Determining anthelmintic residues in goat milk in Brazil / Determinação de resíduos anti-helmínticos no leite caprino no Brasil

Anthelmintics are used to combat nematodes. The misuse of anthelmintics can raise the cost of milk production. The objective of this research was to determine the presence of anthelmintics in goat milk. Twenty goats were used, divided into four groups of five animals: I- animals treated with an ivermectin-based anthelmintic; II- animals treated with moxidectin; III- animals treated with levamisole hydrochloride; and IV: animals treated with albendazole. Milk samples were collected individually: before, and 1, 2, 3, 15 and 21 days after administration of the anthelmintics. Determination of anthelmintic residues was performed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). According to the results, there was an exponential effect (P<0.05) for ivermectin and moxidectin. Moxidectin was the anthelmintic that left a residue in the milk for the longest time, up to 21 days. However, with all the anthelmintics researched, residues were below the maximum limit recommended by the inspecting agencies.(AU)

Anthelmintics são usados ​​para combater nematodes. O mau uso de anti-helmínticos pode aumentar o custo da produção de leite. O objetivo desta pesquisa foi determinar a presença de anti-helmínticos no leite de cabra. Foram utilizados vinte cabras, divididos em quatro grupos de cinco animais: I - animais tratados com um antihelmíntico à base de ivermectina; II - animais tratados com moxidectina; III- animais tratados com cloridrato de levamisol; E IV: animais tratados com albendazole. Amostras de leite foram coletadas individualmente: antes, e 1, 2, 3, 15 e 21 dias após a administração dos anti-helmínticos. A determinação dos resíduos antihelmínticos foi realizada por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). De acordo com os resultados, houve um efeito exponencial (P <0.05) para ivermectina e moxidectina. A moxidectina foi o anti-helmíntico que deixou um resíduo no leite por mais tempo, até 21 dias. Contudo, com todos os anthelmintics pesquisados, os resíduos estavam abaixo do limite máximo recomendado pelas agências de inspeção.(AU)

Determining anthelmintic residues in goat milk in Brazil / Determinação de resíduos anti-helmínticos no leite caprino no Brasil

Anthelmintics are used to combat nematodes. The misuse of anthelmintics can raise the cost of milk production. The objective of this research was to determine the presence of anthelmintics in goat milk. Twenty goats were used, divided into four groups of five animals: I- animals treated with an ivermectin-based anthelmintic; II- animals treated with moxidectin; III- animals treated with levamisole hydrochloride; and IV: animals treated with albendazole. Milk samples were collected individually: before, and 1, 2, 3, 15 and 21 days after administration of the anthelmintics. Determination of anthelmintic residues was performed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). According to the results, there was an exponential effect (P<0.05) for ivermectin and moxidectin. Moxidectin was the anthelmintic that left a residue in the milk for the longest time, up to 21 days. However, with all the anthelmintics researched, residues were below the maximum limit recommended by the inspecting agencies.

Anthelmintics são usados ​​para combater nematodes. O mau uso de anti-helmínticos pode aumentar o custo da produção de leite. O objetivo desta pesquisa foi determinar a presença de anti-helmínticos no leite de cabra. Foram utilizados vinte cabras, divididos em quatro grupos de cinco animais: I - animais tratados com um antihelmíntico à base de ivermectina; II - animais tratados com moxidectina; III- animais tratados com cloridrato de levamisol; E IV: animais tratados com albendazole. Amostras de leite foram coletadas individualmente: antes, e 1, 2, 3, 15 e 21 dias após a administração dos anti-helmínticos. A determinação dos resíduos antihelmínticos foi realizada por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). De acordo com os resultados, houve um efeito exponencial (P <0.05) para ivermectina e moxidectina. A moxidectina foi o anti-helmíntico que deixou um resíduo no leite por mais tempo, até 21 dias. Contudo, com todos os anthelmintics pesquisados, os resíduos estavam abaixo do limite máximo recomendado pelas agências de inspeção.

Improved method for diagnosis of Nerium oleander poisoning in necropsy tissues / Método aprimorado para diagnóstico da intoxicação por Nerium oleander em tecidos de necropsia

Nerium oleander is an ornamental cardiotoxic plant found in tropical and subtropical areas of the World. Its toxicity is related to the content of cardioactive glycosides, mainly oleandrin, found throughout the plant. The present study aimed to describe a new and improved method for oleandrin detection in tissue samples. The determination of oleandrin was made after extraction with a modified QuEChERS technique and measurement by UFLC-MS/MS. A total of 36 guinea pigs (Cavia porcellus) were distributed into 3 groups (n=12): control group that received only water orally (CON), and two treated groups that received hydroalcoholic oleander extract at doses of 150mg.kg-1 (OLE 150) and 300mg.kg-1 (OLE 300) in single oral dose. After three hours, fragments of heart, kidneys, liver and brain were collected for determination of oleandrin levels. The extraction and chromatographic procedures were effective for oleandrin detection and quantification in tissues, with retention time of 1.2 min and detection limit of 0.001μg g-1. The chromatographic analysis of treated guinea pigs indicated that oleandrin is distributed equally among the analyzed tissues. The developed methodology is a reliable, effective and rapid form of diagnosis of N. oleander poisoning based on necropsy tissue samples.(AU)

Nerium oleander é uma planta cardiotóxica ornamental encontrada em áreas tropicais e subtropicais do mundo. Sua toxicidade é relacionada á presença de glicosídeos cardioativos, principalmente a oleandrina, encontrada em toda a planta. O presente estudo objetiva descrever um novo e aprimorado método para detecção da oleandrina em amostras de tecido. A determinação da oleandrina foi feita após extração utilizando técnica modificada de QuEChERS e mensuração por UFLC-MS/MS. Um total de 36 cobaios (Cavia porcellus) foi distribuído em três grupos (n=12): grupo controle que recebeu apenas água por via oral (CON), e dois grupos tratados que receberam extrato hidroalcóolico de oleander nas doses de 150mg.kg-1 (OLE 150) e 300mg.kg-1 (OLE 300) em uma única dose oral. Após três horas, fragmentos do coração, rins, fígado e cérebro foram coletados para determinação dos níveis de oleandrina. A extração e procedimentos cromatográficos foram eficientes na detecção e quantificação da oleandrina nos tecidos, com tempo de retenção de 1,2min e limite de detecção de 0,001μg g-1. A análise cromatográfica dos animais tratados indicou que a oleandrina é distribuída de forma equalizada pelos tecidos analisados. A metodologia desenvolvida representa uma forma de diagnóstica segura, efetiva e rápida da intoxicação por N. oleander a partir de amostras de tecidos de necropsia.(AU)

Improved method for diagnosis of Nerium oleander poisoning in necropsy tissues / Método aprimorado para diagnóstico da intoxicação por Nerium oleander em tecidos de necropsia

Nerium oleander is an ornamental cardiotoxic plant found in tropical and subtropical areas of the World. Its toxicity is related to the content of cardioactive glycosides, mainly oleandrin, found throughout the plant. The present study aimed to describe a new and improved method for oleandrin detection in tissue samples. The determination of oleandrin was made after extraction with a modified QuEChERS technique and measurement by UFLC-MS/MS. A total of 36 guinea pigs (Cavia porcellus) were distributed into 3 groups (n=12): control group that received only water orally (CON), and two treated groups that received hydroalcoholic oleander extract at doses of 150mg.kg-1 (OLE 150) and 300mg.kg-1 (OLE 300) in single oral dose. After three hours, fragments of heart, kidneys, liver and brain were collected for determination of oleandrin levels. The extraction and chromatographic procedures were effective for oleandrin detection and quantification in tissues, with retention time of 1.2 min and detection limit of 0.001μg g-1. The chromatographic analysis of treated guinea pigs indicated that oleandrin is distributed equally among the analyzed tissues. The developed methodology is a reliable, effective and rapid form of diagnosis of N. oleander poisoning based on necropsy tissue samples.(AU)

