Advances in flow cytometry in basic and applied equine andrology

The aim of this review is to present the current probes available that assess different compartments and functions of stallion spermatozoa, including assays to investigate the functionality of the membranes, nucleus and mitochondria, and to study cell signaling in this particular cell. New multi-parametric protocols for the assessment of stallion sperm, recently developed in the laboratory of the authors, will also be presented. The potential clinical applicability of diagnostic tests based on flow cytometry will also be discussed.

Advances in flow cytometry in basic and applied equine andrology

The aim of this review is to present the current probes available that assess different compartments and functions of stallion spermatozoa, including assays to investigate the functionality of the membranes, nucleus and mitochondria, and to study cell signaling in this particular cell. New multi-parametric protocols for the assessment of stallion sperm, recently developed in the laboratory of the authors, will also be presented. The potential clinical applicability of diagnostic tests based on flow cytometry will also be discussed.(AU)

Impacto da qualidade do sêmen sobre a fertilidade a campo em bovinos / Impact of semen quality on field fertility in cattle

A fertilização envolve um processo complexo e requer muitos atributos espermáticos para seu sucesso.Há uma grande variação no sêmen de diferentes touros e partidas, o que causa uma oscilação no potencial defertilidade. A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) utilizando partidas de sêmen com reduzido potencialde fertilidade causa um grande impacto na produtividade do rebanho. Partidas de sêmen que apresentamcaracterísticas de motilidade progressiva, vigor, defeitos morfológicos e concentração dentro das aceitáveis parao uso na IA podem mostrar deficiência no potencial de fertilidade, o que pode ser atribuído a alterações emestruturas ou funções espermáticas não contempladas nestas avaliações. Várias técnicas vêm sendodesenvolvidas buscando a identificação de alterações espermáticas que resultam em falha na fertilidade;revelando com mais precisão lesões nas células espermáticas após o processo de criopreservação. Este texto visaabordar, baseados principalmente em nossas experiências, as falhas de fertilidade inerentes ao sêmen e o quantoas técnicas laboratoriais podem predizer sobre o potencial de fertilidade de uma partida de sêmen antes do uso naIATF e seu impacto sobre a fertilidade do rebanho.(AU)

Fertilization involves a complex process and requires many sperm attributes for its success. There isgreat variation in the semen of different bulls and batch, which causes an oscillation in fertility potential. Theuse in TAI of semen batch with reduced fertility potential causes a great impact on the productivity of the herd.Semen batches that exhibit characteristics of progressive motility, vigor, morphological defects andconcentration within those acceptable for use in AI may show reduction in fertility potential, which may beattributed to changes in structures or sperm functions not contemplated in these evaluations. Several techniqueshave been developed to identify sperm alterations that result in failure of fertility; revealing more accuratelysperm cell lesions after the cryopreservation process. This paper aims to address, essentially based on ourexperiences, fertility failures inherent to semen and how laboratory techniques can predict the fertility potentialof a semen batch prior to use in TAI and its impact on herd fertility.(AU)

Impacto da qualidade do sêmen sobre a fertilidade a campo em bovinos / Impact of semen quality on field fertility in cattle

A fertilização envolve um processo complexo e requer muitos atributos espermáticos para seu sucesso.Há uma grande variação no sêmen de diferentes touros e partidas, o que causa uma oscilação no potencial defertilidade. A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) utilizando partidas de sêmen com reduzido potencialde fertilidade causa um grande impacto na produtividade do rebanho. Partidas de sêmen que apresentamcaracterísticas de motilidade progressiva, vigor, defeitos morfológicos e concentração dentro das aceitáveis parao uso na IA podem mostrar deficiência no potencial de fertilidade, o que pode ser atribuído a alterações emestruturas ou funções espermáticas não contempladas nestas avaliações. Várias técnicas vêm sendodesenvolvidas buscando a identificação de alterações espermáticas que resultam em falha na fertilidade;revelando com mais precisão lesões nas células espermáticas após o processo de criopreservação. Este texto visaabordar, baseados principalmente em nossas experiências, as falhas de fertilidade inerentes ao sêmen e o quantoas técnicas laboratoriais podem predizer sobre o potencial de fertilidade de uma partida de sêmen antes do uso naIATF e seu impacto sobre a fertilidade do rebanho.

