Genome editing: propelling the next generation of crop improvement / Edição genômica: impulsionando a nova geração do melhoramento de plantas

Climate change and population size records threaten food security. Therefore, the call for a more sustainable and efficient crop production has never been more urgent. Traditional plant breeding was one of the first successful approaches to expand cultivation areas and crop yield. Later, biotechnological tools and their products, such as genetically modified organisms containing exogenous DNA, further broadened the limits of agricultural results, yet bringing huge financial, bureaucratic, and public rejection hurdles. In the 90s, scientific advances brought the opportunity to drive mutations using engineered nucleases, and since 2013 CRISPR-Cas has emerged as the most practical toolkit to edit genomes. One of the most striking possibilities is to generate edited and non-transgenic plants. In this review, we present the working mechanism behind CRISPR-induced mutations and pinpoint the latest techniques developed, as well as its myriad of applications in agriculture. The enhancing scope of CRISPR ranges from introducing traits of agronomic interest – such as herbicide resistance, resistance/tolerance to biotic and abiotic stresses, and quality and durability of products – to accelerating plant breeding processes, including haploid induction, generating male-sterile lines, fixating hybrid vigor, and overcoming self-incompatibility. We also discuss regulatory issues surrounding edited plants and derived products around the world, challenges that must be overcome, and future prospects to harness all the potential of this amazing tool to guarantee the new crop production revolution.

As mudanças climáticas e números recordes de população ameaçam a segurança alimentar. Portanto, o apelo por uma produção agrícola mais sustentável e eficiente nunca foi tão urgente. O melhoramento genético tradicional foi uma das primeiras abordagens bem-sucedidas para expandir as áreas de cultivo e o rendimento das safras. Posteriormente, ferramentas biotecnológicas e seus produtos, como organismos geneticamente modificados contendo DNA exógeno, ampliaram ainda mais os limites dos resultados agrícolas, apesar de ainda carregarem enormes obstáculos financeiros, burocráticos e de rejeição pública. Na década de 90, os avanços científicos trouxeram a oportunidade de conduzir mutações usando nucleases projetadas e, desde 2013, CRISPR-Cas surgiu como o kit de ferramentas mais prático para editar genomas. Uma das possibilidades mais marcantes é gerar plantas editadas e não transgênicas. Nesta revisão, apresentamos o mecanismo de ação por trás das mutações induzidas por CRISPR, identificando as últimas técnicas desenvolvidas, bem como sua miríade de aplicações na agricultura. O escopo de aprimoramento do CRISPR varia desde introduzir características de interesse agronômico – como resistência a herbicidas, resistência/tolerância a estresses bióticos e abióticos e qualidade e durabilidade de produtos – até acelerar processos de melhoramento genético de plantas, incluindo indução de haploidia, geração de linhagens macho-estéreis, fixação de vigor híbrido e superação da autoincompatibilidade. Também discutimos questões regulatórias em torno de plantas editadas e produtos derivados mundialmente, desafios que devem ser superados e perspectivas futuras para aproveitar todo o potencial desta ferramenta incrível para garantir a nova revolução na produção de culturas agrícolas.

Genome editing: propelling the next generation of crop improvement / Edição genômica: impulsionando a nova geração do melhoramento de plantas

Climate change and population size records threaten food security. Therefore, the call for a more sustainable and efficient crop production has never been more urgent. Traditional plant breeding was one of the first successful approaches to expand cultivation areas and crop yield. Later, biotechnological tools and their products, such as genetically modified organisms containing exogenous DNA, further broadened the limits of agricultural results, yet bringing huge financial, bureaucratic, and public rejection hurdles. In the 90s, scientific advances brought the opportunity to drive mutations using engineered nucleases, and since 2013 CRISPR-Cas has emerged as the most practical toolkit to edit genomes. One of the most striking possibilities is to generate edited and non-transgenic plants. In this review, we present the working mechanism behind CRISPR-induced mutations and pinpoint the latest techniques developed, as well as its myriad of applications in agriculture. The enhancing scope of CRISPR ranges from introducing traits of agronomic interest such as herbicide resistance, resistance/tolerance to biotic and abiotic stresses, and quality and durability of products to accelerating plant breeding processes, including haploid induction, generating male-sterile lines, fixating hybrid vigor, and overcoming self-incompatibility. We also discuss regulatory issues surrounding edited plants and derived products around the world, challenges that must be overcome, and future prospects to harness all the potential of this amazing tool to guarantee the new crop production revolution.(AU)

As mudanças climáticas e números recordes de população ameaçam a segurança alimentar. Portanto, o apelo por uma produção agrícola mais sustentável e eficiente nunca foi tão urgente. O melhoramento genético tradicional foi uma das primeiras abordagens bem-sucedidas para expandir as áreas de cultivo e o rendimento das safras. Posteriormente, ferramentas biotecnológicas e seus produtos, como organismos geneticamente modificados contendo DNA exógeno, ampliaram ainda mais os limites dos resultados agrícolas, apesar de ainda carregarem enormes obstáculos financeiros, burocráticos e de rejeição pública. Na década de 90, os avanços científicos trouxeram a oportunidade de conduzir mutações usando nucleases projetadas e, desde 2013, CRISPR-Cas surgiu como o kit de ferramentas mais prático para editar genomas. Uma das possibilidades mais marcantes é gerar plantas editadas e não transgênicas. Nesta revisão, apresentamos o mecanismo de ação por trás das mutações induzidas por CRISPR, identificando as últimas técnicas desenvolvidas, bem como sua miríade de aplicações na agricultura. O escopo de aprimoramento do CRISPR varia desde introduzir características de interesse agronômico como resistência a herbicidas, resistência/tolerância a estresses bióticos e abióticos e qualidade e durabilidade de produtos até acelerar processos de melhoramento genético de plantas, incluindo indução de haploidia, geração de linhagens macho-estéreis, fixação de vigor híbrido e superação da autoincompatibilidade. Também discutimos questões regulatórias em torno de plantas editadas e produtos derivados mundialmente, desafios que devem ser superados e perspectivas futuras para aproveitar todo o potencial desta ferramenta incrível para garantir a nova revolução na produção de culturas agrícolas.(AU)