Nerium oleander é uma planta cardiotóxica ornamental encontrada em áreas tropicais e subtropicais do mundo. Sua toxicidade é relacionada á presença de glicosídeos cardioativos, principalmente a oleandrina, encontrada em toda a planta. O presente estudo objetiva descrever um novo e aprimorado método para detecção da oleandrina em amostras de tecido. A determinação da oleandrina foi feita após extração utilizando técnica modificada de QuEChERS e mensuração por UFLC-MS/MS. Um total de 36 cobaios (Cavia porcellus) foi distribuído em três grupos (n=12): grupo controle que recebeu apenas água por via oral (CON), e dois grupos tratados que receberam extrato hidroalcóolico de oleander nas doses de 150mg.kg-1 (OLE 150) e 300mg.kg-1 (OLE 300) em uma única dose oral. Após três horas, fragmentos do coração, rins, fígado e cérebro foram coletados para determinação dos níveis de oleandrina. A extração e procedimentos cromatográficos foram eficientes na detecção e quantificação da oleandrina nos tecidos, com tempo de retenção de 1,2min e limite de detecção de 0,001μg g-1. A análise cromatográfica dos animais tratados indicou que a oleandrina é distribuída de forma equalizada pelos tecidos analisados. A metodologia desenvolvida representa uma forma de diagnóstica segura, efetiva e rápida da intoxicação por N. oleander a partir de amostras de tecidos de necropsia.(AU)

Improved method for diagnosis of Nerium oleander poisoning in necropsy tissues

ABSTRACT: Nerium oleander is an ornamental cardiotoxic plant found in tropical and subtropical areas of the World. Its toxicity is related to the content of cardioactive glycosides, mainly oleandrin, found throughout the plant. The present study aimed to describe a new and improved method for oleandrin detection in tissue samples. The determination of oleandrin was made after extraction with a modified QuEChERS technique and measurement by UFLC-MS/MS. A total of 36 guinea pigs (Cavia porcellus) were distributed into 3 groups (n=12): control group that received only water orally (CON), and two treated groups that received hydroalcoholic oleander extract at doses of 150mg.kg-1 (OLE 150) and 300mg.kg-1 (OLE 300) in single oral dose. After three hours, fragments of heart, kidneys, liver and brain were collected for determination of oleandrin levels. The extraction and chromatographic procedures were effective for oleandrin detection and quantification in tissues, with retention time of 1.2 min and detection limit of 0.001g g-1. The chromatographic analysis of treated guinea pigs indicated that oleandrin is distributed equally among the analyzed tissues. The developed methodology is a reliable, effective and rapid form of diagnosis of N. oleander poisoning based on necropsy tissue samples.

RESUMO: Nerium oleander é uma planta cardiotóxica ornamental encontrada em áreas tropicais e subtropicais do mundo. Sua toxicidade é relacionada á presença de glicosídeos cardioativos, principalmente a oleandrina, encontrada em toda a planta. O presente estudo objetiva descrever um novo e aprimorado método para detecção da oleandrina em amostras de tecido. A determinação da oleandrina foi feita após extração utilizando técnica modificada de QuEChERS e mensuração por UFLC-MS/MS. Um total de 36 cobaios (Cavia porcellus) foi distribuído em três grupos (n=12): grupo controle que recebeu apenas água por via oral (CON), e dois grupos tratados que receberam extrato hidroalcóolico de oleander nas doses de 150mg.kg-1 (OLE 150) e 300mg.kg-1 (OLE 300) em uma única dose oral. Após três horas, fragmentos do coração, rins, fígado e cérebro foram coletados para determinação dos níveis de oleandrina. A extração e procedimentos cromatográficos foram eficientes na detecção e quantificação da oleandrina nos tecidos, com tempo de retenção de 1,2min e limite de detecção de 0,001g g-1. A análise cromatográfica dos animais tratados indicou que a oleandrina é distribuída de forma equalizada pelos tecidos analisados. A metodologia desenvolvida representa uma forma de diagnóstica segura, efetiva e rápida da intoxicação por N. oleander a partir de amostras de tecidos de necropsia.

Identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF de Salmonella spp. e Escherichia coli isolados de carcaças bovinas / MALDI-TOF mass spectrometry identification of Salmonella spp. and Escherichia coli isolated from bovine carcasses

O objetivo deste trabalho foi introduzir a técnica de espectrometria de massa com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz e analisador de tempo-de-voo (MALDI-TOF) para incrementar o método tradicional microbiológico na detecção de Salmonella spp. e Escherichia coli em carcaças bovinas. Foram avaliadas 270 amostras de 90 carcaças de bovinos. Para isolamento de Salmonella spp. e E. coli, foram utilizadas, respectivamente, as metodologias descritas na ISO 6579:2002 e no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. As análises por MALDI-TOF foram realizadas a partir de isolados cultivados em ágar nutriente ou em caldo triptona de soja, provenientes das amostras com características bioquímicas positivas (n=7), inconclusivas (n=4) e negativas (n=85) para Salmonella spp. e bioquímicas positivas (n=37) e negativas (n=85) para E. coli. Os perfis de massas foram adquiridos com o espectrômetro de massas MALDI-TOF Autoflex III SmartBeam e os espectros brutos foram processados usando o programa MALDI Biotyper (Bruker Daltonics). De acordo com a identificação preliminar, com base na morfologia das colônias e nas reações bioquímicas, sete isolados foram considerados positivos para Salmonella spp. Através do MALDI Biotyper, esses sete isolados foram classificados como pertencentes ao gênero Salmonella e, além disso, identificados como S. enterica. Quatro isolados que apresentaram características fenotípicas não usuais e resultados inconclusivos nos testes bioquímicos para Salmonella foram identificados como pertencentes aos gêneros Citrobacter e Proteus após análise por MALDI. Para E. coli, 37 amostras foram positivas pelos testes bioquímicos da espécie, o que foi confirmado por MALDI Biotyper. A metodologia MALDI-TOF permitiu a rápida confirmação da identidade de Salmonella spp. e E. coli, podendo ser utilizada para detecção desses microrganismos em isolados bacterianos de carcaças bovinas.(AU)

The aim of this study was to introduce matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometry to improve the traditional microbiological method for the detection of Salmonella spp. and Escherichia coli in beef carcasses. Two hundred seventy samples from 90 beef carcasses were evaluated. The methodologies described in ISO 6579:2002 and in the Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods were used for Salmonella spp. and E. coli isolation, respectively. MALDI-TOF analysis were performed on tryptone soya broth suspension isolates or directly from nutrient agar colonies, from the positive, inconclusive or negative biochemically tested samples for Salmonella and E. coli. Mass profiles were acquired on an Autoflex III SmartBeam MALDI-TOF mass spectrometer and the raw spectra were processed using the MALDI Biotyper software (Bruker Daltonics). According to the preliminary identification based on colony morphology and the biochemical reactions, seven isolates were positive for Salmonella spp. Through MALDI Biotyper these seven isolates were also classified as belonging to the genus Salmonella and further identified as S. enterica. Four isolates showing unusual phenotypic characteristics and inconclusive results in biochemical tests for Salmonella were identified as belonging to Citrobacter and Proteus genera after MALDI analysis. Regarding Escherichia coli, 37 were positive for species biochemical testing which MALDI Biotyper confirmed. MALDI-TOF methodology allowed rapid Salmonella spp. and E. coli identity confirmation and may be used to detect these microrganisms within bacterial isolates from beef carcasses.(AU)

Identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF de Salmonella spp. e Escherichia coli isolados de carcaças bovinas / MALDI-TOF mass spectrometry identification of Salmonella spp. and Escherichia coli isolated from bovine carcasses

