Physical evaluation, morphological and identification of seminal proteins in Santa Ines sheep / Avaliação física, morfológica e identificação de proteínas seminais em ovinos da raça Santa Inês

This study aimed to identify proteins in the seminal plasma associated with fertility in sheep of Santa Inês in Manaus, AM, using twodimensional electrophoresis techniques associated with mass spectrometry. Semen samples from eight adult sheep were collected by removing an aliquot for the physical and morphological assessments of semen and seminal plasma was subjected to SDS-PAGE profile and two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using ImageMaster 2D Platinum software, version 6.0. The selected individual spots were cut from the master gel, digested with trypsin and subjected to identification by mass spectrometry (MALDITof / Tof). Of the 108 spots detected in the gel, it selected 10 differential spots (based on the distribution thereof in the bidimensional gel and pre-analysis of the 2D ImageMaster Platinum Software) identifying 03 proteins: clusterin, a protein 14-3-3 zeta chain and Ram Seminal versicles 22kDa Protein. The identity of these proteins implies that the components of seminal plasma participate in physiological processes involved in sperm protection, motility and sperm capacitation, all associated with fertility. These proteins need to be better studied to see whether the same could be used as molecular markers of fertility as they were also found in other studies conducted with sheep Santa Ines.(AU)

Este estudo teve como objetivo identificar proteínas do plasma seminal associadas à fertilidade em ovinos da raça Santa Inês em Manaus, AM, utilizando técnicas de eletroforese bidimensional associadas à espectrometria de massa. Amostras de sêmen de oito carneiros adultos foram coletadas, retirando-se uma alíquota para as avaliações físicas e morfológicas do sêmen, e o plasma seminal foi submetido ao perfil SDS-PAGE e à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Os spots selecionados foram cortados individualmente do gel mestre, digeridos com tripsina e submetidos à identificação por espectrometria de massa (MALDI-Tof/Tof). Dos 108 spots detectados no gel, selecionou-se 10 spots diferenciais (com base na distribuição dos mesmos no gel bidimensional e com a pré-análise destes no ImageMaster 2D Platinum Software), identificando-se 03 proteínas: a clusterina, a 14-3-3 protein zeta chain e a Ram Seminal Versicles 22kDa Protein. A identidade dessas proteínas infere que os componentes do plasma seminal participam de processos fisiológicos ligados à proteção do espermatozoide, sua motilidade e capacitação espermática, todos associados à fertilidade. Essas proteínas precisam ser melhor estudadas para verificar se as mesmas poderiam ser utilizadas como marcadores moleculares de fertilidade, já que também foram encontradas em outros trabalhos realizados com ovinos da raça Santa Inês.(AU)

Physical evaluation, morphological and identification of seminal proteins in Santa Ines sheep / Avaliação física, morfológica e identificação de proteínas seminais em ovinos da raça Santa Inês

This study aimed to identify proteins in the seminal plasma associated with fertility in sheep of Santa Inês in Manaus, AM, using twodimensional electrophoresis techniques associated with mass spectrometry. Semen samples from eight adult sheep were collected by removing an aliquot for the physical and morphological assessments of semen and seminal plasma was subjected to SDS-PAGE profile and two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using ImageMaster 2D Platinum software, version 6.0. The selected individual spots were cut from the master gel, digested with trypsin and subjected to identification by mass spectrometry (MALDITof / Tof). Of the 108 spots detected in the gel, it selected 10 differential spots (based on the distribution thereof in the bidimensional gel and pre-analysis of the 2D ImageMaster Platinum Software) identifying 03 proteins: clusterin, a protein 14-3-3 zeta chain and Ram Seminal versicles 22kDa Protein. The identity of these proteins implies that the components of seminal plasma participate in physiological processes involved in sperm protection, motility and sperm capacitation, all associated with fertility. These proteins need to be better studied to see whether the same could be used as molecular markers of fertility as they were also found in other studies conducted with sheep Santa Ines.

Este estudo teve como objetivo identificar proteínas do plasma seminal associadas à fertilidade em ovinos da raça Santa Inês em Manaus, AM, utilizando técnicas de eletroforese bidimensional associadas à espectrometria de massa. Amostras de sêmen de oito carneiros adultos foram coletadas, retirando-se uma alíquota para as avaliações físicas e morfológicas do sêmen, e o plasma seminal foi submetido ao perfil SDS-PAGE e à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Os spots selecionados foram cortados individualmente do gel mestre, digeridos com tripsina e submetidos à identificação por espectrometria de massa (MALDI-Tof/Tof). Dos 108 spots detectados no gel, selecionou-se 10 spots diferenciais (com base na distribuição dos mesmos no gel bidimensional e com a pré-análise destes no ImageMaster 2D Platinum Software), identificando-se 03 proteínas: a clusterina, a 14-3-3 protein zeta chain e a Ram Seminal Versicles 22kDa Protein. A identidade dessas proteínas infere que os componentes do plasma seminal participam de processos fisiológicos ligados à proteção do espermatozoide, sua motilidade e capacitação espermática, todos associados à fertilidade. Essas proteínas precisam ser melhor estudadas para verificar se as mesmas poderiam ser utilizadas como marcadores moleculares de fertilidade, já que também foram encontradas em outros trabalhos realizados com ovinos da raça Santa Inês.