Light up the embryos: knock-in reporter generation for mouse developmental biology

Developmental biology seeks to understand the sophisticated regulated process through which a single cell – a fertilized egg – generates a highly organized organism. The most effective way to reveal the nature of these processes is to follow single cells and cell lineages in real-time. Recent advances in imaging equipment, fluorescent tags and computational tools have made long term multi-color imaging of cells and embryos possible. However, there is still one major challenging for achieving live imaging of mammalian embryos- the generation of embryos carrying reporters that recapitulate the endogenous expression pattern of marker genes. Recent developments of genome editing technology played important roles in enabling efficient generation of reporter mouse models. This mini review discusses recent developments of technologies for efficiently generate knock-in reporter mice and the application of these models in live imaging development. With these developments, we are starting to realize the long-sought promises of realtime analysis of mammalian development.

Light up the embryos: knock-in reporter generation for mouse developmental biology

Developmental biology seeks to understand the sophisticated regulated process through which a single cell a fertilized egg generates a highly organized organism. The most effective way to reveal the nature of these processes is to follow single cells and cell lineages in real-time. Recent advances in imaging equipment, fluorescent tags and computational tools have made long term multi-color imaging of cells and embryos possible. However, there is still one major challenging for achieving live imaging of mammalian embryos- the generation of embryos carrying reporters that recapitulate the endogenous expression pattern of marker genes. Recent developments of genome editing technology played important roles in enabling efficient generation of reporter mouse models. This mini review discusses recent developments of technologies for efficiently generate knock-in reporter mice and the application of these models in live imaging development. With these developments, we are starting to realize the long-sought promises of realtime analysis of mammalian development.(AU)

CAMPYLOBACTER JEJUNI: ANÁLISE IN SILICO DE GENOMAS PARA CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL DE GENES DE VIRULÊNCIA E DO SISTEMA CRISPR-CAS EM NIVEL GLOBAL

Campylobacter é uma das causas mais comuns de doenças diarreicas bacterianas em todo o mundo. São de interesse particular para a saúde publica, pois constantemente causam elevado número de infecções bacterianas de origem alimentar. Entre as mais de trinta espécies descritas, Campylobacter jejuni (C. jejuni) é o mais comumente isolado de fontes fecais de aves sendo responsável por quase 90% dos casos das infecções causadas por Campylobacter em humanos. O interesse pelo estudo de C. jejuni aumentou nos últimos anos por causa da sua importância como patógeno e da facilidade ao acesso a novas tecnologias genéticas, principalmente o sequenciamento de nova geração capaz de sequenciar de forma eficaz o genoma bacteriano. Além disso, a biologia de C. jejuni é um tema intrigante e desafiador para comunidade médico-científica pois mecanismos perspicazes e interessantes de sobrevivência relacionados à transmissão e virulência dessa espécie ainda não foram descobertos e revelados detalhadamente como em outras bactérias. Esse estudo teve como objetivo geral caracterizar em um âmbito global o repertório de genes de virulência e investigar a possível correlação entre o sistema CRISPR-Cas e o aumento da resistência antimicrobiana em C. jejuni. Nesse propósito, detectamos uma notável diversidade na ocorrência de genes de virulência clinicamente relevantes para C. jejuni, em especial pela ausência total ou parcial dos genes essenciais flaA e flaB em um grande número de genomas de todos os continentes. Também demonstramos uma diferença significativa na distribuição de CRISPR-Cas entre genomas de estipes sem resistência antimicrobiana e estirpes com resistência a múltiplas drogas, fomentando os indícios de que o sistema CRISPR-Cas também está relacionado com o aumento da resistência antimicrobiana em C. jejuni. De maneira geral, os resultados desse estudo trouxeram evidências inéditas sobre a virulência e o sistema CRISPR - Cas de C. jejuni apontando questões que podem ser discutidas e que ainda podem e devem ser investigadas mais detalhadamente por toda a comunidade médico-científica com interesse no assunto.

Campylobacter is one of the most common causes of bacterial diarrheal diseases worldwide. They are of particular interest to public health, as they constantly cause high numbers of food-borne diseases. Among over thirty species, the genus Campylobacter jejuni (C. jejuni) is the most common in chicken fecal source, accounting for almost 90% of human cases caused by Campylobacter. Interest in the study of C. jejuni has increased in recent years because of its importance as a pathogen and the ease of access to new genetic technologies, especially the next-generation sequencing capable of effectively sequencing the bacterial genome. Furthermore, the biology of C. jejuni is an intriguing and challenging topic for the medical-scientific community, as interesting components related to the transmission and virulence of this species have not yet been discovered and revealed in detail as in other bacteria. This study aimed to characterize, in global scope, the repertoire of virulence genes and to investigate a possible correlation between the CRISPR-Cas system and the increase in antimicrobial resistance in C. jejuni. For this purpose, we detected a diversity in the occurrence of clinically relevant virulence genes for C. jejuni, especially due to the total or partial absence of the essential genes flaA and flaB in a large number of genomes from all continents. We also demonstrate a significant difference in the distribution of CRISPR-Cas between genomes from strains without antimicrobial resistance and strains with multiple drug resistance, furthering evidence that the CRISPR-Cas system is also related to increased antimicrobial resistance in C. jejuni. Overall, the results of this study provided unprecedented evidence on virulence and the CRISPR Cas system of C. jejuni. These topics should be discussed and investigated in more detail by the entire medical-scientific community interested in public health.