O objetivo deste trabalho foi introduzir a técnica de espectrometria de massa com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz e analisador de tempo-de-voo (MALDI-TOF) para incrementar o método tradicional microbiológico na detecção de Salmonella spp. e Escherichia coli em carcaças bovinas. Foram avaliadas 270 amostras de 90 carcaças de bovinos. Para isolamento de Salmonella spp. e E. coli, foram utilizadas, respectivamente, as metodologias descritas na ISO 6579:2002 e no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. As análises por MALDI-TOF foram realizadas a partir de isolados cultivados em ágar nutriente ou em caldo triptona de soja, provenientes das amostras com características bioquímicas positivas (n=7), inconclusivas (n=4) e negativas (n=85) para Salmonella spp. e bioquímicas positivas (n=37) e negativas (n=85) para E. coli. Os perfis de massas foram adquiridos com o espectrômetro de massas MALDI-TOF Autoflex III SmartBeam e os espectros brutos foram processados usando o programa MALDI Biotyper (Bruker Daltonics). De acordo com a identificação preliminar, com base na morfologia das colônias e nas reações bioquímicas, sete isolados foram considerados positivos para Salmonella spp. Através do MALDI Biotyper, esses sete isolados foram classificados como pertencentes ao gênero Salmonella e, além disso, identificados como S. enterica. Quatro isolados que apresentaram características fenotípicas não usuais e resultados inconclusivos nos testes bioquímicos para Salmonella foram identificados como pertencentes aos gêneros Citrobacter e Proteus após análise por MALDI. Para E. coli, 37 amostras foram positivas pelos testes bioquímicos da espécie, o que foi confirmado por MALDI Biotyper. A metodologia MALDI-TOF permitiu a rápida confirmação da identidade de Salmonella spp. e E. coli, podendo ser utilizada para detecção desses microrganismos em isolados bacterianos de carcaças bovinas.(AU)

The aim of this study was to introduce matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometry to improve the traditional microbiological method for the detection of Salmonella spp. and Escherichia coli in beef carcasses. Two hundred seventy samples from 90 beef carcasses were evaluated. The methodologies described in ISO 6579:2002 and in the Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods were used for Salmonella spp. and E. coli isolation, respectively. MALDI-TOF analysis were performed on tryptone soya broth suspension isolates or directly from nutrient agar colonies, from the positive, inconclusive or negative biochemically tested samples for Salmonella and E. coli. Mass profiles were acquired on an Autoflex III SmartBeam MALDI-TOF mass spectrometer and the raw spectra were processed using the MALDI Biotyper software (Bruker Daltonics). According to the preliminary identification based on colony morphology and the biochemical reactions, seven isolates were positive for Salmonella spp. Through MALDI Biotyper these seven isolates were also classified as belonging to the genus Salmonella and further identified as S. enterica. Four isolates showing unusual phenotypic characteristics and inconclusive results in biochemical tests for Salmonella were identified as belonging to Citrobacter and Proteus genera after MALDI analysis. Regarding Escherichia coli, 37 were positive for species biochemical testing which MALDI Biotyper confirmed. MALDI-TOF methodology allowed rapid Salmonella spp. and E. coli identity confirmation and may be used to detect these microrganisms within bacterial isolates from beef carcasses.(AU)

Identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF de Salmonella spp. e Escherichia coli isolados de carcaças bovinas

ABSTRACT: The aim of this study was to introduce matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometry to improve the traditional microbiological method for the detection of Salmonella spp. and Escherichia coli in beef carcasses. Two hundred seventy samples from 90 beef carcasses were evaluated. The methodologies described in ISO 6579:2002 and in the Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods were used for Salmonella spp. and E. coli isolation, respectively. MALDI-TOF analysis were performed on tryptone soya broth suspension isolates or directly from nutrient agar colonies, from the positive, inconclusive or negative biochemically tested samples for Salmonella and E. coli. Mass profiles were acquired on an Autoflex III SmartBeam MALDI-TOF mass spectrometer and the raw spectra were processed using the MALDI Biotyper software (Bruker Daltonics). According to the preliminary identification based on colony morphology and the biochemical reactions, seven isolates were positive for Salmonella spp. Through MALDI Biotyper these seven isolates were also classified as belonging to the genus Salmonella and further identified as S. enterica. Four isolates showing unusual phenotypic characteristics and inconclusive results in biochemical tests for Salmonella were identified as belonging to Citrobacter and Proteus genera after MALDI analysis. Regarding Escherichia coli, 37 were positive for species biochemical testing which MALDI Biotyper confirmed. MALDI-TOF methodology allowed rapid Salmonella spp. and E. coli identity confirmation and may be used to detect these microrganisms within bacterial isolates from beef carcasses.

RESUMO: O objetivo deste trabalho foi introduzir a técnica de espectrometria de massa com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz e analisador de tempo-de-voo (MALDI-TOF) para incrementar o método tradicional microbiológico na detecção de Salmonella spp. e Escherichia coli em carcaças bovinas. Foram avaliadas 270 amostras de 90 carcaças de bovinos. Para isolamento de Salmonella spp. e E. coli, foram utilizadas, respectivamente, as metodologias descritas na ISO 6579:2002 e no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. As análises por MALDI-TOF foram realizadas a partir de isolados cultivados em ágar nutriente ou em caldo triptona de soja, provenientes das amostras com características bioquímicas positivas (n=7), inconclusivas (n=4) e negativas (n=85) para Salmonella spp. e bioquímicas positivas (n=37) e negativas (n=85) para E. coli. Os perfis de massas foram adquiridos com o espectrômetro de massas MALDI-TOF Autoflex III SmartBeam e os espectros brutos foram processados usando o programa MALDI Biotyper (Bruker Daltonics). De acordo com a identificação preliminar, com base na morfologia das colônias e nas reações bioquímicas, sete isolados foram considerados positivos para Salmonella spp. Através do MALDI Biotyper, esses sete isolados foram classificados como pertencentes ao gênero Salmonella e, além disso, identificados como S. enterica. Quatro isolados que apresentaram características fenotípicas não usuais e resultados inconclusivos nos testes bioquímicos para Salmonella foram identificados como pertencentes aos gêneros Citrobacter e Proteus após análise por MALDI. Para E. coli, 37 amostras foram positivas pelos testes bioquímicos da espécie, o que foi confirmado por MALDI Biotyper. A metodologia MALDI-TOF permitiu a rápida confirmação da identidade de Salmonella spp. e E. coli, podendo ser utilizada para detecção desses microrganismos em isolados bacterianos de carcaças bovinas.

Detecção e análise da distribuição de carbamatos por espectrometria de massa DESI em órgãos de ratos experimentalmente intoxicados

Os carbamatos são praguicidas anticolinesterásicos com inúmeras formulações e usos distintos. O aldicarbe e o carbofurano, formulados para uso agrícola, têm frequentemente uso irregular como abortivos, tentativas de suicídio, homicídio e intoxicações de animais domésticos e silvestres. Eles são conhecidos como chumbinho devido à aparência enegrecida e granular, são fornecidos em uma única dose letal a animais junto a alimentos (iscas). Quando encontrados vivos, esses animais apresentam sinais relacionados à inibição da atividade da acetilcolinesterase, que causa estímulo a receptores muscarínicos e nicotínicos, resultando em sinais como diarreia, vômitos, depressão e convulsões. As alterações macroscópicas e histopatológicas são consideradas inespecíficas, sendo observadas congestões em múltiplos órgãos. O diagnóstico da intoxicação é feito a partir da análise de amostras colhidas durante a necropsia e os métodos mais utilizados são a cromatografia em camada delgada (CCD) e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), além da recém validada cromatografia líquida de alta pressão com detector de matriz de diodos (HPCL-DAD). O método de detecção por espectrometria de massa DESI (desorption electrospray ionization ou ionização por dessorção por eletrospray) pode ser utilizada para esse fim. Nele, um solvente é direcionado para a superfície da amostra para dessorver e ionizar o material. Esses íons são evaporados e, com a ajuda de um software, essa amostra é escaneada e a informação correlacionada com a distribuição espacial da espécie química.

