Comparison of protocols for the extraction of genomic DNA from Sharpshooters (Hemiptera: Cicadellidae) for the detection of Xylella fastidiosa / Comparação de protocolos para a extração de DNA genômico de cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae) para a detecção de Xylella fastidiosa

The bacterium Xylella fastidiosa, the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), is dependent on vector insects for its spread and infection of citrus hosts. The insects, leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) transmit the bacteria to healthy plants after feeding on infected plants. The objective of this study was to develop and compare methods for extracting genomic DNA from sharpshooters to detect X. fastidiosa. The DNA extraction from insects was performed according to a phenol-chloroform based DNA extraction in conjunction with two commercial kits, Dneasy® Plant Mini Kit and blood & tissue Dneasy® Handbook (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). The heads of the following species of sharpshooter were used: Dilobopterus costalimai, Acrogonia citrina, Oncometopia facialis, Bucephalogonia xanthophis, Macugonalia leucomelas and Homalodisca ignorata. Based on the numeric differences between independent samples, the results showed the use of the phenol:chloroform extraction method (36/50 positives) and the DNeasy® Plant Mini Kit (33/50) resulting in the most detections of X. fastidiosa from leafhopper samples. As these two methods detected Xylella in the greatest number of infected samples, they may be more efficient to use for detection purposes in leafhoppers.(AU)

A bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros, é dependente da ação de insetos vetores para sua disseminação e infecção em plantas cítricas hospedeiras. Os insetos cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae) transmitem a bactéria para plantas sadias depois de se alimentarem das plantas contaminadas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e comparar métodos de extração de DNA genômico de cigarrinhas a fim de detectar a bactéria X. fastidiosa. A extração de DNA foi realizada de acordo com protocolo à base de fenol-clorofórmio em conjunto com dois kits comerciais: Dneasy® Plant Mini Kit and Blood & Tissue Dneasy® Handbook (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Utilizou-se a cabeça das seguintes espécies de cigarrinhas: D. costalimai, A. citrina, O. facialis, B. xanthophis, M. leucomelas e H. ignorata. Com base nas diferenças numéricas entre as amostras independentes, os resultados mostraram o uso do método de extração fenol-clorofórmio (36/50 positivos) e o kit comercial DNeasy® Plant Mini Kit (33/50) resultando nas maiores detecções de X. fastidiosa nas amostras de cigarrinhas. Como esses dois métodos detectaram a presença de X. fastidiosa no maior número de amostras infectadas, eles podem ser mais eficientes para o uso na detecção em cigarrinhas.(AU)

Comparison of protocols for the extraction of genomic DNA from Sharpshooters (Hemiptera: Cicadellidae) for the detection of Xylella fastidiosa / Comparação de protocolos para a extração de DNA genômico de cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae) para a detecção de Xylella fastidiosa

The bacterium Xylella fastidiosa, the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), is dependent on vector insects for its spread and infection of citrus hosts. The insects, leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) transmit the bacteria to healthy plants after feeding on infected plants. The objective of this study was to develop and compare methods for extracting genomic DNA from sharpshooters to detect X. fastidiosa. The DNA extraction from insects was performed according to a phenol-chloroform based DNA extraction in conjunction with two commercial kits, Dneasy® Plant Mini Kit and blood & tissue Dneasy® Handbook (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). The heads of the following species of sharpshooter were used: Dilobopterus costalimai, Acrogonia citrina, Oncometopia facialis, Bucephalogonia xanthophis, Macugonalia leucomelas and Homalodisca ignorata. Based on the numeric differences between independent samples, the results showed the use of the phenol:chloroform extraction method (36/50 positives) and the DNeasy® Plant Mini Kit (33/50) resulting in the most detections of X. fastidiosa from leafhopper samples. As these two methods detected Xylella in the greatest number of infected samples, they may be more efficient to use for detection purposes in leafhoppers.(AU)

A bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros, é dependente da ação de insetos vetores para sua disseminação e infecção em plantas cítricas hospedeiras. Os insetos cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae) transmitem a bactéria para plantas sadias depois de se alimentarem das plantas contaminadas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e comparar métodos de extração de DNA genômico de cigarrinhas a fim de detectar a bactéria X. fastidiosa. A extração de DNA foi realizada de acordo com protocolo à base de fenol-clorofórmio em conjunto com dois kits comerciais: Dneasy® Plant Mini Kit and Blood & Tissue Dneasy® Handbook (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Utilizou-se a cabeça das seguintes espécies de cigarrinhas: D. costalimai, A. citrina, O. facialis, B. xanthophis, M. leucomelas e H. ignorata. Com base nas diferenças numéricas entre as amostras independentes, os resultados mostraram o uso do método de extração fenol-clorofórmio (36/50 positivos) e o kit comercial DNeasy® Plant Mini Kit (33/50) resultando nas maiores detecções de X. fastidiosa nas amostras de cigarrinhas. Como esses dois métodos detectaram a presença de X. fastidiosa no maior número de amostras infectadas, eles podem ser mais eficientes para o uso na detecção em cigarrinhas.(AU)

Bioassay assessment of metarhizium anisopliae (metchnikoff) sorokin (deuteromycota: hyphomycetes) against Oncometopia facialis (signoret) (hemiptera: cicadellidae)

Citrus Variegated Chlorosis (CVC) is an economically important, destructive disease in Brazil and is caused by Xylella fastidiosa and transmitted by sharpshooter insects. In this study, the efficacy of the fungus Metarhizium anisopliae in controlling the sharpshooter Oncometopia facialis was studied by bioassay conditions. In the bioassay, insects were sprayed with a suspension containing 5 X 10(7) conidia mL-1. Adults captured in the field were treated in groups of 10 in a total of 11 replications per treatment. Significant differences between the natural mortality and the mortality of insects treated with the fungus were observed 6 days after inoculations (P 0.05). These significant differences increased until 10 days after treatment. The fungus caused 87.1% mortality, with the LT50 varying from 5 to 6 days. The LC50 was 1.2 X 10(6) conidia mL-1, varying from 7.7 X 10(5) to 2 X 10(6) conidia mL-1. The results showed that the sharpshooter O. facialis was susceptible to the entomopathogenic action of M. anisopliae in controlled condition during bioassay.

A Clorose Variegada dos Citros (CVC) é uma doença economicamente importante e destrutiva no Brasil e é causada pela bactéria Xylella fastidiosa e transmitida por insetos vetores tal como Oncometopia facialis. Nesse estudo, a eficácia do fungo Metarhizium anisopliae em controlar o inseto vetor O. facialis foi estudada em condições de bioensaio. Nesse bioensaio, insetos foram pulverizados com uma suspensão de 5 X 10(7) conídio mL-1. Insetos-adultos capturados no campo foram tratados em grupos de 10, em um total de 11 replicatas por tratamento. Diferenças significativas entre a mortalidade natural e a mortalidade dos insetos tratados com o fungo foram observadas em 6 dias após a inoculação (P 0.05). Estas diferenças significativas aumentaram antes do décimo dia após o tratamento. O fungo causou uma mortalidade de 87,1%, com uma LT50 variando entre 5 e 6 dias. A LC50 foi de 1,2 X 10(6) conídio mL-1, variando de 7,7 X 10(5) a 2 X 10(6) conídio mL-1. Estes resultados mostraram que o vetor O. facialis foi susceptível a ação entomopatogênica de M. anisopliae em condições controladas durante o bioensaio.

Host colonization differences between citrus and coffee isolates of Xylella fastidiosa in reciprocal inoculation

Citrus variegated chlorosis (CVC) and coffee stem atrophy (CSA) are important diseases in Brazil associated with closely-related strains of Xylella fastidiosa, but little is know about host aoverlappingnd importance of citrus and coffee as inoculum sources of these strains. In this study, reciprocal-inoculation experiments were performed to determine if CVC and CSA isolates are biologically similar within citrus and coffee plants. These two hosts were mechanically inoculated with a CVC and a CSA isolate of X. fastidiosa at four concentrations ranging between10³ and 10(9) colony forming units CFU mL-1. At two, four and eight months after inoculation, the infection efficiency and bacterial populations of the isolates in each host were determined by culturing. The CVC isolate infected both citrus and coffee plants, but developed lower populations in coffee. The CSA isolate did not colonize citrus. Inoculation of coffee plants with the CVC isolate resulted in low rates of infection and required an inoculum concentration ten-fold higher than that necessary to obtain a similar (25%) rate of infection in citrus. The relatively low infection rates and bacterial numbers of the CVC isolate in coffee plants compared with those observed in citrus suggest that coffee is not a suitable host to serve as a source of inoculum of the CVC strain for primary spread to citrus or within coffee plantations.

