumption of their oocytes. [...] Moreover, higher mRNA levels were observed for ckit in cumulus-oocyte complexes from small and large antral follicles compared with their respective granulosa/theca cells, which also occurred for BMPRII in the large antral follicles. Higher mRNA levels were also seen for BMP-15 type I receptor (BMPRIB) in the granulosa/theca cells from large antral follicles compared with those from small antral follicles. After 16 days of in situ culture, the dynamic medium containing KL until day 8 and FSH from day 8 to day 16 maintained the ultrastructural integrity and induced activation and follicular growth. For the isolated follicles, the addition of 50 and/or 100 ng/mL of KL to the culture, in the absence of FSH, promoted follicle survival and improved antrum formation,oocyte growth and meiotic resumption after 18 days. BMP-15 (50 ng/mL) maintained the ultrastructure and stimulated antrum formation and growth in isolated follicles. In conclusion, the results of this study showed that mRNAs for c-kit, BMPRIB and BMPRII were detected in all follicular categories and cellular types investigated. The use of KL and FSH dynamically in in situ culture, and the use of KL (50 and/or 100 ng/mL) and BMP-15 (50 ng/mL) in culture of isolated secondary follicles, promoted the maintenance of follicular survival and the development of caprine preantral follicles.(AU)

Mutations in the bone morphogenetic protein 15 gene causing defective protein secretion in Cholistani infertile sheep

Abstract Naturally occurring mutations in morphogenetic protein 15 (BMP15) are associated with decreased ovulation rate (OR), litter size (LS), and sterility. It is of a great interest to elucidate BMP15 gene in Cholistani sheep breed to uplift socio-economic status and the knowledge of Cholistani sheep breeding in Southern Punjab, Pakistan. In our study, a total of 50 infertile Cholistani sheep aged between 2-6 years and having no blood relation were screened for BMP15 mutations. For this purpose, a high-quality DNA was extracted from the blood of sheep followed by primer designing, Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification, DNA sequencing, and in silico analyses. Out of total 50 samples, 9 samples including case 1 (T3), case 2 (T8), case 3 (T17), case 4 (T22), case 5 (T25), case 6 (T33), case 7 (T40), case 8 (T44), and case 9 (T47) were found positive for a variety of already reported and novel BMP15 mutations. Further in silico analyses of the observed mutations have shown the functional impact of these mutations on different characteristics (molecular weight, theoretical PI, estimated half-life, instability index, sub-cellular localization, and 3D confirmation) of the encoded proteins, possibly altering the normal functionality. In a nutshell, findings of this study have confirmed the possible essential role of the BMP15 mutations in the infertility of the Cholistani sheep.

Resumo Mutações de ocorrência natural na proteína morfogenética 15 (BMP15) estão associadas à diminuição da taxa de ovulação (TO), tamanho da ninhada (TN) e esterilidade. Estudar a BMP15 na raça Cholistani para elevar o status socioeconômico e o conhecimento da criação de ovinos Cholistani no sul de Punjab, Paquistão. Em nosso estudo, 50 ovelhas Cholistani inférteis sem parentesco sanguíneo foram rastreadas para mutações BMP15. Para tanto, um DNA de alta qualidade foi extraído do sangue dessas ovelhas, seguido de concepção do primer, amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento de DNA e análises in silico. Do total de 50 amostras, 9, incluindo caso 1 (T3), caso 2 (T8), caso 3 (T17), caso 4 (T22), caso 5 (T25), caso 6 (T33), caso 7 (T40), caso 8 (T44) e caso 9 (T47), foram consideradas positivas para uma variedade de mutações BMP15 novas e já relatadas. Mais análises in silico das mutações observadas mostraram o impacto funcional dessas mutações em diferentes características (peso molecular, PI teórico, meia-vida estimada, índice de instabilidade, localização subcelular e confirmação 3D) das proteínas codificadas, possivelmente alterando a funcionalidade normal. Nossos achados confirmaram o possível papel essencial das mutações BMP15 na infertilidade de ovelhas Cholistani.

Mutations in the bone morphogenetic protein 15 gene causing defective protein secretion in Cholistani infertile sheep / Mutações no gene da proteína morfogenética óssea 15 causadoras de defeitos na secreção proteica em ovelhas inférteis Cholistani

Naturally occurring mutations in morphogenetic protein 15 (BMP15) are associated with decreased ovulation rate (OR), litter size (LS), and sterility. It is of a great interest to elucidate BMP15 gene in Cholistani sheep breed to uplift socio-economic status and the knowledge of Cholistani sheep breeding in Southern Punjab, Pakistan. In our study, a total of 50 infertile Cholistani sheep aged between 2-6 years and having no blood relation were screened for BMP15 mutations. For this purpose, a high-quality DNA was extracted from the blood of sheep followed by primer designing, Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification, DNA sequencing, and in silico analyses. Out of total 50 samples, 9 samples including case 1 (T3), case 2 (T8), case 3 (T17), case 4 (T22), case 5 (T25), case 6 (T33), case 7 (T40), case 8 (T44), and case 9 (T47) were found positive for a variety of already reported and novel BMP15 mutations. Further in silico analyses of the observed mutations have shown the functional impact of these mutations on different characteristics (molecular weight, theoretical PI, estimated half-life, instability index, sub-cellular localization, and 3D confirmation) of the encoded proteins, possibly altering the normal functionality. In a nutshell, findings of this study have confirmed the possible essential role of the BMP15 mutations in the infertility of the Cholistani sheep.

Mutações de ocorrência natural na proteína morfogenética 15 (BMP15) estão associadas à diminuição da taxa de ovulação (TO), tamanho da ninhada (TN) e esterilidade. Estudar a BMP15 na raça Cholistani para elevar o status socioeconômico e o conhecimento da criação de ovinos Cholistani no sul de Punjab, Paquistão. Em nosso estudo, 50 ovelhas Cholistani inférteis sem parentesco sanguíneo foram rastreadas para mutações BMP15. Para tanto, um DNA de alta qualidade foi extraído do sangue dessas ovelhas, seguido de concepção do primer, amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento de DNA e análises in silico. Do total de 50 amostras, 9, incluindo caso 1 (T3), caso 2 (T8), caso 3 (T17), caso 4 (T22), caso 5 (T25), caso 6 (T33), caso 7 (T40), caso 8 (T44) e caso 9 (T47), foram consideradas positivas para uma variedade de mutações BMP15 novas e já relatadas. Mais análises in silico das mutações observadas mostraram o impacto funcional dessas mutações em diferentes características (peso molecular, PI teórico, meia-vida estimada, índice de instabilidade, localização subcelular e confirmação 3D) das proteínas codificadas, possivelmente alterando a funcionalidade normal. Nossos achados confirmaram o possível papel essencial das mutações BMP15 na infertilidade de ovelhas Cholistani.