Fertilization involves a complex process and requires many sperm attributes for its success. There isgreat variation in the semen of different bulls and batch, which causes an oscillation in fertility potential. Theuse in TAI of semen batch with reduced fertility potential causes a great impact on the productivity of the herd.Semen batches that exhibit characteristics of progressive motility, vigor, morphological defects andconcentration within those acceptable for use in AI may show reduction in fertility potential, which may beattributed to changes in structures or sperm functions not contemplated in these evaluations. Several techniqueshave been developed to identify sperm alterations that result in failure of fertility; revealing more accuratelysperm cell lesions after the cryopreservation process. This paper aims to address, essentially based on ourexperiences, fertility failures inherent to semen and how laboratory techniques can predict the fertility potentialof a semen batch prior to use in TAI and its impact on herd fertility.

Avaliação da qualidade do sêmen de cachaços: o que é possível ser feito? / Evaluation of the boar semen quality: what can be done?

A utilização de técnicas avançadas para a analise de sêmen de cachaços apesar de ainda ser restrita adeterminados setores do sistema de produção de suínos, tem se tornado aplicável e de extrema importânciadentro, tanto de centrais comerciais de sêmen como nos centros de pesquisas ao redor do mundo. Dentre taistecnologias, pode-se citar as análises computadorizadas da motilidade associada a avaliação da morfometriaespermática, além das avaliações por sondas fluorescentes averiguando-se as integridades dos mais diferentescompartimentos celulares, podendo tais técnicas serem realizadas não apenas por microscopia deepifluorescência, mas também por citometria de fluxo. Entretanto, deve-se destacar a não individualização dastécnicas abordadas, devido a inter-relação das estruturas espermáticas perante o processo de fertilização. Assim,as diversas avaliações devem ocorrer simultaneamente, tendo em vista a necessidade da perfeita integridadedeste conjunto de estruturas para a perfeita fisiologia da célula espermática.(AU)

The use of advanced boar semen analysis although it is restricting to certain sectors of the swineproduction system, it is becoming relevant and extremely important in both commercial AI and research centersaround the world. Of all technologies available, one may mention the computerized motility analysis (CASA)combined with sperm morphology (ASMA), and the use of fluorescent probes to verify the integrity of thedifferent cellular compartments by means of epifluorescence microscopy or flow cytometry. However, it shouldbe emphasized the non-individualization of the techniques discussed, due to the necessity of the perfect integrityof this set of structures for the perfect sperm cell physiology.(AU)

Avaliação da qualidade do sêmen de cachaços: o que é possível ser feito? / Evaluation of the boar semen quality: what can be done?

A utilização de técnicas avançadas para a analise de sêmen de cachaços apesar de ainda ser restrita adeterminados setores do sistema de produção de suínos, tem se tornado aplicável e de extrema importânciadentro, tanto de centrais comerciais de sêmen como nos centros de pesquisas ao redor do mundo. Dentre taistecnologias, pode-se citar as análises computadorizadas da motilidade associada a avaliação da morfometriaespermática, além das avaliações por sondas fluorescentes averiguando-se as integridades dos mais diferentescompartimentos celulares, podendo tais técnicas serem realizadas não apenas por microscopia deepifluorescência, mas também por citometria de fluxo. Entretanto, deve-se destacar a não individualização dastécnicas abordadas, devido a inter-relação das estruturas espermáticas perante o processo de fertilização. Assim,as diversas avaliações devem ocorrer simultaneamente, tendo em vista a necessidade da perfeita integridadedeste conjunto de estruturas para a perfeita fisiologia da célula espermática.

The use of advanced boar semen analysis although it is restricting to certain sectors of the swineproduction system, it is becoming relevant and extremely important in both commercial AI and research centersaround the world. Of all technologies available, one may mention the computerized motility analysis (CASA)combined with sperm morphology (ASMA), and the use of fluorescent probes to verify the integrity of thedifferent cellular compartments by means of epifluorescence microscopy or flow cytometry. However, it shouldbe emphasized the non-individualization of the techniques discussed, due to the necessity of the perfect integrityof this set of structures for the perfect sperm cell physiology.