Functional analysis of the SAP30 gene and its relation to muscle development

Entender a maquinaria molecular envolvida em determinadas características de interesse econômico é importante para que informações genéticas possam ser aplicadas junto aos programas de melhoramento animal, visando estabelecer maior acurácia na seleção genômica. Estudos de GWAS identificaram regiões de QTL e CNV localizadas no cromossomo 4 na espécie Gallus gallus, em uma população brasileira de frangos de corte, associadas com características de desenvolvimento muscular, como peso e porcentagem de peito. Buscas por genes candidatos presentes nessas regiões e que pudessem estar participando do desenvolvimento muscular foram realizadas. O gene SAP30 foi identificado como um possível candidato ao desenvolvimento muscular. Diante disso, e com o objetivo de validar sua função, SAP30 foi editado usando CRISPR/Cas9 e teve sua expressão reduzida por meio de siRNA, em cultura de mioblastos in vitro. Após essas análises, análises morfométricas foram realizadas na cultura celular para avaliar as alterações ocorridas no tamanho de área dessas células. Posteriormente, as análises de sequenciamento de RNA, genes diferencialmente expressos e enriquecimento funcional foram realizadas para investigar redes gênicas e processos biológicos que as mutações e/ou redução da expressão do SAP30 estariam ocasionando. Os resultados para ambos os trabalhos mostram o envolvimento do SAP30 na hipertrofia de células musculares. Tanto a redução na expressão do gene, quanto a indução de mutações em sua sequência, fizeram com que os miotubos tivessem maior área nos grupos tratados, quando comparado aos controles. As análises de sequenciamento de RNA revelaram, para ambos, uma importante diferença na expressão de genes relacionados ao desenvolvimento muscular, bem como, genes que atuam em vias de formação e regeneração do músculo. Assim, pela primeira vez, apresentamos o gene SAP30 como um possível regulador de hipertrofia muscular.

Understanding the molecular machinery involved in certain traits of economic interest is important because the genetic information can be applied to animal breeding programs, defining greater accuracy in genomic selection. GWAS studies have identified general QTL and CNV regions on chromosome 4 in Gallus gallus species, in a Brazilian broiler population, associated with muscle development traits such as weight and percentage of breast. Searches for candidate genes present in these regions and that could be participating in muscle development were performed. The SAP30 gene was identified as a possible candidate for muscle development. Therefore, and to validate its function, SAP30 was edited using CRISPR/Cas9 and had its expression reduced by means of siRNA, in myoblast culture in vitro. After these analyses, morphometric analyzes were performed in cell culture to evaluate changes in the area size of these cells. Subsequently, RNA sequencing, differentially expressed genes and functional enrichment analyzes were performed to investigate gene networks and biological processes that mutations and/or reduced expression of SAP30 would be causing. The results for both papers presented the involvement of SAP30 in muscle cell hypertrophy. Both the reduction in gene expression and the induction of mutations in its sequence made the myotubes have a larger area in the treated groups when compared to controls. RNA sequencing analyzes revealed, for both, an important difference in the expression of genes related to muscle development, as well as genes that act in muscle formation and regeneration pathways. So, for the first time, we present the SAP30 gene as a possible regulator of muscle hypertrophy.

Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de SOX2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino

A separação entre massa interna celular (MCI) e trofectoderma (TE) é o primeiro evento de diferenciação celular que ocorre no embrião mamífero, seguida pela diferenciação na MCI do epiblasto (EPI) e endoderma primitivo (PE). Falhas nestes processos de desenvolvimento inicial podem ocasionar perdas embrionárias e consequentemente econômicas. A influência do sistema de produção embrionária nos primeiros eventos de diferenciação celular precisa ser mais elucidada, refletindo em índices que ainda podem ser melhorados na produção de embriões bovinos in vitro. O soro fetal bovino (SFB), apesar de seus efeitos deletérios sobre fatores epigenéticos, ainda é usado em sistemas de produção in vitro e pode influenciar esta diferenciação. Ainda, as técnicas para estudo dos embriões normalmente envolvem a destruição dos mesmos e não permitem acompanhar em tempo real a dinâmica de expressão dos genes relacionados à diferenciação em MCI e TE. Novas técnicas como CRISPR/Cas9 permitem alteração direcionada da sequência de DNA genômico, assim, a introdução direcionada de proteínas fluorescentes repórteres permitiria a visualização em tempo real da expressão de genes de interesse nos embriões. Diante disso, nossos objetivos foram: testar a influência do soro fetal bovino nas primeiras diferenciações e, realizar a inserção dirigida de uma proteína repórter fluorescente na região do gene SOX2 por recombinação homóloga. Ainda, comparamos a eficiência da inserção gênica com uso do sistema CRISPR em diferentes momentos do desenvolvimento embrionário, com diferentes horários pós inseminação e com diferentes concentrações de material injetado. No primeiro experimento observamos que a retirada do SFB do cultivo embrionário não causa alterações na alocação de células na MCI ou TE, quando se alia esta remoção à renovação de uma parte do meio de cultivo às 90 horas pós inseminação (hpi). A ausência de suplementação de SFB ou de meio de cultivo levou à diminuição das células do TE, entretanto não alterou o número de células do PE. No segundo experimento, nenhum embrião produzido apresentou fluorescência, portanto todos os blastocistos tiveram seu DNA extraído para genotipagem. Foi realizada uma amostragem, e de 34 embriões verificados, um apresentou banda correspondente ao local do inserto e também banda correspondente ao embrião controle (wild type), sugerindo mosaicismo. Ao final, observamos que as melhores probabilidades de inserção gênica nos embriões bovinos aconteceram quando a injeção dos componentes do sistema CRISPR foi realizada após 8 horas de FIV e com maiores concentrações. Em conclusão, pudemos remover o SFB do nosso sistema de produção de embriões e surpreendentemente o SFB não influenciou a diferenciação em PE. Ainda, são necessários maiores estudos a fim de se otimizar a ferramenta para a obtenção de knock-in em embriões bovinos, principalmente para que se obtenha taxas de maior sucesso e redução da probabilidade de ocorrência de mosaicismo nestes embriões.

