Type C waterborne botulism outbreaks in buffaloes (Bubalus bubalis) in the Amazon region / Surtos de botulismo hídrico tipo C em búfalos (Bubalus bubalis) na região amazônica

Botulism is a poisoning caused by botulinum neurotoxins (BoNTs). BoNTs serotypes C and D are involved in botulism outbreaks in cattle in several countries. Despite the high number of buffaloes worldwide, the real impact of botulism in buffaloes is not known, because it is not a notifiable disease in Brazil and only few studies have evaluated the occurrence of the disease in buffaloes. Those studies did not conduct diagnostic tests to confirm the presence of BoNTs. The objective of the present study was to describe three outbreaks of botulism in buffaloes in the Brazilian Amazon region considering epidemiological and clinical data as well as laboratory diagnosis to confirm the presence of BoNTs. The results of the bioassay were negative in the tissues and in feed samples, but positive for BoNT C in water samples. Confirmation of the occurrence of botulism in buffaloes allows the implementation of preventive strategies in susceptible herds. Waterborne botulism in buffaloes is prevented by ensuring the constant circulation of water collections and restricting the presence of dead animals and bones in order to prevent the accumulation of organic matter and the development of anaerobic conditions, which might favor the replication of Clostridium botulinum. Another measure that can be adopted is the shading of the pasture, in order to maintain the thermal comfort for the buffaloes and to avoid the excess of permanence of them in the water pools.(AU)

Botulismo é uma intoxicação causada por neurotoxinas botulínicas (BoNTs). Os sorotipos C e D de BoNTs estão envolvidos em surtos de botulismo em bovídeos em vários países. Apesar do elevado número de búfalos em todo o mundo, o real impacto do botulismo em búfalos não é conhecido; pois não é uma doença de notificação obrigatória no Brasil e poucos estudos avaliaram a incidência desta doença em búfalos. Além disso, estes estudos não realizaram testes diagnósticos para confirmar a presença de BoNTs. O objetivo do presente estudo foi descrever três surtos de botulismo em búfalos na região amazônica brasileira, considerando dados epidemiológicos e clínicos, bem como o diagnóstico laboratorial para confirmar a presença de BoNTs. Os resultados do bioensaio em camundongos foram negativos em todos os tecidos e nas amostras de alimentos testados; no entanto foram positivos para BoNT C nas amostras de água. A confirmação da ocorrência de botulismo em búfalos permite a implementação de estratégias preventivas nos rebanhos. O botulismo hídrico nos búfalos pode ser prevenido assegurando-se que coleções de água fossem mantidas limpas, sem a presença de animais mortos e ossadas no seu interior e não permitindo o acúmulo de matéria orgânica e condições de anaerobiose favoráveis à multiplicação de Clostridium. botulinum. Outra medida que pode ser adotada é o sombreamento das pastagens, a fim de manter o conforto térmico dos búfalos e assim evitar o excesso de sua permanência dentro das fontes de água.(AU)

Type C waterborne botulism outbreaks in buffaloes (Bubalus bubalis) in the Amazon region / Surtos de botulismo hídrico tipo C em búfalos (Bubalus bubalis) na região amazônica

Botulism is a poisoning caused by botulinum neurotoxins (BoNTs). BoNTs serotypes C and D are involved in botulism outbreaks in cattle in several countries. Despite the high number of buffaloes worldwide, the real impact of botulism in buffaloes is not known, because it is not a notifiable disease in Brazil and only few studies have evaluated the occurrence of the disease in buffaloes. Those studies did not conduct diagnostic tests to confirm the presence of BoNTs. The objective of the present study was to describe three outbreaks of botulism in buffaloes in the Brazilian Amazon region considering epidemiological and clinical data as well as laboratory diagnosis to confirm the presence of BoNTs. The results of the bioassay were negative in the tissues and in feed samples, but positive for BoNT C in water samples. Confirmation of the occurrence of botulism in buffaloes allows the implementation of preventive strategies in susceptible herds. Waterborne botulism in buffaloes is prevented by ensuring the constant circulation of water collections and restricting the presence of dead animals and bones in order to prevent the accumulation of organic matter and the development of anaerobic conditions, which might favor the replication of Clostridium botulinum. Another measure that can be adopted is the shading of the pasture, in order to maintain the thermal comfort for the buffaloes and to avoid the excess of permanence of them in the water pools.(AU)