Clorose variegada dos citros (CVC) e atrofia dos ramos do cafeeiro (ARC) são doenças importantes no Brasil, associadas a estirpes de Xylella fastidiosa que são geneticamente próximas. Entretanto, pouco se sabe a respeito de plantas hospedeiras em comum e da importância de citros e cafeeiro como fontes de inóculo dessas estirpes. Neste estudo, realizaram-se experimentos de inoculação recíproca para determinar se isolados de X. fastidiosa de CVC e de ARC são biologicamente semelhantes em plantas de citros e café. Estes dois hospedeiros foram mecanicamente inoculados com um isolado de CVC e um isolado de ARC, em quatro concentrações que variaram de 10³ a 10(9) unidades formadoras de colônias UFC mL-1. Aos dois, quatro e oito meses após a inoculação, a eficiência de infecção e a população bacteriana dos isolados em cada hospedeiro foram determinadas por cultura. O isolado de CVC infectou tanto plantas de citros quanto de café, mas desenvolveu populações mais baixas em cafeeiro. O isolado de ARC não colonizou citros. A inoculação de plantas de café com o isolado de CVC resultou em baixas taxas de infecção e exigiu uma concentração de inóculo dez vezes mais alta que a necessária para obter uma taxa de infecção semelhante (25%) em citros. A reduzida taxa de infecção e a baixa população bacteriana do isolado de CVC em cafeeiro em relação a citros sugerem que cafeeiro não é um hospedeiro adequado para atuar como fonte de inóculo da estirpe de CVC para disseminação deste patógeno para pomares de laranja ou dentro de cafezais.

Host colonization differences between citrus and coffee isolates of Xylella fastidiosa in reciprocal inoculation

Citrus variegated chlorosis (CVC) and coffee stem atrophy (CSA) are important diseases in Brazil associated with closely-related strains of Xylella fastidiosa, but little is know about host aoverlappingnd importance of citrus and coffee as inoculum sources of these strains. In this study, reciprocal-inoculation experiments were performed to determine if CVC and CSA isolates are biologically similar within citrus and coffee plants. These two hosts were mechanically inoculated with a CVC and a CSA isolate of X. fastidiosa at four concentrations ranging between10³ and 10(9) colony forming units CFU mL-1. At two, four and eight months after inoculation, the infection efficiency and bacterial populations of the isolates in each host were determined by culturing. The CVC isolate infected both citrus and coffee plants, but developed lower populations in coffee. The CSA isolate did not colonize citrus. Inoculation of coffee plants with the CVC isolate resulted in low rates of infection and required an inoculum concentration ten-fold higher than that necessary to obtain a similar (25%) rate of infection in citrus. The relatively low infection rates and bacterial numbers of the CVC isolate in coffee plants compared with those observed in citrus suggest that coffee is not a suitable host to serve as a source of inoculum of the CVC strain for primary spread to citrus or within coffee plantations.

Clorose variegada dos citros (CVC) e atrofia dos ramos do cafeeiro (ARC) são doenças importantes no Brasil, associadas a estirpes de Xylella fastidiosa que são geneticamente próximas. Entretanto, pouco se sabe a respeito de plantas hospedeiras em comum e da importância de citros e cafeeiro como fontes de inóculo dessas estirpes. Neste estudo, realizaram-se experimentos de inoculação recíproca para determinar se isolados de X. fastidiosa de CVC e de ARC são biologicamente semelhantes em plantas de citros e café. Estes dois hospedeiros foram mecanicamente inoculados com um isolado de CVC e um isolado de ARC, em quatro concentrações que variaram de 10³ a 10(9) unidades formadoras de colônias UFC mL-1. Aos dois, quatro e oito meses após a inoculação, a eficiência de infecção e a população bacteriana dos isolados em cada hospedeiro foram determinadas por cultura. O isolado de CVC infectou tanto plantas de citros quanto de café, mas desenvolveu populações mais baixas em cafeeiro. O isolado de ARC não colonizou citros. A inoculação de plantas de café com o isolado de CVC resultou em baixas taxas de infecção e exigiu uma concentração de inóculo dez vezes mais alta que a necessária para obter uma taxa de infecção semelhante (25%) em citros. A reduzida taxa de infecção e a baixa população bacteriana do isolado de CVC em cafeeiro em relação a citros sugerem que cafeeiro não é um hospedeiro adequado para atuar como fonte de inóculo da estirpe de CVC para disseminação deste patógeno para pomares de laranja ou dentro de cafezais.