Carbamates are acetylcholinesterase inhibitors with many different formulations and uses. Aldicarb and carbofuran, originally formulated for agricultural use, are frequently employed to cause abortions, homicides, suicides and intoxications of domestic and wild animals. They are known as small lead due to its dark granular presentation, are offered to animals with food (bait) in a single quickly lethal dosage. When found alive, these animals present clinical signs related to the inhibition of the acetylcholinestesase enzyme, which stimulates muscarinic and nicotinic receptors, such as diarrhea, vomits, depression and convulsions. The macroscopic and histopathological changes are considered unspecific; such are blood ingurgitation in many organs. The diagnosis is obtained after the analysis of samples taken during necropsy and the most used methods are the thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), and the recently validated High-performance liquid chromatography-diode array detection (HPLC-DAD). The method of desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) can also be used. In this technique, a solvent is directed towards a sample surface to desorb and ionize the material, which will be evaporated. Using a software, the sample is scanned and the information correlated with the spatial distribution of the chemical specimen.

MARCADORES BIOQUÍMICOS PARA SELEÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bem estabelecida tanto na reprodução humana como em animais de produção, porém as taxas de gestação e nascimento após a transferência ainda continuam baixas. Devido a este cenário, existe uma demanda por metodologias que possam selecionar com maior precisão embriões com maior capacidade de estabelecer uma gestação. Portanto, o objetivo do presente estudo foi identificar marcadores bioquímicos para a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro usando diferentes estratégias. A primeira, foi a identificação de marcadores para qualidade embrionária no meio em que os embriões foram cultivados. Para isso, o meio do cultivo dos embriões que geraram ou não prenhez foram comparados quanto ao perfil metabólico pela técnica de espectrometria de massa com ionização em eletrospray (ESIMS) e quanto a concentração de piruvato, lactato e glutamato, pela técnica de fluorimetria. Os embriões produzidos in vitro foram cultivados em gotas individuais por 48 horas, entre os dias (D) 5 e 7 de cultivo. No D7, o meio foi coletado e armazenado individualmente e os embriões foram transferidos para receptoras. Após o diagnóstico de gestação, o meio foi agrupado em dois grupos: meio do cultivo de embriões que geraram prenhez e o dos que não geraram prenhez. O resultado da espectrometria mostrou uma maior intensidade de sinal no meio do grupo que gerou prenhez comparado ao não prenhe. Na quantificação fluorimétrica foi observada uma maior concentração de piruvato e menor de lactato no meio de cultivo de blastocistos expandidos que geraram prenhez. A segunda estratégia para identificar possíveis biomarcadores de qualidade embrionária foi comparar o perfil metabólico do líquido da blastocele (LB) de blastocistos expandidos (Bx) produzidos in vivo e in vitro. Para isso, os embriões foram produzidos e no D7 do desenvolvimento foram submetidos à micromanipulação para a retirada do LB, que foi analisado por ESI-MS. Os perfis observados neste estudo claramente distinguem os embriões in vivo dos embriões in vitro. Os íons 437,18 m/z e 453,15 m/z detectados no LB dos embriões in vivo e o íon 398,06 m/z no LB dos in vitro são biomarcadores de embriões de diferentes origens com 100% de sensitividade e especificidade. Conclui-se que em ambas as estratégias adotadas neste trabalho foi possível identificar marcadores bioquímicos para qualidade de embriões bovinos.

Although in vitro embryo production (IVP) is an established technique that has been routinely used in humans and in domestic animal, the pregnancy and birth rates after transfer are still low. Due to this scenario, there is a need to establish a methodology for selecting embryos with greater implantation and birth potential. The aim of the present study was to identify biochemical markers for embryo quality using different strategies. The first was to use the culture medium to identify non-invasive markers of embryonic quality. For that, the culture medium of the embryos that generated or not generated pregnancy were compared in terms of the metabolic profile using the electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) and the concentration of pyruvate, lactate and glutamate, using the fluorimetry approach. Embryos produced in vitro were cultured in individual drops for 48 hours, between days (D) 5 and 7 of culture. At D7, the medium was collected and stored individually, and the embryos were transferred to the recipients. After the pregnancy diagnosis, the medium was separated into two groups: the culture medium from embryos that generated pregnancy and medium from those which did not generate pregnancy. The spectrometry result showed a higher signal intensity in the medium from the group that generated pregnancy compared to the non-pregnant group. Fluorimetric quantification showed a higher concentration of pyruvate and lower concentration of lactate in the culture medium of expanded blastocysts that generated pregnancy. The second strategy to identify possible biomarkers of embryo quality was to compare the metabolic profile of blastocoel fluid (BF) from expanded blastocysts (Bx) produced in vivo and in vitro. For that, embryos were produced and at D7 of the development the embryos were submitted to micromanipulation to remove the BF, which was analyzed by ESI-MS. The profiles observed in this study clearly distinguished in vivo embryos from those cultured in vitro. The ions 437.18 m/z and 453.15 m/z detected in the BF of in vivo embryos and the ion 398.06 m/z present in in vitro culture, are biomarkers of embryos from different origins with 100% sensitivity and specificity. In conclusion, both strategies adopted in this study were able to identify biochemical markers for quality of bovine embryos

ESTUDOS PRELIMINARES NA IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES NO SORO DE CAMUNDONGOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE POR Trypanosoma evansi

CALOMENO, Nathália Anderson. Estudos preliminares na identificação de biomarcadores no soro de camundongos infectados experimentalmente por Trypanosoma evansi. 2018. 106 p. Dissertação (Mestrado) - Universidade do Estado de Santa Catarina, Centro de Ciências Agroveterinárias, Mestrado em Ciência Animal, Lages, 2018. O Trypanosoma evansi é o agente causador do "mal das cadeiras" ou surra, uma tripanossomose responsável por perdas na equinocultura e consequentemente no manejo pecuário no Brasil. O diagnóstico diferencial das tripanossomoses é essencial para a tomada de medidas preventivas e curativas da doença. Recentemente, o uso de biomarcadores, como as proteínas do sangue, tem se tornado uma ferramenta poderosa para a detecção de um estado ou condição biológica, através da análise de tecidos ou fluídos biológicos. No entanto, a caracterização de proteínas como novos biomarcadores é um desafio uma vez que as proteínas plasmáticas mais abundantes representam 95% da proteína total na amostra, mascarando as proteínas de interesse com menor densidade e assim dificultando a análise. O uso de métodos de depleção de proteínas é atualmente uma alternativa que permite a remoção de proteínas plasmáticas de alta e média abundância, proporcionando o acesso às proteínas de baixa abundância para estudos de proteômica. A presente pesquisa teve como objetivo identificar biomarcadores proteicos na circulação sanguínea da infecção aguda pelo T. evansi em camundongos. A metodologia foi focada na utilização de um kit comercial de depleção baseado em troca iônica. As proteínas de baixa abundância recuperadas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com a subsequente identificação dos peptídeos por espectrometria de massa. A partir de um único animal infectado foram identificadas sete proteínas de T. evansi. Com análises de bioinformática, foi possível predizer que todas estão localizadas no citoplasma e/ou núcleo celular do tripanossomatídeo. Quatro delas (alfa e beta tubulina, piruvato quinase e HSP83) já foram identificadas como proteínas secretadas por microvesículas em tripanossomatídeos. Algumas já foram citadas na literatura por se mostrarem imunogênicas e nossos dados sugerem que todas podem ser possíveis biomarcadores da infecção deste parasita. Porém, ainda se faz necessário a repetição do experimento com um número maior de animais e réplicas triplicatas biológicas e experimentais para posteriormente validação dos biomarcadores e desenvolvimento de um teste de diagnóstico sensível e específico da infecção por T. evansi.