The separation between inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) is the first cell differentiation event that occurs in the mammalian embryo, followed by differentiation into the epiblast MCI (EPI) and primitive endoderm (PE). Failures in these early development processes can lead to embryonic and subsequent economic losses. The influence of the embryo production system on the first cell differentiation events needs to be further elucidated, reflecting in rates that can still be improved in the production of in vitro bovine embryos. Fetal bovine serum (FBS), despite its deleterious effects on epigenetic factors, is still used in in vitro production systems and may influence this differentiation. Furthermore, the techniques for studying embryos usually involve their destruction and do not allow real-time monitoring of the expression dynamics of genes related to differentiation in ICM and TE. New techniques such as CRISPR/Cas9 allow targeted alteration of genomic DNA sequence, thus targeted introduction of fluorescent reporter proteins would allow real-time visualization of the expression of genes of interest in embryos. Therefore, our objectives were: to test the influence of fetal bovine serum in the first differentiations and to carry out the targeted insertion of a fluorescent reporter protein in the region of the SOX2 gene by homologous recombination. Furthermore, we compared the efficiency of gene insertion using the CRISPR system at different moments of embryonic development, with different times after insemination and with different concentrations of injected material. In the first experiment, we observed that FBS removal from the embryonic culture does not cause changes in cell allocation in the ICM or TE, when this removal is combined with the renewal of a part of the culture medium at 90 hours after insemination (hpi). The absence of FBS or culture medium supplementation led to a decrease in TE cells, however it did not change the number of PE cells. In the second experiment, no embryo showed a fluorescent signal, so all blastocysts had their DNA extracted for genotyping. We sampled 34 embryos and one presented a band corresponding to the insertion site and also a band corresponding to the control embryo (wild type), suggesting mosaicism. We observed that best chances of gene insertion occurred when the injection of components of the CRISPR system was performed after 8 hours of IVF and with higher concentrations. In conclusion, we were able to remove SFB from our embryo production system and surprisingly SFB did not influence differentiation into PE. Still, further studies are needed in order to optimize the tool for obtaining knock-in in bovine embryos, mainly to obtain higher success rates and reduce the probability of occurrence of mosaicism in these embryos. Palavras-chave em inglês (separadas por vírgula): Gene editing. CRISPR/Cas9. Homologous Recombination. Blastocyst

Influência da via de sinalização HIPPO na segregação entre a massa interna celular e o trofectoderma em embriões bovinos

Resumo: O primeiro evento de diferenciação celular em mamíferos consiste na separação entre a massa celular interna (MCI) e o trofectoderma (TE). Em camundongos, a via de sinalização HIPPO atua no controle da expressão de genes que definem essa diferenciação. Em bovinos, há indícios que os mesmos genes não participam da mesma maneira, porém a via HIPPO pode estar implicada nesse evento biológico. No presente estudo buscou-se testar a hipótese de que a atividade da proteína quinase LATS2 é necessária para a diferenciação da MCI em embriões bovinos. Para isso, realizou-se edição gênica via sistema CRISPR/Cas9 com intuito de inibir a função quinase de LATS2. Zigotos bovinos produzidos in vitro foram microinjetados com RNAs guia para o gene LATS2 acrescidos da enzima de restrição Cas9. Os zigotos foram separados em 3 grupos experimentais, sendo: grupo controle (não microinjetado), grupo Cas9 (microinjetado apenas com a proteína Cas9) e grupo gRNA (microinjetado com dois RNAs guias para o gene LATS2 e proteína Cas9). Os embriões foram cultivados para avaliação da taxa de formação de blastocistos, distribuição celular e fixados em paraformol 3,8% para posterior realização da imunofluorescência para YAP, seguido de avaliação de genótipo. Os resultados obtidos sugeriram que a clivagem não foi afetada no grupo editado, sendo as taxas 58%, 36% e 50% para grupo controle, Cas9 e gRNA respectivamente; porém, as taxas de formação de blastocisto sugeriram uma interferência direta no grupo editado, sendo 30%, 10% e 6% respectivamente, para os grupos controle, Cas9 e gRNA. Observou-se no âmbito morfológico que os embriões do grupo gRNA aparentavam estruturas assemelhadas a mórulas, sugestivo de morte embrionária ou bloqueio da diferenciação nessa fase do desenvolvimento. Houve redução numérica no número de células nas estruturas do grupo gRNA. As imagens obtidas via microscopia confocal, após a realização de imunofluorescência para YAP, demonstram a marcação de células do TE nos embriões microinjetados apenas com Cas9 e controle, porém, essa marcação não ocorreu nas no grupo gRNA em embriões que não formaram blastocele. Após a extração individual de DNA dos embriões testados na imunofluorescência, a PCR da região alvo de LATS2 resultou em uma banda de 478pb, além da banda original de 650pb, em uma amostra do grupo gRNA. Após sequenciamento dos produtos de PCR pelo método Sanger, constatou-se a alteração genética oriunda da deleção de trecho do gene LATS2 em 2 embriões, demonstrando o sucesso da edição gênica e corroborando com os demais achados. Isso sugere que a via HIPPO possui papel significativo na diferenciação de MCI e TE em embriões bovinos e de que o gene LATS2 está ligado à formação de blastocistos na espécie bovina.