Cloning and expression of cellulase XF-818 of Xylella fastidiosa in Escherichia Coli

Xylella fastidiosa's genome was the first of a plant pathogen to be completely sequenced. Through comparative sequence analysis many genes were identified and, among them, several potentially involved in plant-pathogen interaction. However, the biological role of each gene should be assigned experimentally. On this regard, heterologous protein expression is a powerful tool to produce proteins from such genes, allowing their characterization. X. fastidiosa lives inside xylem vessels and eventually would degrade pit membranes from xylem cells to move radialy into the host. The identification of several putative plant cell wall degrading enzymes on X. fastidiosa genome prompted the assession of the function of such proteins. The open reading frame (ORF) Xf-818 was cloned into expression vector pET20b and E. coli cells harboring such plasmid exhibited cellulase activity. Using IPTG at 0.4 mmol L-1 with a 12 h incubation at 32°C are the best conditions to produce higher amounts of heterologous protein. The enzyme degrades cellulose confirming the endoglucanase activity of Xf-818.

Xylella fastidiosa foi a primeira bactéria fitopatogênica que teve seu genoma completamente seqüenciado. A identificação de diversos genes, através de similaridade de seqüências, indicou os possíveis mecanismos de patogenicidade da bactéria. Entretanto, a determinação da função de um gene requer a confirmação experimental e, neste aspecto, a expressão heteróloga é uma poderosa ferramenta. X. fastidiosa coloniza somente o xilema das plantas hospedeiras e a identificação putativa de diversos genes semelhantes a enzimas que degradam a parede celular vegetal, estimularam o presente estudo de catacterização destas enzimas. A clonagem da ORF Xf-818 de X. fastidiosa no vetor de expressão pET20b possibilitou a produção da proteína heterologamente em E. coli. O emprego de IPTG a 0,4 mmol L-1 com 12 h a 32°C, possibilitou as melhores condições para E. coli produzir a proteína heteróloga. Clones de E. coli que expressam Xf-818, apresentam atividade celulásica, degradando eficientemente a celulose. A identificação de Xf-818 como uma endoglicanase foi assim confirmada.

Cloning and expression of cellulase XF-818 of Xylella fastidiosa in Escherichia Coli

Xylella fastidiosa's genome was the first of a plant pathogen to be completely sequenced. Through comparative sequence analysis many genes were identified and, among them, several potentially involved in plant-pathogen interaction. However, the biological role of each gene should be assigned experimentally. On this regard, heterologous protein expression is a powerful tool to produce proteins from such genes, allowing their characterization. X. fastidiosa lives inside xylem vessels and eventually would degrade pit membranes from xylem cells to move radialy into the host. The identification of several putative plant cell wall degrading enzymes on X. fastidiosa genome prompted the assession of the function of such proteins. The open reading frame (ORF) Xf-818 was cloned into expression vector pET20b and E. coli cells harboring such plasmid exhibited cellulase activity. Using IPTG at 0.4 mmol L-1 with a 12 h incubation at 32°C are the best conditions to produce higher amounts of heterologous protein. The enzyme degrades cellulose confirming the endoglucanase activity of Xf-818.

Xylella fastidiosa foi a primeira bactéria fitopatogênica que teve seu genoma completamente seqüenciado. A identificação de diversos genes, através de similaridade de seqüências, indicou os possíveis mecanismos de patogenicidade da bactéria. Entretanto, a determinação da função de um gene requer a confirmação experimental e, neste aspecto, a expressão heteróloga é uma poderosa ferramenta. X. fastidiosa coloniza somente o xilema das plantas hospedeiras e a identificação putativa de diversos genes semelhantes a enzimas que degradam a parede celular vegetal, estimularam o presente estudo de catacterização destas enzimas. A clonagem da ORF Xf-818 de X. fastidiosa no vetor de expressão pET20b possibilitou a produção da proteína heterologamente em E. coli. O emprego de IPTG a 0,4 mmol L-1 com 12 h a 32°C, possibilitou as melhores condições para E. coli produzir a proteína heteróloga. Clones de E. coli que expressam Xf-818, apresentam atividade celulásica, degradando eficientemente a celulose. A identificação de Xf-818 como uma endoglicanase foi assim confirmada.