CALOMENO, Nathália Anderson. Preliminary studies on the identification of biomarkers in the serum of mice experimentally infected by Trypanosoma evansi. 2018. 106 p. Dissertation (Master) State University of Santa Catarina, Agroveterinary Science Center, Master in Animal Science, Lages, 2018. Trypanosoma evansi is the agent of "surra", a trypanosomosis responsible for losses in the echinoculture and consequently in cattle management in Brazil. The differential diagnosis of trypanosomes is essential for preventive and curative measures of the disease. Recently, the use of biomarkers, such as blood proteins, has become a powerful tool for the detection of a biological condition or state, through the analysis of biological tissues or fluids. However, the characterization of proteins as new biomarkers is a challenge since the most abundant plasma proteins represent 95% of the total protein in the sample, masking the proteins of interest with lower density and thus making the analysis difficult. The use of protein depletion methods is currently an alternative that allows the removal of high and medium abundance plasma proteins, providing access to proteins of low abundance for proteomics studies. The present work aimed to identify protein biomarkers in the bloodstream of acute T. evansi infection in mice. The methodology was focused on the use of a commercial depletion kit based on ion exchange. The low abundance proteins recovered were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis with subsequent identification of the peptides by mass spectrometry. Seven T. evansi proteins were identified from a single infected animal. With bioinformatics analyzes, it has been possible to predict that all are located in the cytoplasm and/or T. evansicell nucleus. Four of them (alpha and beta tubulin, pyruvate kinase and HSP83) have already been identified as proteins secreted by microvesicles in trypanosomatids. Some have already been cited in the literature for being immunogenic and our data suggest that all may be possible biomarkers of the infection of this parasit. However, it is still necessary to repeat the experiment with more animals and biological and experimental triplicates to later validate the biomarkers and develop a sensitive and specific diagnostic test for T. evansi infection.

Eletroforese bidimensional e espectrometria de massa como ferramentas proteômicas aplicadas à definição de marcadores proteicos associados à eficiência reprodutiva de caprinos / Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry as proteomic tools applied to the definition of protein markers associated with reproductive efficiency goats

O crescimento e desenvolvimento do rebanho caprino no Nordeste são observados com o aumento na produção da pecuária do Brasil. Esse aumento é reflexo, a princípio, das maiores exigências do mercado consumidor por produtos de melhor qualidade obtidos a partir de rebanhos de alto padrão zootécnico. As pesquisas atuais ilustram a necessidade de dispor de biomarcadores que auxiliem a indicação do potencial reprodutivo dos animais, uma vez que isso não pode ser expresso apenas com o exame andrológico. A avaliação da expressão das proteínas, tomando-as como biomarcadores, é análise potencial uma vez que estas, dentre os constituintes do plasma seminal, são encontradas em maior quantidade na forma de complexos associados, desempenhando papel crucial em todos os processos relacionados à capacidade fecundante dos espermatozoides. Essa análise é realizada por métodos de separação e detecção simultânea de proteínas utilizando técnicas como a eletroforese bidimensional (2DE) ou cromatografias, acoplados a métodos cada vez mais eficientes e sensíveis de identificação e quantificação de níveis de expressão de proteínas por espectrometria de massas. O objetivo desta revisão é abordar sobre a técnica de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa como ferramenta na análise da expressão de proteínas dentro do campo da proteômica.

The growth and development of goat herds in the northeast are being observed due to the increase in livestock production in Brazil. This increase reflects demands of the consumer market for high quality product, which are obtained from flocks of high standard zootechnics. Current research illustrates the need for biomarkers that indicate an animal ́s reproductive potential, since this cannot be expressed solely with andrologic evaluation. For this reason, the expression of the proteins as biomarkers is a potential analysis. The proteins from the seminal plasma constituents are found in larger amounts in the form of associated complexes, playing a crucial role in all processes related to the fertilizing capacity of sperm. This analysis is performed by separation methods and simultaneous detection of proteins using techniques such as two-dimensional electrophoresis (2DE) or chromatography. These techniques are coupled with methods to identify and quantify expression levels of proteins by mass spectrometry that are increasingly efficient and sensitive. The aim of this review was to discuss the technique of two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry as a tool in the analysis of protein expression within the field of proteomics.

Eletroforese bidimensional e espectrometria de massa como ferramentas proteômicas aplicadas à definição de marcadores proteicos associados à eficiência reprodutiva de caprinos / Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry as proteomic tools applied to the definition of protein markers associated with reproductive efficiency goats

O crescimento e desenvolvimento do rebanho caprino no Nordeste são observados com o aumento na produção da pecuária do Brasil. Esse aumento é reflexo, a princípio, das maiores exigências do mercado consumidor por produtos de melhor qualidade obtidos a partir de rebanhos de alto padrão zootécnico. As pesquisas atuais ilustram a necessidade de dispor de biomarcadores que auxiliem a indicação do potencial reprodutivo dos animais, uma vez que isso não pode ser expresso apenas com o exame andrológico. A avaliação da expressão das proteínas, tomando-as como biomarcadores, é análise potencial uma vez que estas, dentre os constituintes do plasma seminal, são encontradas em maior quantidade na forma de complexos associados, desempenhando papel crucial em todos os processos relacionados à capacidade fecundante dos espermatozoides. Essa análise é realizada por métodos de separação e detecção simultânea de proteínas utilizando técnicas como a eletroforese bidimensional (2DE) ou cromatografias, acoplados a métodos cada vez mais eficientes e sensíveis de identificação e quantificação de níveis de expressão de proteínas por espectrometria de massas. O objetivo desta revisão é abordar sobre a técnica de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa como ferramenta na análise da expressão de proteínas dentro do campo da proteômica.(AU)

The growth and development of goat herds in the northeast are being observed due to the increase in livestock production in Brazil. This increase reflects demands of the consumer market for high quality product, which are obtained from flocks of high standard zootechnics. Current research illustrates the need for biomarkers that indicate an animal ́s reproductive potential, since this cannot be expressed solely with andrologic evaluation. For this reason, the expression of the proteins as biomarkers is a potential analysis. The proteins from the seminal plasma constituents are found in larger amounts in the form of associated complexes, playing a crucial role in all processes related to the fertilizing capacity of sperm. This analysis is performed by separation methods and simultaneous detection of proteins using techniques such as two-dimensional electrophoresis (2DE) or chromatography. These techniques are coupled with methods to identify and quantify expression levels of proteins by mass spectrometry that are increasingly efficient and sensitive. The aim of this review was to discuss the technique of two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry as a tool in the analysis of protein expression within the field of proteomics.(AU)

Biomarcadores séricos e teciduais em fêmeas caninas com neoplasia mamária

Nos últimos anos, diversas áreas relacionadas às ciências da saúde têm intensificado a busca e a validação de ferramentas analíticas eficazes para a identificação de biomarcadoresquímicos e moleculares, que auxiliem no diagnóstico e prognósticode diversas doenças, entre elas o câncer. Com este projeto objetiva-se determinar a concentração sérica de proteínas da fase aguda, a atividade sérica e as concentrações teciduais das enzimas gama glutamiltransferase (GGT), da acetilcolinesterase (AChE) e da butirilcolinesterase (BuChE), bem como determinar aplicabilidade das enzimas como biomarcadores em cadelas com tumores mamários. E a importância da avaliação da haptoglobina e da proteína C reativa no processo de doença. Objetiva também, avaliar se por meio de detecções químicas, pela espectrometria de massas (MS-MALDI),a possibilidade deidentificar estes e outrosbiomarcadores, para a situação clínica estudada. A pesquisa será desenvolvida com 20 pacientes portadores de neoplasia mamária oriundos do serviço de oncologia do Hospital Veterinário da Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG e outras 20 fêmeas que vierem a óbito neste hospital, cujos casos não tenham ligação com o câncer e apresentem cadeia mamária livre de lesões. Os pacientes oncológicos serão triados e aceitos de acordo com os critérios de inclusão. Serão realizados exames colheitas de amostras antes e durante o processo de tratamento quimioterápico, para a realização de ensaios hematológicos, bioquímicos e proteômicos. E assim, os resultados deste estudo produzirão novas informações importantes para prognóstico na área de oncologia.