ANÁLISE PROTEÔMICA E METABOLÔMICA DOS FLUIDOS DO TRATO REPRODUTIVO E CÉLULAS ESPERMÁTICAS DE CARNEIROS MORADA NOVA

O objetivo do estudo foi identificar por meio da proteômica e da metabolômica as moléculas presentes no plasma seminal, fluidos das glândulas sexuais acessórias e epidídimos, e membranas espermáticas de carneiros Morada Nova. No estudo 1 foram coletadas amostras de sêmen de seis carneiros (utilizando-se vagina artificial) para obter o plasma seminal e espermatozoides. Posteriormente, os animais foram vasectomizados e o fluido das glândulas acessórias coletado por vagina artificial. Em seguida, os animais foram abatidos e os epidídimos, vesículas seminais e glândulas bulbouretrais foram coletados para a recuperação dos fluidos reprodutivos e espermatozoides epididimários. Por meio de eletroforese bidimensional, espectrometria de massas e ferramentas de bioinformática foi avaliado o proteoma das secreções obtidas do trato reprodutivo e membranas espermáticas. As proteínas mais abundantes no plasma seminal foram binder of sperm 1 (BSP1), binder of sperm 5 (BSP5), bodesina-2 e espermadesina Z13. Proteínas do fluido das glândulas sexuais acessórias que contribuem para a composição do plasma seminal incluem BSPs, bodesinas, 72kDa colagenase tipo IV, BPI fold-containing family A member 1, clusterina, proteína semelhante à ribonuclease inativa 9, inibidor da anidrase carbônica isoforma X2 e albumina. O fluido da cauda do epidídimo contribui para o plasma seminal com proteínas específicas como a lipocalina-5-específica do epidídimo, proteína secretora epididimal E1, prostaglandina-H2 D-isomerase e a espermadesina-1. Comparando os mapas 2-D das proteínas de membrana do espermatozoide ejaculado e da cauda do epidídimo, há um aumento na intensidade e número de spots nos mapas da membrana do espermatozoide ejaculado. Estas proteínas são oriundas do fluido das glândulas acessórias. Futuras pesquisas sobre as proteínas identificadas em nosso estudo podem contribuir para investigações de marcadores para a qualidade espermática e fertilidade. No estudo 2 cinco carneiros adultos da raça Morada Nova foram vasectomizados e o fluido das glândulas acessórias (FGA) foi coletado por vagina artificial. Metabólitos foram extraídos e identificados por GC/MS e LC/MS. Os metabólitos obtidos foram analisados pelos bancos de dados Human Metabolome Database (HMDB), PubChem e LIPID Metabolites and Pathways Strategy. A análise das vias foi realizada utilizando o MetaboAnalyst 3.0. O uso combinado de GC e LC/MS permitiu a identificação de 371 compostos do FGA de carneiros. Estas técnicas apresentaram uma sobreposição de um único metabólito, confirmando a complementaridade das abordagens utilizadas. Lipídios e moléculas semelhantes a lipídios foi a classe mais abundantes no FGA de carneiros, seguida por aminoácidos ácidos, peptídeos e análogos. Os metabólitos mais abundantes foram frutose, glicerol, ácido cítrico, D-manitol, D-glicose e ácido L-(+)-lático. Metabólitos identificados no FGA de carneiros estavam envolvidos em 52 diferentes vias. Os metabólitos do FGA atuam como moduladores da função espermática, portanto, a análise química do fluido das glândulas sexuais acessórias é valiosa para melhor entender a reprodução animal bem como para a investigação de biomarcadores da fertilidade.

The objective of the present study was to identify and characterize, through omics technologies (proteomics and metabolomics), the components present in the secretions of the genital tract and sperm cells of Morada Nova rams. In study 1, Fresh semen samples were collected from six adult rams (using an artificial vagina) and then obtained whole seminal plasma and ejaculated sperm. After, rams were vasectomized and fluid of accessory sex glands was collected (also using an artificial vagina). Next, animals were slaughtered and the epididymides, seminal vesicles and bulbourethral glands were properly collected for recovery of reproductive fluids and epididymal sperm. Two-dimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics tools were used to map the major proteome of secretions from reproductive tract and sperm membranes. The most abundant proteins in the seminal plasma gels appeared as binder of sperm 1 (BSP1), binder of sperm 5 (BSP5), bodhesin-2 and spermadhesin Z13-like. Proteins from composite accessory sex gland fluid that contribute to seminal plasma composition include BSPs, bodhesins, 72kDa type IV collagenase, BPI fold-containing family A member 1, clusterin, inactive ribonuclease-like protein 9, inhibitor of carbonic anhydrase-like isoform X2 and albumin. Cauda epididymal fluid contributes to seminal plasma with specific proteins, such as epididymal-specific lipocalin-5-like isoform X1 and epididymal secretory protein E1, prostaglandin-H2 D-isomerase and spermadhesin-1-like. Comparing 2-D maps of membrane proteins from ejaculated and cauda epididymal sperm membranes, there is an increase in the intensity and number of spots in the ejaculated sperm maps. Those proteins are originated from accessory sex gland fluids. Further research into the proteins identified in our study can contribute to investigations of markers for sperm quality and fertility. In the study 2, five adult Morada Nova rams were vasectomized and accessory sex gland fluid (AGF) was collected by artificial vagina. Metabolites were extracted and identified by GC/MS and LC/MS. Metabolites obtained were analyzed by Human Metabolome Database (HMDB), PubChem, and LIPID Metabolites and Pathways Strategy databases. Pathway analysis was performed using MetaboAnalyst 3.0. Combined use of GC and LC/MS allowed the identification of 371 compounds from AGF of rams. These techniques presented an overlap of one single metabolite, thus confirming the complementarity of the approaches used. Lipids and lipid-like molecules were the most abundant classes in the ram AGF, followed by amino acids, peptides, and analogues. The most abundant metabolites were fructose, glycerol, citric acid, D-mannitol, D-glucose and L-(+)-lactic acid. Metabolites identified in the ram AGF were involved in 52 different pathways. AGF metabolites are modulators of sperm function, thus chemical analysis of the accessory sex gland fluid is valuable to better understand animal reproduction and to search for biomarkers of fertility.

PROTEÔMICA DO HISTOTROFO DURANTE O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO INICIAL NA ÉGUA

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-offlight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celul ares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez.

There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed , embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

Contribution and perspectives of the impact of proteomics in study of placentas and embryonic and fetal membranes / Contribuição e perspectivas do impacto da proteômica em estudo de placentas e membranas embrionárias e fetais

Proteomic approaches have revolutionized the analysis of biological samples by allowing the identification of non-characterized protein expression and its role on protein interactions and post-translational modifications during embryonic development or as a consequence of pathological states. This new frontier of knowledge is, nowadays, an essential contribution to the elucidation of biological problems, by providing information that cannot be obtained by other target driven methods. This review highlights the new perspectives of proteomics studies based on bidimensional eletrophoresis (2D-PAGE) associated to mass spectrometry (MS) analytical methods of placenta, embryonic membranes and embryo evaluation, with emphasis on comparisons between normal and diseased tissues consequence of reproductive biotechnology manipulation.

Abordagens proteômicas revolucionaram a análise de amostras biológicas por permitir a identificação de padrões ainda não caracterizados de expressão de proteínas e/ou suas interações e modificações pós-traducionais em diferentes tecidos, como a placenta ou em embriões e fetos em diferentes estágios de desenvolvimento. Esta nova fronteira de conhecimento se constitui atualmente numa ferramenta fundamental para a elucidação de problemas biológicos, por fornecer informações que não podem ser obtidas por métodos mais focalizados, ou com alvos específicos. Essa revisão salienta as novas perspectivas geradas pela contribuição da proteômica baseada na eletroforese bidimensional (2D-PAGE) associada à espectrometria de massas (MS) para o estudo da placenta, das membranas embrionárias e do embrião, com ênfase nas comparações entre condições normais e aqueles provenientes de estados patológicos ou conseqüentes ao uso de biotecnologias reprodutivas.