Caracterização física e estrutural de espermatozoides no ejaculado de Caprinos Azul, Canindé, Moxotó e Repartido / Physical and structural characterization of sperm in the ejaculate from Azul, Caninde, Moxotó and Repartido goat races

This study aimed to evaluate physically and structurally ejaculates from locally adapted goats in therainy season. Semen pool formed by the four goats of each breed was evaluated for physical, diluted in Tris-eggyolk and frozen. After thawing, it was diluted in Tris and incubated with carboxyfluorescein diacetate andpropidium iodide, to evaluate the integrity of the plasma membrane and JC1 to assess mitochondrial activity.The percentage of cells with damaged membrane and mitochondrial activity in spermatozoa between breed werecompared, every hour for three hours. There was no significant difference (P > 0,05) in relation to thepercentage of cells with damaged plasma membrane, as well as between the incubation times. The Azul breedhad lower mitochondrial activity (P < 0,05). The evaluated semen of all breeds showed no significant damage tothe plasma membrane in the rainy season, but the Azul breed had lower mitochondrial activity in sperm cells.(AU)

Caracterização física e estrutural de espermatozoides no ejaculado de Caprinos Azul, Canindé, Moxotó e Repartido / Physical and structural characterization of sperm in the ejaculate from Azul, Caninde, Moxotó and Repartido goat races

This study aimed to evaluate physically and structurally ejaculates from locally adapted goats in therainy season. Semen pool formed by the four goats of each breed was evaluated for physical, diluted in Tris-eggyolk and frozen. After thawing, it was diluted in Tris and incubated with carboxyfluorescein diacetate andpropidium iodide, to evaluate the integrity of the plasma membrane and JC1 to assess mitochondrial activity.The percentage of cells with damaged membrane and mitochondrial activity in spermatozoa between breed werecompared, every hour for three hours. There was no significant difference (P > 0,05) in relation to thepercentage of cells with damaged plasma membrane, as well as between the incubation times. The Azul breedhad lower mitochondrial activity (P < 0,05). The evaluated semen of all breeds showed no significant damage tothe plasma membrane in the rainy season, but the Azul breed had lower mitochondrial activity in sperm cells.

Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.(AU)

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.(AU)

Ferramentas para avaliação da funcionalidade da mitocôndria espermática / Tools for evaluating the functionality of sperm mitochondria

A mitocôndria é a principal fonte de energia para a motilidade e a homeostase espermática. Durante afosforilação oxidativa são produzidos metabólitos, denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), as quaisdesempenham papel fundamental nos processos fisiológicos. No entanto, disfunções mitocondriais podem causardesequilíbrio entre a produção de EROs e os mecanismos antioxidantes, provocando o estresse oxidativo, letalpara a célula espermática. Assim, como essa organela está envolvida tanto nos processos fisiológicos quanto nospatológicos dos espermatozoides, fica clara a importância de se avaliar sua funcionalidade. Portanto, o objetivodesta revisão é descrever as possíveis técnicas de avaliação da funcionalidade das mitocôndrias espermáticas pormeio da atividade e do potencial da membrana mitocondrial, da mensuração dos níveis de ATP e ADP e damensuração dos níveis de cálcio.

Mitochondria are the major source of energy for sperm motility and to the homeostasis. During theoxidative phosphorylation metabolites called Reactive Oxygen Species (ROS), are produced and play a key rolefor the physiological processes. However, mitochondrial dysfunctions can cause an imbalance between ROSproduction and antioxidant mechanisms cause oxidative stress, lethal for spermatozoa. Thus, as this organelle isinvolved both in physiological or pathological processes of sperm, it is clear the importance of evaluating itsfunctionality. Therefore, the aim of this review is to describe the possible techniques for assessing functionalityof sperm mitochondria and these assessments of activity and mitochondrial membrane potential, measuring thelevels of ATP and ADP and measurement the levels of calcium.