Abstract: The first cellular differentiation event in mammals consists of the separation between the internal cellular mass (ICM) and the trophectoderm (TE). In mice, the HIPPO signaling pathway acts to control the expression of genes that define this differentiation. In cattle, there are indications that the same genes do not participate in the same way, but the HIPPO pathway may be involved in this biological event. In the present study we aimed to test the hypothesis that the activity of LATS2 kinase is necessary for the differentiation of ICM in bovine embryos. In order to achieve this, we employed CRISPR/Cas9 gene editing system to inhibit the kinase function of LATS2. In vitro produced bovine zygotes were microinjected with RNAs guide aiming the LATS2 gene plus Cas9 restriction enzyme. The zygotes were sorted in 3 experimental groups: control group (not microinjected), Cas9 group (microinjected only with Cas9 protein) and gRNA group (microinjected with guide RNAs aiming the LATS2 gene and Cas9 protein). The embryos were cultured to evaluate the rate of blastocysts formation, cellular distribution, then fixed in 3.8% paraformol for subsequent immunofluorescence for YAP, followed by genotyping. The results suggested that the cleavage was not affected in the edited group, as rates were 58%, 36% and 50% for control , Cas9 and gRNA groups respectively; however, the blastocyst formation rates suggested a direct interference in the edited group, being 30%, 10% and 6% respectively, for the control groups, Cas9 and gRNA. Morphologically, it was observed that the embryos of the gRNA group appeared as morulas, suggestive of embryonic death or inhibition of differentation in this phase of development. There was a numeric reduction in total cell count in the structures of the gRNA group.. The images obtained via confocal microscopy, after performing immunofluorescence for YAP demonstrate the marking of cells of the TE and MCI in the microinjected embryos only with Cas9 and control, however, this marking did not occur in the microinjected structures that did not form a blastocoel. After individual DNA extraction from the embryos tested in immunofluorescence, PCR of the LATS2 target region resulted in a band of 478pb, in addition to the original 650pb band, in one sample of the gRNA group. After Sanger sequencing of PCR products, genetic alteration derived from deletion of part of the LATS2 gene was observed in 2 embryos, demonstrating gene editing success and corroborating the findings. This suggests that HIPPO pathway has a significant role in the differentiation of MCI and TE in bovine embryos and that the LATS2 gene is linked to the formation of blastocysts in bovine species.

THE ROLE OF THE CD46 RECEPTOR IN THE PATHOGENICITY OF THE BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS INFECTION IN BOVINE CULTURED CELLS

O vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais que causam importantes doenças clínicas em bovinos. A presença deste vírus em rebanhos representa um grande risco para a produtividade por perdas econômicas significativas. O uso da tecnologia de edição gênica, como o sistema CRISPR/Cas9, em animais de produção pode contribuir para o desenvolvimento de modelos de resistência a doenças, como a BVD. Mesmo que os mecanismos de infecção, entrada e liberação do BVDV não sejam totalmente compreendidos, a molécula CD46 é considerada o principal receptor celular para o BVDV em bovinos. O mapeamento do local de adesão ao BVDV demonstrou que dois peptídeos, localizados no módulo mais distal da proteína 1 de controle do complemento (CCP1), fornecem a plataforma de adesão ao BVDV. Os objetivos deste estudo foram (i) caracterizar o CD46 em linhagens celulares bovinas; (ii) modificar a plataforma de adesão do receptor por edição gênica; e (iii) investigar a permissibilidade do BVDV à infecção celular em células editadas geneticamente para o gene CD46. Para caracterizar o receptor, foi sequenciado o DNA complementar do gene CD46 em amostras de fibroblastos bovinos e em linhagens celulares de rim bovino Madin-Darby suscetíveis (MDBK) ou resistentes (CRIB) ao BVDV. Posteriormente, por edição gênica pelo sistema CRISPR/Cas9, criaram-se indels no éxon 1 do gene CD46, removendo oligopeptídeos que conformam a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV. Para realizar a edição genômica, duas sequências de RNA-guia (gRNA) foram selecionadas para a deleção do éxon 1 do CD46 em células MDBK. Posteriormente, dois plasmídeos px458, específicos para cada umas das gRNAs, e com expressão da proteína fluorescente verde (GFP), foram co-transfectados em células MDBK. O isolamento de populações de células clonais com modificações específicas das células transfectadas foi realizado por citometria de fluxo, seguido de um período de expansão para estabelecer sub-populações de células clonais. O DNA genômico foi isolado e amplificado por PCR. O produto do PCR foi ligado em plasmídeos pCR-TOPO, transformado em células TOP10 E. coli e sequenciado. Como resultados, identificou-se que as células CRIB codificam uma proteína CD46 semelhante às MDBK e aos fibroblastos, sem nenhuma mutação na região de interesse, com o receptor CD46 não apresentando aparente importância na resistência destas células à infecção por BVDV. Além disso, obtivemos três linhagens celulares MDBK com deleção em segmentos específicos na região codificante para o CCP1 referente a plataforma de adesão ao BVDV. Uma das linhagens apresentou a deleção bialélica, com a edição gênica sendo diferente em cada alelo; outra linhagem apresentou uma edição bialélica, com um dos alelos não apresentando a deleção da plataforma de adesão; e a última linhagem apresentou uma deleção bialélica homozigota. O estudo da susceptibilidade destas células mutantes à infecção pelo BVDV encontra-se em andamento. Com as três linhagens celulares bovinas modificadas geneticamente para a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV, tem-se a expectativa que estas modificações genéticas possivelmente levarão a uma diminuição na infecção pelo BVDV, o que permitirá obtermos mais informações sobre o mecanismo de entrada e infecção do vírus em células bovinas. Tal estratégia mostra-se viável para a futura geração de bovinos resistentes ao BVDV por biotécnicas avançadas da reprodução, como pela clonagem por transferência nuclear de células somáticas (TNCS).