In recent years, several areas related to health sciences have intensified the search for and validation of effective analytical tools for the identification of chemical and molecular biomarkers, which aid in the diagnosis and prognosis of various diseases, including cancer. The objective of this project is to determine the serum concentration of proteins of the acute phase, serum activity and tissue concentrations of the gamma glutamyltransferase (GGT), acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) enzymes, as well as to determine the applicability of enzymes as biomarkers in bitches with breast tumors. And the importance of the evaluation of haptoglobin and C-reactive protein in the disease process. It also aims to evaluate the possibility of identifying these and other biomarkers by means of chemical detections, by mass spectrometry (MS-MALDI), for the clinical situation studied. The research will be carried out with 20 patients with breast cancer from the oncology service of the Veterinary Hospital of the Veterinary and Zootechnical School of the UFG and another 20 females that died in this hospital, whose cases are not related to the cancer and have a mammary chain free from injury. Cancer patients will be screened and accepted according to the inclusion criteria. Samples will be sampled before and during the chemotherapy treatment process, for hematological, biochemical and proteomic assays. And so, the results of this study will produce new important information for prognosis in the area of oncology.

PROTEOMA NUCLEAR E MICRO-RNAS DE ESPERMATOZOIDES DE BOVINOS FÉRTEIS E SUBFÉRTEIS

A compreensão da composição e fisiologia do espermatozoide é importante para compreender a subfertilidade transitória ou permanente em touros. Assim, objetivou-se com este trabalho avaliar as proteínas nucleares e micro-RNAs de espermatozoides de bovinos férteis e subférteis, na tentativa de se identificar marcadores moleculares de fertilidade e subfertilidade em touros. Para a avaliação de micro-RNAs foi utilizada a metodologia de RNA-seq e para as proteínas nucleares foi utilizada a espectrometria de massas avançada de amostras de sêmen de touros férteis e subférteis. Foram identificados 1306 micro-RNAs nas amostras de sêmen avaliadas. Identificou-se por análises computacionais os genes bta-miR- 380-5p, bta-miR-155, bta-miR-122, bta-miR-30c e bta-miR-34a como sendo diferencialmente expressos em touros férteis e subférteis, indicando que estes podem configurar possíveis marcadores de fertilidade. No entanto, ficou claro que não existe um micro-RNA único que marque diferentes tipos e causas de subfertilidade. Quanto às proteínas nucleares, foi possível verificar que espermatozoides de touro possuem na constituição de sua cromatina protamina 1 e 2, assim como as variações de histona subH2Bv, H2A.J, H2A.2C, H4, H2B.1, H1.2, H2A.Z, H3.1, H3.3C, H3.3C-like, H1.3, H3.3, H3.2. Dentre proteínas nucleares, contaminantes de outros compartimentos do espermatozoide e do plasma seminal, identificou-se a proteína Acil-tioesterase 1 (APT-1), o fator beta de crescimento do nervo (Beta-NGF), a proteína do plasma seminal A3 (BSP-3), a Histona H2A.J, a proteína FAM71D, as proteínas ribossomais 40S-S8 e a 60S-L9, o inibidor de serina protease plasmática (Protein C inhibitor) (PCI) (Serpin A5) e a subunidade alfa catalítica da proteína quinase dependente de cAMP como tendo potencial para serem utilizadas como marcadoras de fertilidade. Já a proteína ATPase do reticulo endoplasmático transicional, a subunidade 5 da NADH desidrogenase (ubiquinona) do subcomplexo 1 alfa, a proteína de choque térmico beta-9, as proteínas ribossomais 60S-L12 e 40S-S7 e a proteína acetiltransferase do acetil-CoA apresentaram potencial para serem utilizadas como marcadoras de subfertilidade.

Understanding the composition and physiology of spermatozoa is important to understand transient or permanent subfertility in bulls. Thus, the objective of this work was to evaluate the nuclear and micro-RNA spermatozoa of fertile and subfertile cattle, in an attempt to identify molecular markers of fertility and subfertility in bulls. For the evaluation of micro- RNAs the RNA-seq methodology was used and for nuclear proteins the advanced mass spectrometry of semen samples from fertile and subfertile bulls was used. A total of 1306 micro-RNAs were identified in the semen samples evaluated. The bta-miR-380-5p, bta-miR- 155, bta-miR-122, bta-miR-30c and bta-miR-34a genes were identified by computational analysis as being differentially expressed in fertile and subfertile bulls, indicating that they can set up possible fertility markers. However, it was clear that there is no single micro-RNA that marks different types and causes of subfertility. As for the nuclear proteins, it was possible to verify that spermatozoa of bull have in the constitution of their protamine chromatin 1 and 2, as well as the histone variations subH2Bv, H2A.J, H2A.2C, H4, H2B.1, H1.2, H2A .Z, H3.1, H3.3C, H3.3C-like, H1.3, H3.3, H3.2. Among nuclear proteins and contaminants from other sperm and seminal plasma compartments, the acyl thioesterase 1 protein (APT-1), nerve growth factor beta (Beta-NGF), seminal plasma protein A3 ( BSP-3), Histone H2A.J, FAM71D protein, 40S-S8 and 60S-L9 ribosomal proteins, the plasma serine protease inhibitor (Protein C inhibitor) (Serpin A5) and the catalytic alpha subunit of the cAMP-dependent protein kinase as having potential to be used as a fertility marker. On the other hand, the ATPase protein of the transitional endoplasmic reticulum, subunit 5 of NADH dehydrogenase (ubiquinone) of subcomplex 1 alpha, beta-9 heat shock protein, ribosomal proteins 60S-L12 and 40S-S7 and acetyl-CoA protein acetyltransferase presented potential to be used as subfertility markers.

AVALIAÇÃO PROTEÔMICA DE PLASMA SEMINAL DE TOUROS HOLANDESES (Bos taurus) DE ALTA E BAIXA FERTILIDADE

Dentre os fatores que determinam a fisiologia e a capacidade de fertilização dos espermatozoides de mamíferos, encontram-se as proteínas, mantidas suspensas no plasma seminal. Diversos estudos vêm sendo realizados para descrever e avaliar as proteínas do plasma seminal de diversas espécies, com diferentes condições de fertilidade. Este estudo objetivou analisar o proteoma do plasma seminal de touros holandeses (Bos taurus). Objetivou-se também a análise comparativa entre proteomas de plasma seminal de touros de alta e baixa fertilidades. Através de abordagem Shotgun, livre de marcações, utilizando cromatografia líquida de alta performance acoplada à espectrometria de massa (HPLC-MS) o plasma seminal de dez touros (divididos igualmente entre grupos de alta e baixa fertilidades) advindos de central de inseminação artificial foi descrito. Foram identificadas 1.159 proteínas no plasma seminal de touros, das quais 79 apresentaram abundâncias diferentes entre os grupos. Dentre as proteínas, oito indicaram contribuição significativa para a definição do fenótipo de fertilidade (P <0,05). As proteínas superexpressas em touros de alta fertilidade foram o peptídeo natriurético do tipo C, o inibidor de metaloproteinase 2, a proteína ligadora de espermatozoide - 30kDa e a sulfidrila oxidase. Enquanto isso, a clusterina, o inibidor da via do fator tecidual 2, a proteína de ligação à galectina-3 e a 5'-nucleotidase foram as proteínas superexpressas em touros de baixa fertilidade. Em seguida, um índice de classificação de fertilidade baseado em abundância de proteínas do plasma seminal foi calculado (rho de Spearman = 0,91). Os resultados encontrados representam uma grande contribuição para a construção do banco de dados das proteínas seminais bovinas. Futuramente, através de estudos baseados nos dados do presente trabalho e também em literatura, biomarcadores poderão ser utilizados para melhorar as biotécnicas reprodutivas para touros e demais mamíferos, incluindo seres humanos.