ALTERAÇÃO DO PERFIL PROTEÔMICO DO PLASMA SEMINAL DE REPRODUTORES CAPRINOS DA RAÇA SAANEN INFECTADOS PELO VÍRUS DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAEV)

A abordagem proteômica no plasma seminal de reprodutores já vem sendo bastante estudado principalmente visando o conhecimento dos índices reprodutivos, porém trabalhos correlacionando a presença dessas proteínas no plasma seminal de caprinos com alguma enfermidade como à Artrite Encefalite Caprina (CAE) ainda é escassa. Dessa forma o objetivo do trabalho foi fazer uma proteômica comparativa das proteínas do plasma seminal de caprinos sadios e infectados experimentalmente com o vírus da CAE, visando identificar possíveis proteínas que estejam relacionadas com a enfermidade e encontrar possíveis marcadores para a doença. Para tal objetivo foi realizada a eletroforese bidimensional e espectrometria de massas de amostras de plasma seminal de reprodutores sadios e infectados experimentalmente como vírus da CAE. A análise bidimensional dos géis mostrou grande número de spots nos dois parâmetros de animais avaliados (sadios e infectados), porém se verificou maior número de proteínas em animais infectados. Possivelmente essa maior expressão das proteínas em animais infectados com o vírus da CAE tenha sido a responsável pela atividade das proteínas no plasma seminal de reprodutores caprinos Saanen. A espectrometria de massas permitiu identificar no plasma seminal proteínas que estão envolvidas com a proteção do espermatozóide e que possivelmente estão relacionadas com o estado de infecção em que os animais se encontraram.

The plasma-free non-proteomic approach of breeders has been Studying mainly aiming the knowledge of the reproductive indexes,Work correlating the presence of plasma-free proteins of goats With some diseases like Caprine Arthritis Encephalitis (CAE) is still scarce. Thus, the objective of the work for a protein comparative of proteins Make seminal plasma from healthy and experimentally infected goats with CAE, in order to identify proteins that are related to Disease and find possible markers for the disease. For this purpose Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry of Seminal plasma of healthy and experimentally infected CAE. The two-dimensional analysis of the numbers showed large number of points two Parameter of animals evaluated (healthy and infected), but more Protein in infected animals. Possibly this greater expression of proteins In animals infected with the CAE virus Seminal plasma proteins from Saanen goats. The spectrometry of Pasta allowed to identify plasma-free proteins that are involved in Protection of spermatozoa and possibly related to the state of Infection in which animals are located.

ANÁLISE PROTEÔMICA DO SÊMEN DE REPRODUTORES CAPRINOS SOROPOSITIVOS PARA A ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA

A maioria das pesquisas para diagnóstico e avaliação da lentiviroses se baseia na identificação, direta ou indireta, da proteína viral no sangue, leite, sêmen, saliva ou tecidos. Trabalhos com proteômica avaliando as lentiviroses são escassos. A princípio, a análise, detecção e/ou avaliação do vírus são realizadas a partir, principalmente, de amostras de sangue, sendo a maioria dos estudos realizados relacionada ao HIV. O perfil proteico do plasma seminal de pequenos ruminantes associado com índices reprodutivos já foi determinado, mas trabalhos correlacionando a presença dessas proteínas no sêmen à Artrite Encefalite Caprina (CAE) são escassos. Na primeira fase desse trabalho foi avaliada a atividade das metaloproteinases (MMPs) no sangue por meio da zimografia (eletroforese unidimensional) e, na segunda fase, o trabalho objetivou analisar o perfil proteico do plasma seminal de caprinos soropositivos cronicamente para a CAE e identificar proteínas presentes no plasma seminal relacionadas com a enfermidade que possam ser utilizadas no futuro como possíveis marcadores da doença. Para tanto, foi realizada a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) e espectrometria de massa de amostras de plasma seminal de reprodutores soropositivos crônicos para a CAE. A zimografia mostrou alta atividade das MMPs (MMP-2 e MMP-9) no grupo soropositivo. A avaliação seminal mostrou não haver diferença estatística para os parâmetros volume, motilidade e vigor (respectivamente, 0,97A ± 0,61; 82,78A ± 7,52; 3,89A ± 0,58) entre grupos; porém existente para a concentração espermática (4,22B ± 0,71). A análise bidimensional dos géis mostrou grande número de spots em ambos os grupos avaliados, porém com maior número nos animais soropositivos. A cronicidade da CAE em reprodutores caprinos pode ter sido a responsável pela maior expressão e atividade das proteínas no sangue (MMP-2 e pro-MMP-2) e plasma seminal. A espectrometria de massa permitiu identificar no plasma seminal proteínas de resposta imune, relacionadas, possivelmente, ao quadro crônico da doença.

The most research for diagnosis and evaluation of lentiviruses are based on the identification (direct or indirect) of the viral protein in the blood, milk, semen, saliva or tissues. Works with proteomics evaluating lentiviruses are scarce. At first, viruss analysis, detection and assessment are made from mainly blood samples, most of the studies related to HIV. Studies have conducted the protein profile of seminal plasma of small ruminants associating with reproductive parameters but works correlating the presence of these proteins in the semen with Caprine Arthritis Encephalitis (CAE) are scarce. The first phase of this work aimed to evaluate the activity of matrix metalloproteinases (MMPs) in the blood by zymography (1D-PAGE). In the second phase, the study aimed to analyze the protein profile of seropositive CAE goats and to identify proteins related with the disease that may be used as markers in the future. Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry was used on samples of seropositive goat bucks chronically infected with CAE. The zymography showed high activity of MMPs (MMP-2 and MMP-9) in the seropositive group. Semen evaluation showed no difference with volume, motility and vigor parameters (respectively, 0.97A ± 0.61; 82.78A ± 7.52; 3.89A ± 0.58); however, there was significant difference of sperm concentration between groups (4.22B ± 0.71). The two-dimensional analysis revealed a great number of spots in both groups, however there was a higher number in seropositive animals. CAE chronicity in bucks may have been responsible for greater expression and activity of proteins in seminal plasma. Mass spectrometry allowed the identification of immune response proteins in seminal plasma, possibly related to the chronic state of the disease.