The Bovine Viral Diarrhea virus (BVDV) is one of the major viral pathogens that cause important clinical diseases in cattle. The presence of the virus in herds represents a major risk for productivity due to significant economic losses. The use of gene-editing technology, such as the CRISPR/Cas9 system, in livestock animals can contribute to the development of disease resistance models, such as BVD. Even though the mechanisms of infection, entry and release of BVDV are not yet fully understood, the CD46 molecule is considered the major cellular receptor for BVDV in cattle. The mapping of the adhesion site to the BVDV revealed that two peptides, located in the most distal domain of the complement control protein 1 (CCP1), provide the adhesion platform for the virus. The aims of this study were (i) to characterize CD46 in bovine cell lines; (ii) to modify the platform of adhesion of the CD46 receptor by gene edition; and (iii) to investigate the permissibility of BVDV to cellular infection in CD46 gene-edited cells. To characterize the receptor, the complementary DNAof the gene CD46 was sequenced on samples of fibroblast cells and in Madin-Darby bovine kidney cell lines (MDBK) or MDBK susceptible cells and on cells resistant to BVDV infection (CRIB cells). Afterwards, by gene editing using the CRISPR/Cas9 system, indels were created in the exon 1 of the CD46 gene, removing oligopeptides that form the CD46 receptor adhesion platform to BVDV. To achieve the genomic edition, two sequences of guiding RNA (gRNAs) were selected for exon 1 deletion of CD46 in MDBK cells. Subsequently, two px458 plasmids, each encoding one of the gRNAs, and expressing the green fluorescent protein (GFP), were co-transfected into MDBK cells. Isolation of clonal cell populations with specific modifications of the transfected cells was done through Fluorescence Activated Cell Sorting, followed by an expansion period to establish new clonal cell lines. Genomic DNA was isolated and amplified by PCR. The PCR amplified products were ligated into pCR-TOPO plasmid and transformed into TOP10 E. coli cells, and DNA-sequenced. Our results indicated that CRIB cells express a CD46 protein similar to MDBK and fibroblast cells, without any mutation in the region of interest, with the CD46 receptor in CRIB cells showing an apparent no importance in the resistance to BVDV infection. Furthermore, we obtained three MDBK cell lines with deletion in specific segments in the coding region for CCP1 referring to the BVDV adhesion platform. One of the lines presented a biallelic deletion of the adhesion platform, with gene edition being different in each allele; another line presented a biallelic edition, with one of the alleles not containing the adhesion platform deletion; and the last line presented a biallelic homozygous deletion. However, the study of the susceptibility of such mutant cells to BVDV infection is still ongoing. With the three genetically modified bovine cell lines to the CD46 receptor adhesion platform on BVDV, such genetic modification will possibly lead to a decrease in BVDV infection, which may allow us to obtain more pieces of information regarding mechanisms of virus entry and infection in bovine cells. Such a strategy proves to be feasible for the future generation of BVDV resistant animals by the use of advanced reproductive technologies, such as cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT).

Engenharia genética no probiótico Bacillus subtilis: expressão de fitase fúngica melhora parâmetros zootécnicos, sistema imune, resposta inflamatória e defesa antioxidante em zebrafish (Danio rerio) alimentado com dieta rica em matéria vegetal

A enzima fitase catalisa a hidrólise de fitato, o qual representa a forma de armazenamento do fósforo nos vegetais. O fitato é um fator antinutricional para animais monogástricos, pois estes são ineficientes na produção de fitases intestinais. Portanto, o incremento de ingredientes vegetais na ração em sistemas de produção animal é limitado. Com isso, o objetivo da presente tese foi obter um Bacillus subtilis geneticamente modificado capaz de expressar uma fitase fúngica e avaliar a eficácia desta enzima na dieta do zebrafish (Danio rerio). No capítulo I desenvolvemos uma construção genética baseada em plasmídeo replicativo contendo o gene da fitase do fungo Aspergillus fumigatus (Phy-Af) fusionado ao sinal de secreção do gene da levansacarase (SacB) do próprio B. subtilis. A atividade da fitase produzida pelo B. subtilis transgênico no sobrenadante da cultura foi 2,7 vezes superior do que os controles. Após determinar a atividade da fitase, realizamos um experimento de alimentação do zebrafish, durante 30 dias, com uma dieta rica em vegetais. O experimento foi constituído por dois grupos: Phy-Af (com dieta suplementada com B. subtilis expressando a fitase) e o grupo controle (dieta com B. subtilis não transgênico). Foi realizada a biometria inicial dos animais e final para avaliar o desempenho zootécnico e foram analisados genes relacionados com o transporte de peptídeos (slc15a1b e slc15a2), apetite (ghrl), fatores de crescimento muscular (igf1, myod e myog) e metabolismo de minerais (bglap). Os peixes alimentados com o B. subtilis transgênico apresentam melhores índices de desempenho quando comparados ao controle. Neste mesmo sentido, todos os genes analisados foram superexpressados no grupo tratado com o probiótico expressando a fitase fúngica. No capítulo II, o objetivo foi avaliar o efeito do B. subtilis transgênico sobre o sistema imune e a resposta inflamatória no zebrafish alimentado com a ração rica em matéria vegetal. Neste caso, foram analisados genes relacionados com a produção de linfócitos (cd4 e ikzf1), resposta inflamatória (ifnphi1, ifng, tnf- e il1b) e a resposta ao estresse oxidativo (sod1). Novamente, todos os genes analisados foram induzidos nos zebrafish alimentados com dieta suplementada com o probiótico transgênico. Considerando que plasmídeo replicativo pode ser instável e levar a perda da característica ao longo das gerações bacterianas, no capítulo III abordamos a aplicação da tecnologia CRISPRCas9 para edição do genoma do B. subtilis usando a construção da fitase fúngica desenvolvida no capítulo I. Como resultado, obtivemos a cepa BsJJ14 com o gene da vi fitase fúngica (oriunda de A. fumigatus) integrada ao genoma do B. subtilis e comparamos capacidade de manutenção da resistência ao antibiótico com a cepa PhyAf, que no capítulo III denominamos de BsJJ5. Os resultados mostraram que após 65 gerações, apenas 11% das células (BsJJ5) mantiveram o fenótipo de resistência a antibióticos, e a linhagem transformada pelo método CRISPR-Cas9 não perdeu o fenótipo no final do experimento. O perfil de atividade da cepa BsJJ14 foi 20% maior do que na cepa BsJJ5 transformada com o plasmídeo replicativo. Em conclusão, a presente tese demostrou que as técnicas usadas para a transformação de Bacillus tanto via epissomal quanto integrada ao genoma foram eficientes e, além disso, a fitase recombinante apresentou atividade enzimática e promoveu efeitos benéficos à saúde do zebrafish alimentado com uma dieta rica em ingrediente vegetal