VALIDAÇÃO DO PISUM ARVENSE NA AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ACROSSOMAL EM ESPERMATOZOIDES DE RUMINANTES

ZIMMERMANN, Aline. T. Validação do Pisum arvense na avaliação da integridade acrossomal em espermatozoides de ruminantes. 2019, 51 p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal). Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Lages, 2019. A inseminação artificial é uma importante biotécnica de reprodução, sendo a avaliação do sêmen primordial para garantir bons índices reprodutivos. Rotineiramente, são observados parâmetros como motilidade, concentração, vigor e movimento de massa, além outras análises que buscam antever com maior exatidão a qualidade e o desempenho do sêmen in vivo. Neste contexto, a avaliação do acrossomo tem ganhado importância nas pesquisas. O uso de sondas fluorescentes vem sendo empregado nesta avaliação, com destaque para a FITC/PSA (Sigma L0770), que é comercializado por uma empresa multinacional. Recentemente foi demonstrado a possibilidade da utilização da proteína do Pisum arvense com a mesma finalidade. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi validar o emprego de Pisum arvense (FITC/PLA) na avaliação da reação acrossomal em células espermáticas de ovinos e bovinos. Utilizou-se sêmen ovino, fresco, resfriado e congelado e sêmen bovino congelado. As amostras foram avaliadas quanto a motilidade, vigor, turbilhão e concentração, sendo empregados apenas os ejaculados com mais de 70% de motilidade e critérios de viabilidade do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Após as análises iniciais foram confeccionados os esfregaços e adicionadas as sondas fluorescentes. As lâminas foram avaliadas em microscópico de epifluorescência, sendo avaliadas 200 células, classificadas de acordo com a coloração do acrossomo em intactas ou lesionadas. Os dados relativos ao percentual de acrossomos intactos obtidos com os dois tratamentos foram submetidos a teste de normalidade dos resíduos e análise de variância (ANOVA). Não houve diferença estatística entre os tratamentos. O percentual de acrossomos íntegros nos grupos de sêmen ovino fresco, resfriado e congelado, diferiram pelo teste de Tukey. Foi realizada regressão linear simples entre motilidade e percentual de acrossomos íntegros, sendo observado uma correlação positiva nas amostras de sêmen ovino (r2=0.7145). Todas as avaliações tiveram nível de significância de 5 %. Conclui-se que o FITC/PLA tem a mesma eficiência do FITC/PSA para mensurar a reação acrossomal de sêmen de carneiros e touros.

ZIMMERMANN, Aline. T. Validation of the Pisum arvense to assess acrosome integrity in ruminant spermatozoa. 2019, 51p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal). Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Lages, 2019. The artificial insemination is an important reproductive biotechnology, and semen evaluation is essential to assure adequate reproductive efficiency. Routinely, parameters such as motility, concentration, vigor and mass movement are observed, as well as other analyzes that seek to more accurately predict the quality and performance of semen in vivo. In this context, the acrosome evaluation has gained importance. The fluorescent probes has been used in this evaluation, with emphasis on FITC/PSA (Sigma L0770), which marketed of a multinational company. Recently it was demonstrated the possibility of to use the Pisum arvense protein with the same purpose. In this way, the aim of this study was to validate the use of Pisum arvense (FITC/PLA) in the acrosome evaluation of ovine and bovine spermatozoa. Ram fresh, cooled and frozen semen, and bovine frozen semen were used in the study. The samples were evaluated by parameters as motility, vigor, mass movement, and concentration. Only ejaculates with more than 70% motility and viability criteria according Brazilian College of Animal Reproduction were used. After the initial analyzes the semen smears were performed, and the fluorescent probes added. The slides were analysed under an epi-fluorescent microscope, where 200 cells were classified according to the acrosome staining, as intact or damaged acrosome. Data were submitted to the normality test of the residues and analysis of variance (ANOVA). There was no statistical difference between treatments. The means of intact acrosome in groups of fresh, cooled and frozen ram semen showed a significant difference by Tukey test. It was performed a linear regression between sperm motility and intact acrosome, being observed a positive correlation in rams semen groups (r2=0.7145). All evaluations had significance level of 5 %. We concluded that the FITC/PLA has the same efficiency of the FITC/PSA to evaluate the acrosome reaction of rams and bulls semen.