Botulismo é uma intoxicação causada por neurotoxinas botulínicas (BoNTs). Os sorotipos C e D de BoNTs estão envolvidos em surtos de botulismo em bovídeos em vários países. Apesar do elevado número de búfalos em todo o mundo, o real impacto do botulismo em búfalos não é conhecido; pois não é uma doença de notificação obrigatória no Brasil e poucos estudos avaliaram a incidência desta doença em búfalos. Além disso, estes estudos não realizaram testes diagnósticos para confirmar a presença de BoNTs. O objetivo do presente estudo foi descrever três surtos de botulismo em búfalos na região amazônica brasileira, considerando dados epidemiológicos e clínicos, bem como o diagnóstico laboratorial para confirmar a presença de BoNTs. Os resultados do bioensaio em camundongos foram negativos em todos os tecidos e nas amostras de alimentos testados; no entanto foram positivos para BoNT C nas amostras de água. A confirmação da ocorrência de botulismo em búfalos permite a implementação de estratégias preventivas nos rebanhos. O botulismo hídrico nos búfalos pode ser prevenido assegurando-se que coleções de água fossem mantidas limpas, sem a presença de animais mortos e ossadas no seu interior e não permitindo o acúmulo de matéria orgânica e condições de anaerobiose favoráveis à multiplicação de Clostridium. botulinum. Outra medida que pode ser adotada é o sombreamento das pastagens, a fim de manter o conforto térmico dos búfalos e assim evitar o excesso de sua permanência dentro das fontes de água.(AU)

Type C waterborne botulism outbreaks in buffaloes (Bubalus bubalis) in the Amazon region

ABSTRACT: Botulism is a poisoning caused by botulinum neurotoxins (BoNTs). BoNTs serotypes C and D are involved in botulism outbreaks in cattle in several countries. Despite the high number of buffaloes worldwide, the real impact of botulism in buffaloes is not known, because it is not a notifiable disease in Brazil and only few studies have evaluated the occurrence of the disease in buffaloes. Those studies did not conduct diagnostic tests to confirm the presence of BoNTs. The objective of the present study was to describe three outbreaks of botulism in buffaloes in the Brazilian Amazon region considering epidemiological and clinical data as well as laboratory diagnosis to confirm the presence of BoNTs. The results of the bioassay were negative in the tissues and in feed samples, but positive for BoNT C in water samples. Confirmation of the occurrence of botulism in buffaloes allows the implementation of preventive strategies in susceptible herds. Waterborne botulism in buffaloes is prevented by ensuring the constant circulation of water collections and restricting the presence of dead animals and bones in order to prevent the accumulation of organic matter and the development of anaerobic conditions, which might favor the replication of Clostridium botulinum. Another measure that can be adopted is the shading of the pasture, in order to maintain the thermal comfort for the buffaloes and to avoid the excess of permanence of them in the water pools.

RESUMO: Botulismo é uma intoxicação causada por neurotoxinas botulínicas (BoNTs). Os sorotipos C e D de BoNTs estão envolvidos em surtos de botulismo em bovídeos em vários países. Apesar do elevado número de búfalos em todo o mundo, o real impacto do botulismo em búfalos não é conhecido; pois não é uma doença de notificação obrigatória no Brasil e poucos estudos avaliaram a incidência desta doença em búfalos. Além disso, estes estudos não realizaram testes diagnósticos para confirmar a presença de BoNTs. O objetivo do presente estudo foi descrever três surtos de botulismo em búfalos na região amazônica brasileira, considerando dados epidemiológicos e clínicos, bem como o diagnóstico laboratorial para confirmar a presença de BoNTs. Os resultados do bioensaio em camundongos foram negativos em todos os tecidos e nas amostras de alimentos testados; no entanto foram positivos para BoNT C nas amostras de água. A confirmação da ocorrência de botulismo em búfalos permite a implementação de estratégias preventivas nos rebanhos. O botulismo hídrico nos búfalos pode ser prevenido assegurando-se que coleções de água fossem mantidas limpas, sem a presença de animais mortos e ossadas no seu interior e não permitindo o acúmulo de matéria orgânica e condições de anaerobiose favoráveis à multiplicação de Clostridium. botulinum. Outra medida que pode ser adotada é o sombreamento das pastagens, a fim de manter o conforto térmico dos búfalos e assim evitar o excesso de sua permanência dentro das fontes de água.