Determinação do perfil protéico da membrana externa da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjoprajitno / Protein profile of the outer membrane of Leptospira interrogans serovar Hardjoprajitno

Estudou-se o perfil das proteínas da membrana externa (PME) da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjoprajitno por meio da eletroforese bidimensional. Foram utilizadas técnicas de extração das PME com Triton x114 e precipitação com acetona. Os géis foram corados com nitrato de prata e as imagens analisadas para determinação da massa molecular das proteínas detectadas. Foram visualizadas 35 bandas protéicas, sendo que cinco delas se destacaram por estarem em maior quantidade: 22,54KDa (LipL22), 30/26KDa (LipL32), 34,41KDa (PME34), 42,75KDa (LipL41) e 58,59KDa (LipL63).(AU)

The protein profile of the outer membrane of Leptospira interrogans serovar Hardjoprajitno was determined by two-dimensional gel electrophoresis. The outer membrane was extracted with Triton x 114 and the proteins were precipitated with acetone. The images were analyzed for the determination of the molecular weight of the detected proteins. Thirty-five spots for the proteins that are predominant in the outer membrane of this Leptospira were observed and five proteins were found in higher quantities: 22.54KDa (LipL22), 30/26KDa (LipL32), 34.41KDa (PME34) (2), 42.75KDa (LipL41), and 58.59KDa (LipL63).(AU)

Variação nos genes dos receptores mineralocorticoide e glicocorticoide e suas implicações proteômicas na qualidade da carne de bovinos Nelore / Variation in the mineralocorticoid and glucocorticoid receptors genes and proteomics implications for meat quality in cattle of Nellore breed

O eixo hipotálamo-pituitária-adrenal é o principal sistema neuroendócrino envolvido na regulação e adaptação da resposta ao estresse e, o principal hormônio secretado é o cortisol. O cortisol exerce seus efeitos por meio dos receptores mineralocorticoide (MR) e glicocorticoide (GR). Variações nos genes desses receptores têm sido associadas à sensibilidade aos glicocorticoides e mudanças no perfil metabólico. O objetivo geral desse trabalho foi compreender a variabilidade existente em relação às respostas fisiológicas de bovinos por meio da identificação de polimorfismos genéticos em genes envolvidos na resposta ao estresse e, verificar as consequências dessa variação genética em características de qualidade da carne. Dessa forma, três abordagens foram propostas: (1) avaliar a incidência de carne DFD (dark, firm and dry) e seu impacto no perfil metabólico, endócrino e características de qualidade da carne bovina, uma vez que o estresse é um dos principais fatores que levam a essa condição desfavorável; (2) avaliar a contribuição de fatores genéticos, por meio da identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), no gene do MR e GR, e suas associações com as características mensuradas; (3) avaliar os efeitos desses polimorfismos sobre o perfil proteico do músculo bovino. Foram utilizados 241 bovinos da raça Nelore. Os resultados evidenciaram implicações direta do pH 24 horas post-mortem nos atributos de cor e perdas por cozimento da carne. A incidência de carnes DFD (pH>=5,8) foi de 18,7%. Os polimorfismos identificados mostraram influenciar em algumas características mensuradas. Os SNPs NR3C2_1 e NR3C2_2 no gene do MR foram associados ao conteúdo de glicogênio muscular e nível plasmático do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) post-mortem, e o SNP NR3C1_1 no gene do GR foi associado aos níveis plasmático de cortisol post-mortem. As análises proteômicas demonstraram que a maioria das proteínas reguladas por esses SNPs estão envolvidas na contração muscular, metabolismo e defesa celular. Portanto, é possível inferir que o pH tem impacto nas características de qualidade da carne e que polimorfismos em MR e o GR levam a mudanças na atividade do eixo HPA, no perfil metabólico do organismo e no perfil proteico do músculo, sugerindo que esses genes estão envolvidos em uma complexidade de funções e podendo ser alvos de estudos em sistemas de produção que visam melhorar a produtividade.

The hypothalamic-pituitary-adrenal axis is the main neuroendocrine system involved in the regulation and adaptation in stress response and the primary hormone secreted is cortisol. Cortisol exerts its effects through the mineralocorticoid (MR) and glucocorticoid (GR) receptors. Variations in the genes of these receptors have been associated with sensitivity to glucocorticoids and changes in the metabolic profile. The general objective of this work was to understand the variability in relation to physiological responses of cattle through identification of genetic polymorphisms in genes involved in stress response and, checking the consequences of this genetic variation in meat quality traits. Thus, three approaches have been proposed: (1) evaluate the incidence of DFD meat (dark, firm and dry) and its impact on metabolics, endocrines profiles and meat quality traits, since stress is the major factor that lead to this unfavorable condition; (2) evaluate the contribution of genetic factors through identification single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the MR and GR gene and its association with the measured traits; (3) evaluate the effects of these polymorphisms on the protein profile of bovine muscle. A total of 241 Nellore cattle were used. The results evidenced direct implications of 24 hours pH post-mortem in color attributes and cooking losses. The incidence of DFD meat (pH >= 5.8) was 18.7%. The polymorphisms identified demonstrated to influence some on measured characteristics. The NR3C2_1 and NR3C2_2 SNPs in MR gene were associated with muscle glycogen content and post-mortem adrenocorticotropic hormone (ACTH) plasma levels and, the NR3C1_1 SNP in GR was associated with post-mortem cortisol plasma levels. The proteomic analysis demonstrated that most proteins regulated by these SNPs are involved in muscle contraction, metabolism and cellular defense. Therefore, it is possible to infer that pH has impact on meat quality traits and MR and GR polymorphisms lead to changes in the HPA axis activity, metabolic profile and protein muscle profile, suggesting that these genes are involved in a complexity of functions and may be targets for studies on production systems to improve productivity.

Variação nos genes dos receptores mineralocorticoide e glicocorticoide e suas implicações proteômicas na qualidade da carne de bovinos Nelore / Variation in the mineralocorticoid and glucocorticoid receptors genes and proteomics implications for meat quality in cattle of Nellore breed