The phytase enzyme catalyzes the phytate hydrolysis, which represents the form of storage of phosphorus in vegetables. Phytate is an antinutritional factor for monogastric animals, since they are inefficient in the production of intestinal phytases. Therefore, the increment of plant ingredients in the feed in animal production systems is limited. The objective of the present thesis was to obtain a genetically modified Bacillus subtilis capable of expressing a fungal phytase and to evaluate the efficacy of this enzyme in the diet of zebrafish (Danio rerio). In chapter I we developed a replicative plasmid-based genetic construct containing the phytase gene from the fungus Aspergillus fumigatus (Phy-Af) fused to the secretory signal of the B. subtilis levansacarase (SacB) gene. The phytase activity produced by transgenic B. subtilis in the culture supernatant was 2.7 fold higher than the controls. After determining phytase activity, we performed a zebrafish feeding experiment for 30 days on a plant-rich diet. The experiment consisted of two groups: Phy-Af (with diet supplemented with B. subtilis expressing phytase) and the control group (diet with non-transgenic B. subtilis). The initial and final biometrics were used to evaluate the performance of the animals and to analyze the genes related to peptide transport (slc15a1b and slc15a2), appetite (ghrl), muscle growth factors (igf1, myod and myog) and mineral metabolism (bglap). The fish fed with transgenic B. subtilis presented better performance indices when compared to the control. In the same sense, all the genes analyzed were induced in the group treated with the probiotic expressing fungal phytase. In chapter II, the objective was to evaluate the effect of transgenic B. subtilis on the immune system and the inflammatory response in zebrafish fed with the feed rich in vegetable matter. In this case, genes related to the production of lymphocytes (cd4 and ikzf1), inflammatory response (ifn1, ifng, tnf-alpha and il1b) and the response to oxidative stress (sod1) were analyzed. Again, all genes analyzed were induced in zebrafish fed a diet supplemented with the transgenic probiotic. Considering that the replicative plasmid may be unstable and lead to loss of trait throughout the bacterial generations, in chapter III we approached the application of CRISPR-Cas9 technology for editing the genome of B. subtilis using the fungal phytase construct developed in Chapter I. As a result, we obtained the strain BsJJ14 with fungal phytase integrated into the genome of B. subtilis and compared maintenance capacity of antibiotic resistance with the strain Phy-Af, which in chapter III we call BsJJ5. The results showed that after 65 generations, only 11% of the BsJJ5 cells maintained the viii antibiotic resistance phenotype, and the strain transformed by the CRISPR-Cas9 method did not lose the phenotype at the end of the experiment. The activity profile of the BsJJ14 strain was 20% greater than in the BsJJ5 strain transformed with the replicative plasmid. In conclusion, the present thesis demonstrated that the techniques used for the transformation of B. subtilis both episomal and integrated into the genome were efficient and, in addition, recombinant phytase showed enzymatic activity and promoted beneficial health effects of zebrafish fed on a diet rich in vegetable ingredient

Edição do gene TFAM pela engenharia CRISPR Cas9 em modelo bovino

O fator de transcrição A mitocondrial (TFAM) é um membro da subfamília HMGB que se liga a promotores do DNA mitocondrial (mtDNA). É um gene extremamente importante para a manutenção do mtDNA, pois regula o número de cópias e é essencial para inicialização da replicação e transcrição do mtDNA. Recentemente técnicas de edição genica vêm sendo utilizada como uma ferramenta bastante eficaz na manipulação genômica. A nova tecnologia chamada de CRISPR/ Cas9 (Regulary interspaced clustered short palindromic repeats) utiliza um RNA guia (gRNA) curto que contém 20 nucleotídeos complementares a sequência de DNA. Seu mecanismo é simples, quando o RNA guia se liga ao local alvo, a proteína Cas9 é recrutada para se ligar no local alvo e induzir a dupla quebra na cadeia de DNA. Neste contexto, este estudo propôs editar o gene TFAM pela tecnologia CRISPR Cas9, com o objetivo de gerar células ROS zero através do knock-out em fibroblastos bovinos. Os fibroblastos bovinos utilizados neste estudo foram derivados de uma biopsia de pele coletada de animais adultos. A sequência do gene foi obtida a partir do banco de dados GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) e esta foi inserida no site CRISPR direct(crispr.dbcls.jp) e no site rgenome (rgenome.net) a fim de desenhar o gRNA. O gRNA foi desenhado no exon 1 do gene TFAM bovino e depois foi realizado todo o procedimento de clonagem. Os fibroblastos foram cultivados e após as células atingirem 80% de confluência, estas foram eletrotransfectados com Cas9 (Addgene 48668), GFP e plasmídeo controle. Foi utilizado o kit Primary Mammalian Fibroblasts (VPI-1002) e a transfecção foi realizada no equipamento AMAXA Nucleofector 2B. Após a transfecção foi realizada a citometria de fluxo para avaliar a taxa de transfecção, e as células pós transfectas foram plaqueadas em placas de 96 poços, pela técnica de sorting. O sorting separarou uma célula por poço de 96. Após dias em cultura essas células foram tripsinizadas em placas de 6 poços e o DNA genômico foi extraído, utilizando o kit Qiamp DNA microkit-Qiagen. Para avaliar a frequência de mutações, foi realizado a digestão com a enzima T7 endonuclease, e após confirmado mutações, os clones foram enviados para analise de sequenciamento. Observamos uma taxa de transfecção eficiente de 51,3%. Obtivemos 40 clones com DNA extraído para analise, no qual 6 destes possuiam mutações no local de inserção da CRISPR Cas 9. Concluímos até o momento que o desenho da CRISPR foi eficiente e que obtivemos uma deleção do gene TFAM.