Indicadores da eficiência reprodutiva do garanhão / Indicators of reproductive efficiency of stallion

A eficiência reprodutiva obtida no rebanho é dependente da fertilidade de ambos os progenitores. Entretanto, tende-se a atribuir maior responsabilidade pelos baixos índices de fertilidade ao final da estação de monta à fêmea, negligenciando-se a avaliação do reprodutor frente a estes resultados. Contudo, deve-se conferir maior importância às variáveis relacionadas ao macho, as quais podem contribuir diretamente para a determinação de menores taxas de fertilidade. Dentre essas variáveis destaca-se a qualidade seminal, sendo primariamente avaliada pela motilidade e morfologia espermática. No entanto, atualmente empregam-se exa- mes mais minuciosos, como: identificação de fatores de crescimento no plasma seminal, razão colesterol/fosfolipídios na membrana espermática, integridade das membranas acrossomal, mitocondrial e espermática exigindo, desta maneira, um conhecimento mais abrangente, por parte do examinador, para que se possa ter um maior poder diagnóstico e preditivo da fertilidade do reprodutor a ser utilizado.(AU)

Reproductive efficiency in the herd depends on the fertility of both mates. However, we tend to blame low fertility at the end of the breeding season to the female, ne- glecting to assess the male facing these results. However, more emphasis should be given on variables related to the male which can contribute directly to the de- termination of lower fertility rate. Among these variables, sperm quality is pointed out, which is primarily evaluated by motility and morphology. However, nowadays more detailed examinations are employed, such as identification of growth factors in seminal plasma, cholesterol/phospholipids ratio in the sperm membrane, acroso- me, mitochondrial and sperm membrane integrity, requiring a more comprehensive knowledge on the part of the examiner, who may have a greater diagnostic and predictive power of the fertility of the breeder to be used.(AU)

Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros / Methods of the assessment of morphology and function of sperm: actual moment and future challenges

Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.(AU)

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.(AU)

Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros / Methods of the assessment of morphology and function of sperm: actual moment and future challenges

Com o propósito de obter resultados que demonstrem maior repetibilidade na avaliação da morfologia tanto quanto na função espermática, diversas técnicas laboratoriais tem sido desenvolvidas. Surgiram sistemas que utilizam a análise computadorizada de imagens, métodos de “coloração” empregando corantes fluorescentes (sondas fluorescentes) em microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, que aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides. Os autores descrevem experiências, por mais de uma década, com a utilização destas biotécnicas, fazendo uma análise crítica, bem como apontando os desafios futuros, inclusive na área de biologia molecular espermática.

In order to obtain results showing greater repeatability in morphology and sperm function assessment, several laboratorial techniques have been developed continuously. Systems that utilize computerized image analysis, staining methods using fluorescent dies (fluorescent probes) in epifluorescence microscopy or flow cytometry, that allowed a more judicious evaluation of sperm structure integrity arose. Authors describe experiences, over a decade, with the use of these biotechiques, critically analyzing and pointing out future challenges, including the field of sperm molecular biology.

EFEITOS DA CENTRIFUGAÇÃO EM COLOIDE DE CAMADA ÚNICA E DE DIFERENTES DILUENTES DE CONGELAMENTO SOBRE QUALIDADE DO SÊMEN EQUINO

Objetivou-se avaliar o efeito da centrifugação em coloide de camada única (AndroColl®-E; Minitub, Alemanha) e três diluentes de congelamento: diluente 1 (Botucrio®; Biotech, Botucatu, Brasil), diluente 2 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Alemanha + 3% glicerol) e diluente 3 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Alemanha + 3% DMSO), sobre a qualidade do sêmen equino. Utilizou-se 3 ejaculados de 5 garanhões (n=15). Após a colheita, o sêmen foi diluído com meio à base de leite desnatado (EquiPlus®, Minitub, Alemanha) e dividido em 2 grupos: grupo E (centrifugado sem coloide) e grupo A (centrifugado com coloide). No grupo E, o sêmen foi centrifugado à 676g por 15 minutos, no grupo A, o sêmen foi centrifugado à 314g por 20 minutos. Após a centrifugação, os grupos receberam os diferentes diluentes: diluente 1, diluente 2 e diluente 3. Logo após foram levadas ao congelamento em máquina programável portátil e armazenadas em botijões criogênicos. A cinética foi avaliada pelo CASA e a integridade das membranas plasmática e acrossomal, por associação de sondas fluorescentes submetidas ao Citômetro de Fluxo. Com relação aos parâmetros do CASA, pode-se observar que o grupo A1, centrifugado com o coloide, teve resultado superior nas variáveis LIN e WOB, comparadas com o grupo E1. Já as variáveis, RAP, VCL, VAP, ALH e BCF, tiveram resultados inferiores quando centrifugadas com o colóide, grupo A1 em relação ao grupo E1. Com relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, pode-se observar que os grupos A1 e A3, que foram centrifugados com o coloide, tiveram resultado superior aos grupos E1 e E3, que foram centrifugados sem o coloide. O uso do coloide melhorou integridade das membranas plasmática e acrossomal, provavelmente evitou o processo da hiperativação espermática e proporcionou menor produção de ROS. Maiores estudos in vivo serão necessários para comprovação desta técnica.