O eixo hipotálamo-pituitária-adrenal é o principal sistema neuroendócrino envolvido na regulação e adaptação da resposta ao estresse e, o principal hormônio secretado é o cortisol. O cortisol exerce seus efeitos por meio dos receptores mineralocorticoide (MR) e glicocorticoide (GR). Variações nos genes desses receptores têm sido associadas à sensibilidade aos glicocorticoides e mudanças no perfil metabólico. O objetivo geral desse trabalho foi compreender a variabilidade existente em relação às respostas fisiológicas de bovinos por meio da identificação de polimorfismos genéticos em genes envolvidos na resposta ao estresse e, verificar as consequências dessa variação genética em características de qualidade da carne. Dessa forma, três abordagens foram propostas: (1) avaliar a incidência de carne DFD (dark, firm and dry) e seu impacto no perfil metabólico, endócrino e características de qualidade da carne bovina, uma vez que o estresse é um dos principais fatores que levam a essa condição desfavorável; (2) avaliar a contribuição de fatores genéticos, por meio da identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), no gene do MR e GR, e suas associações com as características mensuradas; (3) avaliar os efeitos desses polimorfismos sobre o perfil proteico do músculo bovino. Foram utilizados 241 bovinos da raça Nelore. Os resultados evidenciaram implicações direta do pH 24 horas post-mortem nos atributos de cor e perdas por cozimento da carne. A incidência de carnes DFD (pH>=5,8) foi de 18,7%. Os polimorfismos identificados mostraram influenciar em algumas características mensuradas. Os SNPs NR3C2_1 e NR3C2_2 no gene do MR foram associados ao conteúdo de glicogênio muscular e nível plasmático do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) post-mortem, e o SNP NR3C1_1 no gene do GR foi associado aos níveis plasmático de cortisol post-mortem. As análises proteômicas demonstraram que a maioria das proteínas reguladas por esses SNPs estão envolvidas na contração muscular, metabolismo e defesa celular. Portanto, é possível inferir que o pH tem impacto nas características de qualidade da carne e que polimorfismos em MR e o GR levam a mudanças na atividade do eixo HPA, no perfil metabólico do organismo e no perfil proteico do músculo, sugerindo que esses genes estão envolvidos em uma complexidade de funções e podendo ser alvos de estudos em sistemas de produção que visam melhorar a produtividade. (AU)

The hypothalamic-pituitary-adrenal axis is the main neuroendocrine system involved in the regulation and adaptation in stress response and the primary hormone secreted is cortisol. Cortisol exerts its effects through the mineralocorticoid (MR) and glucocorticoid (GR) receptors. Variations in the genes of these receptors have been associated with sensitivity to glucocorticoids and changes in the metabolic profile. The general objective of this work was to understand the variability in relation to physiological responses of cattle through identification of genetic polymorphisms in genes involved in stress response and, checking the consequences of this genetic variation in meat quality traits. Thus, three approaches have been proposed: (1) evaluate the incidence of DFD meat (dark, firm and dry) and its impact on metabolics, endocrines profiles and meat quality traits, since stress is the major factor that lead to this unfavorable condition; (2) evaluate the contribution of genetic factors through identification single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the MR and GR gene and its association with the measured traits; (3) evaluate the effects of these polymorphisms on the protein profile of bovine muscle. A total of 241 Nellore cattle were used. The results evidenced direct implications of 24 hours pH post-mortem in color attributes and cooking losses. The incidence of DFD meat (pH >= 5.8) was 18.7%. The polymorphisms identified demonstrated to influence some on measured characteristics. The NR3C2_1 and NR3C2_2 SNPs in MR gene were associated with muscle glycogen content and post-mortem adrenocorticotropic hormone (ACTH) plasma levels and, the NR3C1_1 SNP in GR was associated with post-mortem cortisol plasma levels. The proteomic analysis demonstrated that most proteins regulated by these SNPs are involved in muscle contraction, metabolism and cellular defense. Therefore, it is possible to infer that pH has impact on meat quality traits and MR and GR polymorphisms lead to changes in the HPA axis activity, metabolic profile and protein muscle profile, suggesting that these genes are involved in a complexity of functions and may be targets for studies on production systems to improve productivity. (AU)

Estudo proteômico do efeito da atmosfera modificada na estabilidade da cor e na vida útil da carne suína acondicionada em embalagens de transporte tipo masterpack sob refrigeração / Proteomics study of the effect of modified atmosphere on colour estability and shelf life of pork meat wrapped in masterpack transport packages under refrigeration

Este trabalho teve como objetivo o estudo do efeito da atmosfera modificada associada a embalagens de transporte tipo \"masterpack, na vida útil da carne suína refrigerada. Foram realizadas análises microbiológicas, físico-químicas, bioquímicas e sensoriais visuais. Foram utilizados cortes de lombo suíno (Longissimus dorsi) acondicionados em bandejas de poliestireno expandido recobertas com filme de poli (cloreto de vinila). As bandejas foram acondicionadas em embalagens secundárias de transporte tipo masterpack (6 bandejas por embalagem). Foram utilizados 3 tipos de atmosfera modificada (Composições gasosas): A=75%O2+25%CO2; B= 50%O2+50%CO2 e C=100%CO2. As carnes foram armazenadas em câmara frigorífica por 22 dias. Em intervalos pré-determinados (1, 8, 15 e 22 dias) foram realizadas análises microbiológicas (psicrotróficos aeróbios e Pseudomonas sp.), físico-químicas (composição gasosa, pH, cor, perda de água por exsudação, perda de água por cocção e maciez), bioquímicas (oxidação lipídica, concentração de metamioglobina e eletroforese bi-dimensional) e sensoriais visuais (em balcão expositor). Observou-se que não houve crescimento de microrganismos psicrotróficos aeróbios e Pseudomonas sp. até 15 dias de armazenamento independente da composição gasosa. Houve efeito significativo (P<0,05) de Composição gasosa e de Tempo de armazenamento praticamente em todas as variáveis analisadas, com exceção da perda de água por exsudação, maciez e concentração de metamioglobina. As principais diferenças ocorreram com relação à cor das carnes. De maneira geral, os valores de L* aumentaram durante o armazenamento enquanto que os de a* diminuíram significando que ocorreu certa descoloração da carne. Os bifes das Composições A e B tiveram coloração mais rósea com valores de a* e c* superiores aos da Composição C. As amostras de carne da Composição C tiveram menores valores de TBARS que as demais. A análise sensorial indicou preferência do consumidor pelas amostras das Composições A e B e os resultados de cor determinados após a análise sensorial indicaram que após a abertura dos masterpacks, os bifes sofreram descoloração, sendo que os bifes da Composição A e B mantiveram a coloração rósea por mais tempo. Na análise de eletroforese bi-dimensional realizada com amostras de carne suína da Composição A em 3 tempos distintos, foram identificados média de 255 spots com ponto isoelétrico variando de 3 a 10 e peso molecular de 13 a 94 kDa. Concluiu-se que, do ponto de vista microbiológico, as três composições gasosas estudadas conservaram os bifes de lombo suíno por até 15 dias de armazenamento, porém, somente as atmosferas com altas concentrações de O2 (>50%) garantiram a preservação da cor e aparência geral dos bifes. A técnica da eletroforese bidimensional é promissora para o entendimento, em nível molecular, das mudanças, principalmente de cor, que ocorrem na carne embalada com atmosfera modificada durante o armazenamento. Porém, ainda há a necessidade de mais estudos