Among the factors determining mammalian spermatozoa physiology and fertilization capacity, there are proteins, which are found suspended in seminal plasma. Several studies have been carried out to describe and evaluate the proteome of seminal plasma of several species with different fertility conditions. This study aimed to analyze the seminal plasma proteome of Holstein bulls (Bos taurus). A comparative analysis between seminal plasma proteomes of bulls with high and low fertility was also carried out. Using a high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), the seminal plasma of ten bulls (divided equally between high and low fertility groups) from artificial insemination was described. In the total, 1.159 proteins were identified, of which 79 showed different abundance between the groups. Among the proteins, eight indicated a significant contribution to the definition of the fertility phenotype (P <0.05). Overexpressed proteins in high fertility bulls were the type C natriuretic peptide, metalloproteinase 2 inhibitor, sperm binding protein - 30kDa and sulfhydryl oxidase. Meanwhile, clusterin, tissue factor pathway 2 inhibitor, galectin-3 binding protein and 5'-nucleotidase were overexpressed in low fertility bulls. Then, a fertility classification index based on proteins abundance was calculated (Spearman's rho = 0.91). The results represent a major contribution to the construction for building a library of the bovine seminal proteins. In the future, through researches based in the data from present study and literature, biomarkers will be able to be used to improve reproductive biotechniques for bulls and other mammals, including humans.

ALTERAÇÕES PROTEÔMICAS DE CAENORHABDITIS ELEGANS SOB PRESSÃO DE SELEÇÃO DA IVERMECTINA

O parasitismo por nematoides gastrointestinais é um dos principais obstáculos enfrentados pela ovinocaprinocultura mundial. Independente do hospedeiro, essa doença é controlada pela administração de drogas anti-helmínticas, como a ivermectina. O uso indiscriminado destes medicamentos acelera a seleção de subpopulações de nematoides capazes de resistir aos efeitos das drogas. O objetivo deste trabalho foi identificar marcadores moleculares que possibilitem o acompanhamento da resistência em nematoide de vida livre, Caenorhabditis elegans e entender os mecanismos de resistência à ivermectina. Para tanto foram utilizadas linhagens de C. elegans sensíveis e resistentes à ivermectina. Após cultivo os nematóides, foram recolhidos das placas e encaminhados para a extração protéica. As proteínas obtidas foram separadas por massa molecular em SDS-PAGE para verificar a integridade da proteína. Posteriormente, as proteínas de ambas as linhagens foram conduzidas a separação por pI e massa molecular em eletroforese bidimensional. Os géis foram analisados e excisados os spots referente as proteínas mais expressas e exclusivamente expressas de cada linhagem. Os spots seguiram para identificação em espectrometria de massa, Nano ESI-Q-TOF. As proteínas foram identificadas pelo MASCOT®, analisadas segundo seus termos de GO e verificado suas interações com o auxilio do STRING®. Os termos de GO para linhagem sensível ressaltaram o excesso de proteínas de defesa característico de C. elegans por se tratar de nematoide de vida livre. Na linhagem resistente foi possível destacar o aumento nos processos metabólicos, assim como a expressão de proteínas responsáveis pela geração de ATP, por exemplo, a ATP-2 e ENOL-1. Também foram identificadas proteínas responsáveis pela manutenção da função muscular, como MLC-1, ACT-1 e PDI-2, pelo desenvolvimento do embrião, VHA-2 e pela sinalização, FAR-1 e FAR-2. A interação proteica permitiu inferir que a maioria das proteínas identificadas na linhagem resistente faz parte da mesma cadeia de resposta ao estresse provocado pela ivermectina. Assim é possível concluir que os perfis proteicos de linhagens resistentes diferem de linhagens sensíveis e que as proteínas identificadas na linhagem resistente são responsáveis por contrapor o efeito da ivermectina.

The parasitism by gastrointestinal nematodes and an of the main obstacles faced by the ovine and caprine flock in the world. Independent of the host, these illnesses are control by anthelmintic drugs administration, as ivermectin. The indiscriminate use of these drugs, inevitably, contributed to the helminthic subpopulations selection capable of resist the dugs effects. The study aimed to identify Caenorhabditis elegans molecular targets to understand the mechanisms of ivermectin resistance. Therefore, were used Caenorhabditis elegans strains sensible and resistant to ivermectin. After the nematode growth, they were isolated and used in the protein extraction. The obtained proteins were separated by molecular weight in SDS-PAGE to certify the protein integrity. Posteriorly, the proteins from both strains were conducted to pI and molecular weight separation in two-dimensional electrophoresis. The gels were analyzed and excised the spots related to the most expressed proteins and the exclusively expressed of each strain. The spots were identified by mass spectrometry, Nano ESI-Q-TOF. The proteins were identify by MASCOT®, analyzed by GO terms and verified their interactions with the aid of STRING®. The GO terms to the sensible strain highlighted the defense proteins characteristic of C. elegans because it is a free-living nematode. In the resistant strain was possible to highlight the increase in the metabolic process, as in the expression of the proteins responsible for the ATP synthesis, for example, the ATP-2 and ENOL-1. Also, were identifying proteins responsible to manage the muscular function, the MLC-1, ACT-1 and PDI-2, for the embryo development, VHA-2, and the signaling, FAR-1 and FAR-2. The protein interaction allows infer that most proteins identified in the resistant strain participate in the same response chain to the stress induced by the ivermectin. Thus, it is possible conclude that the resistant strain protein profile differs from the sensible strain and that the resistant strain proteins identify are responsible to interpose the ivermectin effect.

PROTEÔMICA DO HISTOTROFO DURANTE O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO INICIAL NA ÉGUA

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-offlight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celul ares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez.

There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed , embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

ATRAÇÃO E VISITAÇÃO DA ABELHA Apis mellifera A FLORES DE CINCO TIPOS COMERCIAIS DE MELOEIRO (Cucumis melo)