This study aimed to evaluate the effect of a colloid in single layer centrifugation (AndroColl®-E; Minitub, Germany) associated to three freezing extenders: extender 1 (Botucrio®; Biotech, Botucatu,, Brazil), extender 2 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Germany + 3% glycerol) and extender 3 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Germany + 3% DMSO) on equine semen quality. We used three ejaculates from five stallion (n=15), collected by artificial vagina. After collection, the semen was diluted with extender to from skimmed milk (EquiPlus®, Minitub, Germany) and divided into 2 groups: group E (centrifuged without colloid) and group A (centrifuged with colloid). No grupo E, o sêmen foi centrifugado à 676g por 15 minutos, no grupo A, o sêmen foi centrifugado à 314g por 20 minutos. Após a centrifugação, os grupos receberam os diferentes diluentes: diluente 1, diluente 2 e diluente 3. The kinetics was evaluated by CASA and the integrity of plasma and acrossomal membrane by association of fluorescent probes and subjected to flow cytometry. With respect to the CASA parameters, it can be seen that the A1 group, with the colloid centrifuged, had superior result in LIN and WOB variables, compared to the E1 group. The variables, RAP, VCL, VAP, ALH and BCF, had lower results when centrifuged with colloid, A1 group than in the group E1. With respect to the integrity of plasma and acrosomal membrane, it can be seen that A1 and A3 groups were centrifuged with colloid, they had superior result to E1 and E3 groups, which were centrifuged without the colloid. The use of colloid improved integrity of plasma and acrosomal membranes probably avoided the process of sperm hyperactivation and provided lower production of ROS. Greater in vivo studies are needed to prove this technique.

Relação da qualidade do sêmen com a fertilidade após IATF em vacas de corte

A criopreservação do sêmen resulta em danos à estrutura espermática, sendo nítida a importância da avaliação das partidas de sêmen antes de serem submetidas à inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Todavia, nem sempre as avaliações convencionais do sêmen são suficientes para identificar partidas que possam resultar em baixa taxa de prenhez no campo, sendo necessária uma investigação mais profunda e acurada. Neste sentido, este experimento foi realizado com o objetivo de identificar partidas de sêmen que apresentam falhas na fertilidade, mesmo sendo aprovadas pelas avaliações convencionais. Foram realizadas análises convencionais (motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática) de 72 partidas de sêmen de 22 touros antes da estação de monta. Destas, 55 partidas de 18 touros foram aprovadas para o uso na IATF, mas somente 28 partidas de 10 touros foram utilizadas. As partidas de sêmen utilizadas na IATF foram submetidas a outras avaliações: análise computadorizada da motilidade espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial (por sondas fluorescentes em microscopia de epifluorescência). Os dados foram analisados pelo Proc Mixed do SAS usando o Test T. As taxas de prenhez das diferentes partidas de sêmen variaram de 71 a 37%, sendo a média e desvio padrão das partidas de 55,57±7,57%. Os dados de fertilidade a campo permitiram a separação das partidas de sêmen como de Alta (>50% de prenhez) e Baixa (50% de prenhez) fertilidade, sendo comparadas quatro partidas de Alta e quatro de Baixa fertilidade. Os dados das características seminais de todas as partidas de sêmen foram submetidos à análise por boxplot e separados em quartis superior e inferior. Quando se comparou as partidas de Alta e Baixa fertilidade notou-se diferença na taxa de prenhez (p<0,01), mas não foi notada diferença para motilidade (p=0,91), vigor (p=0,63), concentração (p=0,27), número de espermatozoides por palheta (NEP, p=0,27), número de espermatozoides móveis e normais por palheta (p=0,18), defeitos maiores (p=0,17), defeitos totais (p=0,43), integridade de membrana plasmática (MPI, p=0,07), alto potencial de membrana mitocondrial (AP, p=0,94), motilidade total (MT, p=0,10), VCL (p=0,80), VSL (p=0,75), VAP (p=0,88), LIN (p=0,78), STR (p=0,71) e BCF (p=0,13). No entanto, foram encontradas diferenças entre os grupos (Alta e Baixa) para defeitos menores (p=0,05), espermatozoides com integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial (PIAIA)/Palheta (p=0,01), integridade de acrossomo (AI, p=0,03), motilidade progressiva (MP, p<0.01) e rápidos (p<0,01). Quando comparados os quartis superior e inferior das características seminais foram encontradas diferenças para concentração espermática (p<0,01), NEP (p<0,01), número de espermatozoides móveis por palheta (p<0,01), espermatozoides móveis e normais (p<0,01), defeitos maiores (p<0,01), defeitos menores (p=0,01), defeitos totais (p=0,05), MPI (p<0,01), AI (p<0,01), AP (p=0,03), PIAIA (p<0,01), PIAIA/palheta (p<0,01), mas esta divisão de grupos por quartis superior e inferior não apresentaram diferença sobre a fertilidade (p>0,05); sendo que somente. Entretanto, para MT (p<0,01) e MP (p<0,01) além da diferença entre os quartis foi notado efeito da fertilidade (MT, p=0,05 e MP, p=0,01), sendo maior para os de baixa fertilidade. Pode-se concluir que os padrões de qualidade de partidas de sêmen que apresentam fertilidade distinta podem ser semelhantes, além disso, que pode haver diferença na qualidade espermática entre as partidas que não influenciam a fertilidade. Desta forma, são necessárias outras análises mais acuradas para investigar as causas de falha na fertilidade de algumas partidas de sêmen.