The aim of this work was to study the effect of modified atmosphere associated to \"masterpack\" transport packages in the shelf-life of refrigerated pork meat. Microbiological, physical-chemical, biochemical and visual analyses were made. Pork loin (Longissimus dorsi) cuts placed in trays of expanded polystyrene, covered with poly(vinyl chloride) films were used in this study. The trays were placed in a high gas barrier secondary masterpack (78.5 x 48.5 cm, 0.35m2, Cryovac) package, with six trays per masterpack (MP). Three modified atmosphere (gas compositions) were tested: A=75%O2+25%CO2; B= 50%O2+50%CO2 e C=100%CO2. The meat was kept in a refrigerated chamber for 22 days. At pre-established intervals (1, 8, 15 and 22 days) of storage, microbiological (aerobic psychrotrophic and Pseudomonas sp.), physical-chemical (gaseous composition, pH, colour, dripping loss, cooking loss and tenderness), biochemical (lipid oxidation, metmyoglobin concentration and bidimensional electrophoresis) and visual analyses were carried out. It was observed that for up to 15 days of storage there was neither growth of aerobic psychrotrophic microorganisms nor Pseudomonas sp. independent of the Gas composition. There was significant effect (P<0.05) of Gas composition and of Storage Time in almost all the analyzed variables, except for drip loss, tenderness and metmyoglobin concentration. The main differences found were related to the meat colour. In general, the values of L * increased during storage while a* decreased, meaning some discoloration of meat. The steaks of Gas compositions A and B had better coloration with values of the *a and c * greater than Treatment C. The samples of meat of Gas composition C had lower values for TBARS compared to other treatments. The sensory analysis indicated the panelists´ preference for the samples of Gas compositions A and B, and the colour tests made after the sensorial analysis indicated that the steaks of Treatment A and B maintained the pinky coloration for longer time. In the analysis of bi-dimensional electrophoresis applied to the samples of pork loin meat of Treatment A, carried out in 3 replicates, nearly 255 spots were identified with isoelectric point varying from 3 to 10 and molecular weight from 13 to 94 kDa. Based on the microbiological data, it was concluded that the three studied Gas combinations preserved the pork loin steaks for up to 15 days of storage, however, only the atmospheres with higher concentrations of O2 (>50%) guaranteed the preservation of the colour and the general appearance of the steaks. The bidimensional electrophoresis is a promising technique for the understanding, in molecular level, of the changes, mainly in colour, that happen in modified atmosphere packed meat. However, there is still need for further studies

Análise proteômica do saco vitelino de bovinos / Proteomic analisys of bovine yolk sac

O saco vitelino desempenha um importante papel no desenvolvimento embrionário de todos os mamíferos. Sua função está sendo estudada, demonstrando ser um dos lugares iniciais da hematopoiese. No período em que a placenta verdadeira ainda não esta formada, durante o desenvolvimento embrionário, o saco vitelino é a principal fonte de nutrição do embrião, constituindo um sitio de transferência e síntese de proteínas. As proteínas são moléculas que governam praticamente todas as funções celulares e são do ponto de vista químico as moléculas biológicas estruturalmente mais complexas. A proteômica é o estudo em grande escala de proteínas de uma amostra biológica complexa. O objetivo deste trabalho foi realizar a analise estrutural e bioquímica inicial das proteínas presentes no saco vitelino de embriões bovinos por eletroforese bidimensional 2D-PAGE. A partir dos géis obtidos em 2D-PAGE as amostras de proteínas contidas no saco vitelino de 37 dias de gestação apresentaram cerca de 1230 proteínas, e os géis das amostras de 23 dias de gestação apresentaram cerca de 970 proteínas. O saco vitelino de 23 dias apresentou proteínas essenciais diferencialmente expressas nos estágios de desenvolvimento, como Hemogen, proteína expressa neste estagio, responsável pelo controle da proliferação e diferenciação de células hematopoiéticas; a proteína Glicoproteína-N-acetilgalactosamina 3-beta-galactosiltransferase-1, envolvida nos processos de angiogênese, trombopoiese e no desenvolvimento da homeostase nos rins; a proteína fator de transcrição Corion-especifico (GCMa) fator de transcrição necessário para o desenvolvimento da placenta. Enqueanto que o saco vitelino de 37 dias apresentou proteinas essenciais deste estágio como a apolipoproteína E (APOE) que medeia à ligação, inter-sinalização e catabolismo das partículas de lipoproteína, podendo servir como uma ligação para o receptor de LDL (apo B/E) e para receptores específicos de apo-E dos tecidos hepáticos durante a embriogênese. Estas proteinas serão de vital importância para o desenvolvimento do embrião até a formação da placenta

The yolk sac plays an important role in embryonic development of all mammals. Its function is being studied, proving to be one of the initials of haematopoiesis. In the period when the placenta is not real yet formed during embryonic development, the yolk sac is the main source of nutrition of the embryo, providing a place for the transfer and synthesis of proteins. Proteins are molecules that govern all cellular functions and are from a chemical structurally the most complex biological molecules. The proteomics is the large-scale study of proteins in a complex biological sample. The aim of this work was make the analisys of present proteins in the yolk sac of bovine embryos by 2D-PAGE two-dimensional electrophoresis. The gels obtained from 2D-PAGE of protein samples contained in the yolk sac of 37 days of pregnancy had about 1230 proteins, and gels of samples from 23 days of pregnancy had about 970 proteins. The yolk sac of 23 days showed essential proteins differentially expressed in stages of development, as Hemogen, protein expressed in stage, responsible for controlling the proliferation and differentiation of hematopoietic cells, the protein acetylgalactosamine glycoprotein-N-3-beta-galactosyltransferase-1, involved in the process of angiogenesis, trombopoiese homeostasis and development of the kidney, the protein factor chorion-specific transcription (GCMa) transcription factor necessary for the development of the placenta. The yolk sac of 37 days showed essential proteins differentially expressed in stages of development , as apolipoprotein E (APOE), which mediates the binding, intersignaling and catabolism of lipoprotein particles, and can serve as a link to the receptor to LDL (apo B/E) and specific receptors for apo E in the liver tissue embryogenesisThese proteins are of vital importance to the development of the embryo until the formation of the placenta

Imunoidentification of Albumin and Osteopontin in Seminal Plasma of Taurine and Zebuine Bulls / Imunoidentificação de Albumina e Osteopontina no Plasma Seminal de Reprodutores Taurinos e Zebuínos

Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was performed in seminal plasma of seven Bos taurus taurus and seven Bos taurus indicus bulls with high semen freezability, from an artificial insemination center. In a 8% polyacrylamide gels, three bands of 195, 66 and 55 kDa, present in 100% of the samples in both sub-species, were analyzed by their optical densities. In Bos taurus samples, the opticals densities of 55 kDa band, imunoidentified as osteopontin were superior (p < 0.05) than Bos indicus samples. The 66 kDa band was imunoidentified as albumin. In the Bos taurus samples, the bands did not show any variation among the bull samples, but in the Bos indicus, the albumin optical densities showed significant variation among samples.