The mitochondrial transcription factor A (TFAM) is a member of HMGB subfamily, that bind to promoters of mtDNA. It is a very important gene that maintains mtDNA, regulates the number of copies and is essential for the initiation of transcription mtDNA. Recently, gene edition techniques have been used as a very effective tool in genomic manipulation. The new technology called CRISPR/Cas9 (Regulary interspaced clustered short palindromic repeats) uses a short gRNA containing 20 nucleotides complementary to the DNA sequence. When gRNA binds to the target site, the Cas9 protein is recruited to bind in the chosen location and induce double strands breaks in DNA. In this context, this study proposed to edit the TFAM gene by CRISPR Cas9 technology aiming to generate ROS zero cell through the knock-out in bovine fibroblasts. Bovine fibroblasts used in this study were derived from a skin biopsy collected from an adult. The sequence obtained from the database GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) was inserted in the CRISPR direct site (crispr.dbcls.jp) and in the rgenome site (rgenome.net) to design the RNA guide. The gRNA was designed in the CRISPR direct site (crispr.dbcls.jp) for the Exon 1 of the gene TFAM bovine and after was performed the CRISPR cloning. The fibroblast were cultured and after reaching 80% of confluence, were electro-transfected with Cas9 (Addgene 48668) and control plasmids using the Nucleofector TM Kit for Primary Mammalian Fibroblasts (VPI-1002) and transfected with Cas 9 (Addgene 48668), GFP and control plasmid. Were used the Primary Mammalian Fibroblasts (VPI-1002) and the transfection was performed on the AMAXA Nucleofector 2B. Post transfected cells were analyzed by flow cytometry to evaluate the rate of transfection. The cells post transfected were further split into 1 cell/well (96- well plates for cell cloning). After days in culture these cells were trypsinized in 6-well plates and the genomic DNA was extracted using the Qiamp DNA microkit- Qiagen. To assess the mutation frequency, T7 endonuclease assay were performed and after confirmed the mutations, the clones were sent for sequencing analysis. We observed that the cells were efficiently transfected since they have a rate of 51,3% transfection. We obtained 40 clones with extracted for analysis, in which 6 of these had mutations at the insertion site of CRISPR/Cas 9. We concluded that until this moment the CRISPR design was efficient and that we obtained a deletion of the TFAM gene.

Identification of early flowering mutant gene in Phalaenopsis amabilis (L) Blume for sgRNA construction in CRISPR/Cas9 genome editing system / Identificação do gene mutante de floração precoce em Phalaenopsis amabilis (L) Blume para construção de sgRNA no sistema de edição de genoma CRISPR/Cas9

Phalaenopsis amabilis (L.) Blume commonly called Moth Orchid (Orchidaceae) is a natural orchid species designated as the National Flower of Indonesia for its beautiful flower shape and long-lasting flowering period. Basically, P. amabilis has a long vegetative phase that cause late flowering, about 2 to 3 years for flowering, hence a method to shorten vegetative period is desired. The latest technological approach that can be used to accelerate flowering of P. amabilis is the CRISPR/Cas9 genome editing method to inactivate the GAI (Gibberellic Acid Insensitive) gene as a mutant gene that can accelerate the regulation of FLOWERING TIME (FT) genes flowering biosynthesis pathway. The approach that needs to be taken is to silence the GAI gene with a knockout system which begins with identifying and characterizing the GAI target gene in the P. amabilis which will be used as a single guide RNA. CRISPR/Cas9 mediated knockout efficiency is highly dependent on the properties of the sgRNA used. SgRNA consists of a target sequence, determining its specificity performance. We executed phylogenetic clustering for the PaGAI protein with closely related orchid species such as Dendrobium capra, Dendrobium cultivars and Cymbidium sinensis. SWISS-Model as tool webserver for protein structure homology modeling. Results show that P. amabilis has a specific domain with the occurrence of point mutations in the two conservative domains. Therefore, a single guide RNA reconstruction needs to be implemented.

Phalaenopsis amabilis (L.) Blume, comumente chamada de orquídea mariposa (Orchidaceae), é uma espécie natural de orquídea designada como a flor nacional da Indonésia por seu belo formato de flor e período de floração duradouro. Basicamente, P. amabilis tem uma longa fase vegetativa que causa floração tardia, cerca de 2 a 3 anos para a floração, portanto, um método para encurtar o período vegetativo é desejado. A mais recente abordagem tecnológica que pode ser utilizada para acelerar a floração de P. amabilis é o método de edição do genoma CRISPR/Cas9 para inativar o GAI (Gibberellic Acid Insensitive) que pode ser usado como um gene mutante para acelerar a regulação da floração dos genes FLOWERING TIME (FT), via de biossíntese. Para isto, a melhor abordagem é silenciar o GAI gene com um sistema knockout que deve ser iniciado com a identificação e caracterização do gene alvo GAI no P. amabilis, e que, posteriormente, será utilizado como um único RNA guia. A eficiência de nocaute mediada por CRISPR/Cas9 é altamente dependente das propriedades do sgRNA usados. O SgRNA consiste em uma sequência alvo, determinando seu desempenho de especificidade. Executamos agrupamento filogenético para a proteína PaGAI com espécies de orquídeas intimamente relacionadas, como Dendrobium capra, Dendrobium cultivars e Cymbidium sinensis. SWISS-Model foi utilizado como ferramenta webserver para modelagem de homologia de estruturas de proteínas. Os resultados mostram que P. amabilis possui um domínio específico com ocorrência de mutações pontuais nos dois domínios conservativos. Portanto, uma única reconstrução de RNA guia precisa ser implementada.