Identification of a non-host plant of Xylella fastidiosa to rear healthy sharpshooter vectors

Rearing leafhopper (Hemiptera: Cicadellidae) vectors free of Xylella fastidiosa is a requirement for studies of various aspects of vector-pathogen interactions. The selection of a plant that allows vector development but not bacterial multiplication is desirable to produce healthy vectors. In this study, two leafhopper hosts, Vernonia condensata ('boldo') and Aloysia virgata ('lixeira') were needle inoculated with citrus and coffee strains of X. fastidiosa to evaluate if these plants support pathogen colonization. The inoculated plants did not present symptoms and the pathogen was not detected by culture and PCR tests, neither soon after inoculation (7-14 days) nor later, at 1, 4, 6 and 12 months after inoculation. To obtain healthy adults of the leafhopper vectors Acrogonia citrina, Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus costalimai, Homalodisca ignorata and Oncometopia facialis, early-instar nymphs were reared on V. condensata. X. fastidiosa was not detected in any of 175 adults obtained. V. condensata and A. virgata are nonpropagative hosts of X. fastidiosa and enable the production of healthy leafhoppers for vector studies.

A obtenção de cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae) livres de Xylella fastidiosa é importante para estudos de interação entre essa bactéria e seus vetores, sendo desejável a seleção de uma planta que permita a criação desses insetos, mas não a multiplicação da bactéria. Neste estudo, duas plantas hospedeiras de cigarrinhas, Vernonia condensata (boldo) e Aloysia virgata (lixeira), foram inoculadas por agulha com as estirpes de citros e de cafeeiro de X. fastidiosa, para avaliar a possibilidade deste patógeno colonizá-las. Não foram observados sintomas, nem se detectou a bactéria por isolamento em meio de cultura e/ou PCR em períodos curtos (7 e 14 dias) ou longos (1, 4, 6 e 12 meses) após a inoculação. Para obtenção de adultos sadios das cigarrinhas vetoras, Acrogonia citrina, Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus costalimai, Homalodisca ignorata e Oncometopia facialis, ninfas de primeiros ínstares foram criadas em plantas de boldo. Não foi detectada X. fastidiosa em nenhum de 175 adultos obtidos da criação. V. condensata e A. virgata não permitem a colonização de X. fastidiosa, possibilitando assim a obtenção de cigarrinhas sadias para estudos com vetores.

Identification of a non-host plant of Xylella fastidiosa to rear healthy sharpshooter vectors

Rearing leafhopper (Hemiptera: Cicadellidae) vectors free of Xylella fastidiosa is a requirement for studies of various aspects of vector-pathogen interactions. The selection of a plant that allows vector development but not bacterial multiplication is desirable to produce healthy vectors. In this study, two leafhopper hosts, Vernonia condensata ('boldo') and Aloysia virgata ('lixeira') were needle inoculated with citrus and coffee strains of X. fastidiosa to evaluate if these plants support pathogen colonization. The inoculated plants did not present symptoms and the pathogen was not detected by culture and PCR tests, neither soon after inoculation (7-14 days) nor later, at 1, 4, 6 and 12 months after inoculation. To obtain healthy adults of the leafhopper vectors Acrogonia citrina, Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus costalimai, Homalodisca ignorata and Oncometopia facialis, early-instar nymphs were reared on V. condensata. X. fastidiosa was not detected in any of 175 adults obtained. V. condensata and A. virgata are nonpropagative hosts of X. fastidiosa and enable the production of healthy leafhoppers for vector studies.

A obtenção de cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae) livres de Xylella fastidiosa é importante para estudos de interação entre essa bactéria e seus vetores, sendo desejável a seleção de uma planta que permita a criação desses insetos, mas não a multiplicação da bactéria. Neste estudo, duas plantas hospedeiras de cigarrinhas, Vernonia condensata (boldo) e Aloysia virgata (lixeira), foram inoculadas por agulha com as estirpes de citros e de cafeeiro de X. fastidiosa, para avaliar a possibilidade deste patógeno colonizá-las. Não foram observados sintomas, nem se detectou a bactéria por isolamento em meio de cultura e/ou PCR em períodos curtos (7 e 14 dias) ou longos (1, 4, 6 e 12 meses) após a inoculação. Para obtenção de adultos sadios das cigarrinhas vetoras, Acrogonia citrina, Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus costalimai, Homalodisca ignorata e Oncometopia facialis, ninfas de primeiros ínstares foram criadas em plantas de boldo. Não foi detectada X. fastidiosa em nenhum de 175 adultos obtidos da criação. V. condensata e A. virgata não permitem a colonização de X. fastidiosa, possibilitando assim a obtenção de cigarrinhas sadias para estudos com vetores.