As proteínas do plasma seminal de 14 reprodutores (7 Bos taurus taurus e 7 Bos taurus indicus), foram analisadas por eletroforese bidimensional, em géis de poliacrilamida a 8%, corados por Comassie Blue. Três bandas protéicas, presentes em 100% das amostras de plasma seminal, foram quantificadas de acordo com a densidade óptica exibida: 195 kDa, pI 6,5-7,5 ; 66 kDa, pI 5,4 e 55 kDa, pI 4,5. As amostras de plasma seminal provenientes de taurinos apresentaram densidades ópticas significativamente superiores (p < 0,05) às dos zebuínos na banda

Caracterização protéica do micro-ambiente uterino durante o período crítico em bovinos / Characterization of the protein profile of the uterine environment during the critical period in cattle

Em bovinos, o sucesso no estabelecimento da gestação depende de interações entre o concepto e o útero. Tais interações ocorrem através de moléculas presentes no ambiente uterino. Falhas nesse processo causam 30-40% de perdas de gestação. As proteínas são constituintes desse ambiente e possuem um importante papel nesse processo. Objetivou-se na presente dissertação caracterizar o perfil protéico do ambiente uterino de fêmeas bovinas, ciclando ou prenhes, durante o período crítico, utilizando eletroforese bidimensional. O objetivo específico foi comparar a composição protéica de lavados uterinos obtidos in vivo, por sonda de folley ou post-mortem no dia 18 após o estro de vacas não inseminadas ou gestantes. Para a obtenção das amostras, 48 fêmeas bovinos tiveram seu ciclo estral sincronizado e foram alocadas aleatoriamente para receberem lavagens in vivo por sonda de folley (12 inseminadas e sete não inseminadas) ou para receberem lavagens post-mortem (12 inseminadas e cinco não inseminadas) no dia 18 após o estro. Após a coleta, os lavados foram processados e submetidos à eletroforese bidimensional. Os géis foram analisados utilizando o programa Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Healthcare) para determinação do ponto isoelétrico (PI) e peso molecular relativo (PMR) das proteínas nos diferentes grupos e análise da densidade óptica. Foram selecionadas 178 proteínas presentes nos lavados. Em relação à distribuição das proteínas de acordo com o ponto isoelétrico, 74% (132/178) apresentaram PI entre 5,5 e 8, em relação ao peso molecular, 44% (79/178) das proteínas possuíam PMR menor que 50KDa enquanto 54% (95/178) entre 50 e 100KDa. Nos lavados realizados por sonda de folley (FC ou FP) foram selecionadas 151 proteínas, sendo 96 nos lavados de animais cíclicos e 86 nos prenhes. Os lavados realizados post-mortem (PMC ou PMP) apresentaram apenas 54 proteínas, das quais 24 estiveram presentes nos lavados PMC e 36 nos lavados PMP. Em relação ao estado reprodutivo 115 proteínas foram encontradas nos lavados dos animais cíclicos (FC ou PMC), enquanto 104 proteínas foram selecionadas nos lavados de animais prenhes (FP e PMP). Entre os lavados realizados por sonda de folley (FC e FP) 31 proteínas foram comuns entre os estados, enquanto entre os lavados realizados post-mortem (PMC e PMP) apenas seis proteínas estiveram presentes em ambos os lavados. Nos lavados realizados em animais ciclando (FC e PMC) cinco proteínas estiveram presentes em ambos os tipos de lavados, enquanto nos lavados realizados em animais prenhes (FP e PMP) 18 proteínas foram comuns em ambos os tipos de lavado. Entre os lavados FC e PMP ou FP e PMC, 15 e 6 proteínas, respectivamente, foram comuns. As proteínas presentes exclusivamente nos lavados de vacas prenhes, possivelmente estão envolvidas no diálogo materno-embrionário durante o processo de estabelecimento da gestação. Proteínas detectadas exclusivamente nos lavados obtidos via sonda de folley podem ser devidas ao influxo de proteínas do soro sanguíneo em resposta à manipulação do trato reprodutivo durante a obtenção dos lavados. Esperava-se uma maior efetividade dos lavados realizados post-mortem em relação aos realizados por sonda de folley. Entretanto os lavados obtidos por sonda de folley foram melhores por identificar um maior numero de proteínas, permitindo identificar diferenças maiores entre os lavados de animais ciclando e prenhes. Concluiu-se que a eletroforese bidimendional constitui um método adequado para avaliar quantitativamente o perfil protéico do ambiente uterino bovino e que tanto o estado reprodutivo quanto o método de obtenção de lavados uterinos modificam sua composição protéica. Novos estudos são necessários para se obter a seqüência de aminoácidos das proteínas localizadas para que se conheça sua identidade e função na gestação inicial de bovinos

In the cattle, the outcome for the establishment of pregnancy depends on interactions between conceptus and uterus. These interactions occur through molecules presents in the uterine environment. Failure in this process causes 30-40% of loss in gestation. The proteins are component of this environment and have a important role in this process. The aim of this dissertation was to characterize the protein profile of the uterine environment in cows, cyclic or pregnant, during the critical period, using two-dimensional electrophoresis. The specific aim was to compare the protein composition of uterine washings recovered in vivo, through a folley catheter, with washings recovered post-mortem at day 18 after estrus of not inseminated or pregnant cows. To obtain the samples 48 cows had their estrous synchronized and here aleatoric put in the group to receive washings in vivo through the folley catheter (12 inseminated and seven not inseminated) or to be washed post-mortem (12 inseminated and five not inseminated) at day 18 after estrus. After the recover, the washings were proceeded and submitted to two-dimensional electrophoresis. The gels were analyzed using the software Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Heathcare) to determine the isoelectric point (PI) and relative molecular weight (PMR) of the proteins presents in the different groups and analysis of the optical density. One hundred and seventy eight proteins were presents in the washings. The distribution of the proteins according to the PI, 74% (132/178) had PI between 5,5 and 8 and according to the PMR 44% (79/178) of the proteins showed PMR lower than 50KDa, while 54% (95/178) had PMR between 50 and 100KDa. In the washings recovered through the folley catheter (FC and FP) 151 proteins were selected, being 96 from the cyclic cows and 86 from the pregnant cows. The washings recovered post-mortem (PMC and PMP) showed only 54 proteins, from those 24 were present in the cyclic animals and 36 in the pregnant animals. According to the reproductive status 115 proteins were found in the washings from the cyclic animals (FC and PMC), while 104 proteins were selected from the washings of the pregnant animals (FP and PMP). Among the washings recovered through the folley catheter (FC and FP) 31 proteins were the same between the reproductive status. While in the washings recovered post-mortem (PMC and PMP) only six proteins were present in both washings. In washings done in the cyclic animals (FC and PMC) five proteins were presents in both kind of washings, while in washings done in the pregnant animals (FP and PMP) 18 proteins were the same in both kind of washings. Among the washings FC and PMP or FP and PMC, 15 and six proteins, respectively were the same. The proteins presents exclusively in the washings of the pregnant animals are probably involved with the embryo-maternal interplay during the process of pregnancy establishment. Proteins detected exclusively in the washings recovered through the folley catheter may be inflow of proteins from the serum, in response to the uterine manipulation during the process of washing. It was expected a better effect from the washings post-mortem than the ones through the folley catheter. However the washings from the folley catheter had a better result, because they identified a greater number of proteins which allowed identify greater differences between the washings from cyclic and pregnant animals. In conclusion, the two-dimensional electrophoresis is a adequate method to analyze the quantitatively proteins profile of the uterine environment in the cow and that both the reproductive status and the method to obtain the uterine washings modify the proteins composition. New studies are necessary to obtain the amino acids sequence of the proteins found so that we know their identity and function in the beginning of pregnancy in the cow