PRODUÇÃO E CERTIFICAÇÃO DE MATERIAIS DE REFERÊNCIA BIOLÓGICOS PARA USO VETERINÁRIO: Estirpes de Clostridium botulinum tipos C e D, suas toxinas e antitoxinas

O botulismo é uma doença grave, que acomete o homem e animais, causada pela ação de neurotoxinas botulínicas (BoNT) produzidas pelo Clostridium botulinum. Os tipos C, D e os mosaicos C/D e D/C são os principais causadores da doença nos animais. O botulismo em ruminantes no Brasil passou de uma doença endêmica nas décadas de 80-90, para ocorrência na forma de surtos esporádicos nos últimos anos, principalmente devido ao sucesso da implantação do programa de controle nacional baseado em vacinação sistemática do rebanho, além de práticas adequadas de manejo. Toxinas e antitoxinas botulínicas tipos C e D são insumos essenciais utilizados na produção, controle de qualidade e teste oficial de vacinas contra o botulismo. Esses insumos também têm um importante uso no diagnóstico de casos suspeitos de botulismo, e na validação de novos métodos de diagnóstico, especialmente métodos alternativos ao bioensaio em camundongos. Igualmente importante e necessária é a caracterização de estirpes de Clostridium botulinum, que atualmente pode ser realizada por técnicas moleculares e genômicas, a fim de tipificá-las considerando os tipos mosaicos, sem equívocos advindos de reações cruzadas, possíveis de ocorrer no bioensaio. A exigência de dados mais exatos e confiáveis em áreas científicas e tecnológicas tem demandado materiais de referência de maior qualidade. Entretanto, um grande gargalo enfrentado é a dependência da importação desses materiais, ou mesmo a indisponibilidade no mercado. Acrescentam-se ainda restrições relativas ao bioterrorismo, que impedem a importação de toxinas botulínicas ou estirpes toxigênicas. Os objetivos deste trabalho consistiram em caracterizar e certificar lotes de estirpes de Clostridium botulinum, toxinas e antitoxinas botulínicas dos tipos C e D, como materiais de referência certificados (MRCs). Com a utilização de métodos microbiológicos clássicos, técnicas moleculares e sequenciamento genômico foi possível tipificar e caracterizar amostras de Clostridium botulinum tipos C, D e D/C mantidas atualmente pelo órgão oficial (MAPA) e por indústrias veterinárias, incluindo comparações genômicas com outras sequências disponíveis no GenBank. Lotes de estirpes de Clostridium botulinum tipo C (CBC 02) e tipo D (CBD 09), suficientemente homogêneas e estáveis foram produzidos e certificados como MRCs. Toxinas botulínicas e antitoxinas botulínicas tipos C e D produzidas neste trabalho foram consideradas homogêneas e estáveis, após testes estatísticos baseados em análise de regressão, com exceção da toxina botulínica tipo C (Lote 01/2016), que apresentou instabilidade. A caracterização foi realizada por meio de estudo colaborativo entre sete instituições brasileiras, incluindo fabricantes de vacinas e laboratórios de diagnóstico. Valores de referência foram estimados por modelo de medição com independência estatística, obtendo-se materiais com os seguintes títulos e incertezas: antitoxina botulínica tipo C (Lote 01/2017), (55 ± 13) UI; toxina botulínica tipo D (Lote 01/2017), (950 ± 153) L+; antitoxina botulínica tipo D (Lote 01/2017), (50 ± 13) UI. A temperatura recomendada para armazenamento dos produtos foi -20ºC, e períodos de validade de 10 anos para as estirpes e de um ano para toxinas e antitoxinas, os quais poderão ser ampliados, após estudos complementares de monitoramento dos MRCs. O domínio das metodologias de produção e dos protocolos de certificação, atendendo a requisitos de normas de qualidade internacionalmente reconhecidas para a produção de MRCs, propiciaram a disponibilização de produtos de alta qualidade, indicados para uso em testes para identificação da bactéria, de controle de qualidade de vacinas contra o botulismo, validação de métodos, estabelecimento de rastreabilidade a outros materiais, monitoramento de laboratórios e ensaios de proficiência. Além disso, trouxe vantagem e independência científica ao país, agregando confiabilidade ao controle do botulismo, e minimizando dificuldades alfandegárias e custos envolvidos na obtenção desses insumos.