O objetivo desse trabalho foi comparar a produção de pólen e néctar nas flores de meloeiro e correlacionar com as visitas de abelhas Apis mellifera, além de descrever a composição química do nécar produzido nos diferentes tipos de meloeiro. O experimento foi realizado no Campo Experimental de Pacajus. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado com cinco tratamentos (tipos comerciais de meloeiro Amarelo, Cantaloupe, Charentais, Gália e Pele de Sapo) e oito repetições. A visitação de A. mellifera nas flores do meloeiro foi quantificada durante quatro dias, das 5 às 16 horas, em flores hermafroditas e masculinas, registrando-se por coleta de pólen (VHP e VMP) e de néctar (VHN e VMN). Para a contagem de grãos de pólen foram coletados aleatoriamente 10 botões florais masculinos e 10 botões florais hermafroditas em cada tipo de meloeiro. Na coleta de néctar foram amostradas em cada horário de coleta do néctar três flores masculinas e três flores hermafroditas eram coletadas, totalizando por dia 18 flores masculinas e 18 flores hermafroditas para cada tipo de meloeiro com auxílio de capilares graduados de cinco microlitros. As amostras de néctar coletado das flores dos diferentes tipos de meloeiro foram tratadas com uma mistura de água e metanol (1:1), depois foram injetadas no equipamento (UPLCQTOF-MS). A comparação de todos os picos de LC foi realizada utilizando a ferramenta composição elementar do MassLynx. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5%. Também foi realizada a correlação entre a produção de néctar e pólen e as visitas das abelhas, utilizando-se do programa estatístico SISVAR. Nas flores hermafroditas os tipos Amarelo e Pele de sapo produziram mais grãos de pólen e não houve diferença na produção de pólen entre as flores masculinas. Nas flores hermafroditas o Charentais produziu maior volume de néctar e nas flores masculinas não houve diferença estatística. O padrão de produção de néctar das flores de meloeiro é linear. O meloeiro Cantaloupe foi o mais visitado, as abelhas visitam mais flores hermafroditas que masculinas e coletam mais néctar que pólen nas flores de meloeiro. Não houve correlação entre a produção de recursos alimentares e a visita das abelhas. Foram tentativamente identificados 26 metabólitos, incluindo açúcares, flavonóides e aminoácidos. Houve diferença na produção de pólen em flores hermafroditas, mas não nas flores masculinas. O mesmo padrão ocorreu na produção de néctar, exceto para concentração onde o melão tipo Cantaloupe apresentou néctar mais concentrado, particularmente nas flores masculinas. Flores hermafroditas são mais visitadas e o néctar é mais coletado.

The objective of this work was to compare the production of pollen and nectar produced in the melon flowers and correlate with the visits of Apis mellifera bees, besides describing the chemical composition of the nectar produced in the different melon types. The experiment was carried out in the Experimental Field of Pacajus. The design was completely randomized with five treatments (commercial types of melon - Yellow, Cantaloupe, Charentais, Galia and Piel de Sapo) and eight repetitions. The visitation of A. mellifera in the flowers of the melon was quantified during four days, from 5 to 16 hours, in hermaphrodite and male flowers, being recorded by pollen collection (HPV and MPV) and nectar (HNV and MNV). For the pollen grain count, 10 male floral buds and 10 hermaphroditic floral buds were randomly collected in each type of melon. In the collection of nectar, three male flowers and three hermaphrodite flowers were collected at each nectar collection time, totaling 18 male flowers and 18 hermaphrodite flowers for each type of melon with 5 microliter graduated capillaries. The samples of nectar collected from flowers of the different melon types were treated with a mixture of water and methanol (1:1), then injected into the equipment (UPLCQTOF-MS). The comparison of all LC peaks was performed using the MassLynx elemental composition tool. The data were submitted to variance analysis, and the means were compared by the Tukey test at 5%. The correlation between nectar and pollen production and bee visits was also performed using the SISVAR statistical program. In the hermaphrodite flowers, the Yellow and Piel de Sapo types produced more grains of pollen and there was no difference in pollen production among the male flowers. In the hermaphrodite flowers the Charentais produced greater volume of nectar and in the male flowers there was no statistical difference. The nectar production pattern of the melon flowers is linear. The melon Cantaloupe was the most visited, bees visit more hermaphrodite flowers than male flowers and collect more nectar than pollen in the melon flowers. There was no correlation between the production of food resources and the visit of the bees. 26 metabolites have been tentatively identified, including sugars, flavonoids and amino acids. There was a difference in the production of pollen in hermaphrodite flowers, but not in male flowers. The same pattern occurred in the production of nectar, except for nectar concentration that was higher to the Cantaloupe type, especially in male flowers. Hermaphrodite flowers are more visited and the nectar is more collected.

CORRELAÇÃO DO PERFIL LIPÍDICO COM AS CARACTERISTICAS SEMINAIS DO TOURO NELORE (Bos taurus indicus) DE ALTA E BAIXA RESISTÊNCIA ESPERMÁTICA À CRIOPRESERVAÇÃO

A composição dos lipídeos da membrana espermática e do plasma seminal estão entre os fatores que podem influenciar a capacidade fecundante do sêmen. Desta maneira, este estudo objetivou analisar as diferenças do perfil lipídico do ejaculado de bovinos da raça Nelore, resistentes e sensíveis à criopreservação. Foram utilizados 23 touros da raça Nelore para colheitas de sêmen utilizando eletroejaculador. Os ejaculados foram diluídos com meio convencional na concentração de 25x106 espermatozoides/palheta. Os animais foram divididos em dois grupos conforme a resistência pós-criopreservação, grupo A (Bad freezer, touros sensíveis à criopreservação) e grupo B (Good freezer, touros resistentes à criopreservação). O sêmen fresco foi analisado quanto morfologia realizada por microscopia de interferência diferencial (DIC), cinética espermática e integridade da membrana. Na pós-descongelação as amostras foram avaliadas quanto a cinética espermática, integridade das membranas plasmáticas e acrossomal, caspase ativa, peroxidação lipídica. A análise do perfil de lipídios foi realizada por espectrometria de massa MALDI-MS. Foi possível observar diferença no perfil lipídico dos espermatozoides entre os grupos, com maior abundância relativa dos íons m/z 792,5; m/z 790,5; m/z 415,2; m/z 791,5; m/z 793,5; m/z 376,2; m/z 437,1; m/z 794,6; m/z 453,1 e m/z 416,2 no grupo B em relação ao grupo A. Também foi possível observar diferença no perfil lipídico do plasma seminal entre os grupos, porém com maior abundância relativa dos íons m/z 415,2; m/z 432,2; m/z 621,3; m/z 790,5; m/z 416,2; m/z 119,0; m/z 376,2; m/z 663,4 e m/z 791,5 no grupo A em relação ao grupo B. Assim sendo, conclui-se que existe diferença no perfil de lipídios dos espermatozoides no plasma seminal de touros sensíveis ou resistentes à criopreservação.

Lipid compositions of the sperm membrane are among the factors that can influence the semen fertilizing capacity. Likewise, the lipid composition of seminal plasma can interfere in sperm quality. In this sense, this study aimed to analyze differences between lipid profile of the ejaculate and sperm parameters from bulls (Nelore breed) wich are resistant and susceptible to cryopreservation. In the study 23 Nelore bulls were used for semen collection by electroejaculation. The samples were diluted with yolk egg-based extender (Botu-Bov®). The animals were divided into two groups according to semen quality after cryopreservation: group A (Bad freezer, bulls sensitive to cryopreservation) and group B (Good freezer, bulls resistant to cryopreservation). Fresh semen was analyzed for sperm morphology by differential interference contrast microscopy (DIC), kinetic parameters by CASA and by plasma membrane integrity by epifluorescence microscopy. In post-freezing the samples were evaluated for kinetic parameters by CASA, sperm viability by flow cytometry (plasma and acrosomal membrane integrity, lipid peroxidation and active caspase) and plasma mebrane integrity by epifluorescence microscopy. Analysis of lipid profile were carried out by mass spectrometry MALDI-MS of the sperm membrane lipids (Experiment 1) and from seminal plasma (Experiment 2). In Experiment 1 was observed difference in sperm lipid profile between the groups. The group B showed highest relative abundance of ions m/z 792.5; m/z 790.5; m/z 415.2; m/z 791.5; m/z 793.5; m/z 376.2; m/z 437.1; m/z 794.6; m/z 453.1 and m/z 416.2 than the group A. In Experiment 2, it was also possible to observe differences in the seminal plasma lipid profile between groups, but the group A showed higher relative abundance of ions m/z 415.2; m/z 432.2; m/z 621.3; m/z 790.5; m/z 416.2; m/z 119.0; m/z 376.2; m/z 663.4 and m/z 791.5 than group B. Therefore, in conclusion there are differences in the sperm lipid profile and seminal plasma lipid profile between sensitive or resistant bulls to semen cryopreservation.