Imunoidentification of Albumin and Osteopontin in Seminal Plasma of Taurine and Zebuine Bulls / Imunoidentificação de Albumina e Osteopontina no Plasma Seminal de Reprodutores Taurinos e Zebuínos

Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was performed in seminal plasma of seven Bos taurus taurus and seven Bos taurus indicus bulls with high semen freezability, from an artificial insemination center. In a 8% polyacrylamide gels, three bands of 195, 66 and 55 kDa, present in 100% of the samples in both sub-species, were analyzed by their optical densities. In Bos taurus samples, the opticals densities of 55 kDa band, imunoidentified as osteopontin were superior (p 0.05) than Bos indicus samples. The 66 kDa band was imunoidentified as albumin. In the Bos taurus samples, the bands did not show any variation among the bull samples, but in the Bos indicus, the albumin optical densities showed significant variation among samples.

As proteínas do plasma seminal de 14 reprodutores (7 Bos taurus taurus e 7 Bos taurus indicus), foram analisadas por eletroforese bidimensional, em géis de poliacrilamida a 8%, corados por Comassie Blue. Três bandas protéicas, presentes em 100% das amostras de plasma seminal, foram quantificadas de acordo com a densidade óptica exibida: 195 kDa, pI 6,5-7,5 ; 66 kDa, pI 5,4 e 55 kDa, pI 4,5. As amostras de plasma seminal provenientes de taurinos apresentaram densidades ópticas significativamente superiores (p 0,05) às dos zebuínos na banda

Perfil bidimensional de proteínas do plasma seminal e características ligadas ao desempenho reprodutivo de touros de corte / Two-dimensional seminal plasma proteins profile and traits linked to beef bulls reproductive performance

Estudou-se o perfil de proteínas de plasma seminal de touros das raças Nelore (Bos taurus primigerus indicus) e Simental (Bos taurus primigerus taurus), criados a campo, em regime de acasalamento múltiplo e manejo extensivo, na região de Dourados/MS, a fim de analisar a relação entre estas proteínas e características ligadas ao desempenho reprodutivo de touros. Coletaram-se amostras de sêmen no período de inverno (Julho/2001) e verão (Fevereiro/2002), realizando-se inicialmente o exame andrológico nos animais, e em seguida a análise padrão do sêmen. O plasma seminal foi, então, submetido à dosagem de proteínas totais, à dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliação da ocorrência de lipoperoxidação, e à eletroforese bidimensional de proteínas. Para análise do perfil proteico de plasma seminal da cada raça, foram utilizados os seguintes parâmetros: comparação entre os períodos de inverno e verão; comparação de grupos de amostras separados de acordo com a quantificação de características ligadas ao desempenho reprodutivo (morfologia espermática, dosagem de proteína total e dosagem de TBARS); e comparação de grupos de amostras separados de acordo com classificações para avaliação da capacidade reprodutiva, previamente descritas na literatura (Breeding Soundness Evaluations BSEs). Os touros da raça Simental demonstraram menor adaptação às condições ambientais tropicais, com valores mais altos de defeitos espermáticos maiores, proteína total e dosagem de TBARS no período de verão. Observou-se grande variabilidade no perfil proteico entre as raças Nelore e Simental e, dentro de cada raça, encontrou-se expressiva variação individual. O perfil de proteínas de plasma seminal de touros Nelore apresentou 155 spots, entre os quais 04 se destacaram como possíveis marcadores de características ligadas ao desempenho reprodutivo. Já na raça Simental foram identificados 248 spots, com destaque para 04 spots, que demonstraram maior potencial como marcadores de características de interesse para a reprodução. Os resultados mostram que o perfil de proteínas de plasma seminal está relacionado ao desempenho reprodutivo de touros, fazendo-se necessários maiores estudos sobre as proteínas que se destacaram como marcadores, a fim de identificar as funções que elas exercem no trato reprodutivo e nos eventos ligados à fertilização

Seminal plasma proteins profiles from Nelore (Bos taurus primigerus indicus) and Simmental (Bos taurus primigerus taurus) bulls, used for multiple-sire breeding under range conditions, at Dourados/MS region, were studied aiming to analyze the relation between these proteins and traits linked to bulls reproductive performance. Semen samples were collected in the winter (July/2001) and summer (February/2002). Initially, an andrological examination was performed, followed by standard semen analysis. Seminal plasma was subjected to total protein quantification, thiobarbituric acid reactive substances quantification (TBARS, to evaluate lipid peroxidation), and two-dimensional protein electrophoresis. To analyze seminal plasma protein profile of each breed, the following parameters were used: comparison between winter and summer, comparison among groups of samples divided by quantification of traits linked to reproductive performance (sperm morphology, total protein quantification, TBARS quantification) and comparison among groups of samples divided by breeding soundness evaluations (BSEs), previously reported in literature. Simmental bulls showed lower adaptability to tropical environment conditions, with higher values of major sperm defects, total protein and TBARS in the summer. A great variability was observed in the protein profile between Nelore and Simmental breeds, and, for each breed it was found great individual variability too. Nelore seminal plasma protein profile presented 155 spots, 04 of which were considered potential markers for traits linked to reproductive performance. For Simmental breed, 248 spots were identified, with special interest for 04 spots, which showed higher potential as markers to reproductive characteristics. Results show that seminal plasma protein profile is related to bulls reproductive performance. Further studies about those proteins which are potential markers are needed, to determine their function at bulls reproductive system and in the events related to fertilization