Botulism is a serious disease that affects humans and animals, caused by the action of botulinum neurotoxins (BoNT) produced by Clostridium botulinum. Types C, D and mosaics C /D and D/C are the main cause of disease in animals. Botulism in ruminants in Brazil changed from an endemic disease in the 1980s to 1990s, to sporadic outbreaks in recent years, mainly due to the successful implementation of the national control program based on systematic herd vaccination, as well as practices management. Botulinum toxins and botulinum toxins types C and D are essential inputs used in production, quality control and official testing of botulism vaccines. These inputs also have an important use in diagnosis of suspected cases of botulism, and in validation of new diagnostic methods, especially alternative methods to mouse bioassay. Equally important and necessary is the characterization of Clostridium botulinum strains, which can currently be performed by molecular and genomic techniques, in order to typify them considering the mosaic types, without any misunderstandings arising from cross reactions, which may occur in bioassay. The demand for more accurate and reliable data in scientific and technological areas has demanded higher quality reference materials. However, a major bottleneck is the dependence on imports of these materials, or even unavailability in the market. There are also added restrictions on bioterrorism, which prevent import of botulinum toxins or toxigenic strains. The objectives of this work were to characterize and certify batches of Clostridium botulinum strains, toxins and botulinum toxin types C and D, as certified reference materials (CRMs). With the use of classical microbiological methods, molecular techniques and genomic sequencing, it was possible to typify and characterize samples of Clostridium botulinum types C, D and D / C currently maintained by the official agency (MAPA) and veterinary industries, including genomic comparisons with other sequences available on GenBank. Batches of Clostridium botulinum strains type C (CBC 02) and type D (CBD 09), sufficiently homogeneous and stable were produced and certified as CRMs. Botulinum toxins and botulinum antitoxins types C and D produced in this work were considered homogeneous and stable after statistical tests based on regression analysis, except botulinum toxin type C (Batch 01/2016), which presented instability. The characterization was performed through a collaborative study between seven Brazilian institutions, including vaccine manufacturers and diagnostic laboratories. Reference values were estimated by measuring model with statistical independence, obtaining materials with the following titers and uncertainties: Botulinum toxin type C (Batch 01/2017), 55 ± 13 IU; Botulinum toxin type D (Batch 01/2017), 950 ± 153 L+; Botulinum antitoxin type D (Batch 01/2017), 50 ± 13 IU. Recommended temperature for storage of the products was -20ºC, and periods of validity of 10 years for strains and of one year for toxins and antitoxins, which could be extended, after complementary studies of monitoring the CRMs. The domain of production methodologies and certification protocols, meeting the requirements of internationally recognized quality standards for production of CRMs, provided availability of high quality products, indicated for use in tests for bacterial identification, quality control of vaccines against botulism, validation of methods, establishment of traceability to other materials, monitoring of laboratories and proficiency tests. In addition, it brought scientific advantage and independence to the country, adding reliability to the botulism control, and minimizing customs difficulties and costs involved in obtaining these inputs.