Semen cryopreservation results in damage to sperm structure, and it is clear the importance of evaluating the semen batches before submitted it to timed artificial insemination (TAI). However, conventional semen evaluations are not always sufficient to identify batch that may result in reduced pregnancy rate in the field, requiring a more thorough and accurate investigation. Thus, this experiment was conducted in order to identify semen batches that have gaps in fertility, even being adopted by conventional assessments. Conventional analysis (motility, vigor, concentration and morphology) were performed of 72 semen batches from 22 bulls before the breeding season. Of these, 55 batches from 18 bulls were approved for use in TAI, but only 28 batches from 10 bulls were used. Semen batches used in TAI were subjected to further assessment: computer-assisted sperm analysis (CASA), integrity of plasma and acrosomal membranes and mitochondrial membrane potential (by fluorescent probes under epifluorescence microscopy). Data were analyzed by Proc Mixed of the SAS using Test "T". Pregnancy rates of different semen batches ranged 71-37%, and the mean and standard deviation of the batches was 55.57 ± 7.57%. Field fertility data allowed the separation of the semen batches as "High" (>50% pregnancy rate) and "Low" (50% pregnancy rate) fertility. It was compared four batches of "High" and four batches of "Low" fertility. Data of the seminal characteristics of all the semen batches were analyzed by boxplot and separated into upper and lower quartiles. When comparing the batches of "High" and "Low" fertility was noticed a difference in the pregnancy rate (p<0.01), but was not noticeable difference in motility (p=0.91), vigour (p=0.63), concentration (p=0.27), number of spermatozoa per straw (NEP, p=0.27), number of motile and normal sperm per straw (p=0.18), major defects (p=0.17), total defects (p=0.43) plasma membrane integrity (MPI, p=0.07), high mitochondrial membrane potential (AP, p=0.94), total motility (TM, p=0.10), VCL (p=0.80), VSL (p=0.75), VAP (p=0.88), LIN (p=0.78), STR (p=0.71) and BCF (p=0.13). However, differences were found between the groups ("High" and "Low") for minor defects (p=0.05), sperm with plasma and acrosomal membranes integrity and high mitochondrial membrane potential (PIAIA)/straw (p=0.01), acrosomal integrity (Al, p=0.03) progressive motility (PM, p <0.01) and rapid (p<0.01). When comparing the upper and lower quartiles of the seminal characteristics differences were found for sperm concentration (p <0.01), NEP (p <0.01), number of motile sperm per straw (p<0.01), motile and normal sperm (p<0.01), major defects (p<0.01), minor defects (p=0.01), total defects (p=0.05), MPI (p<0.01), AI (p<0.01), AP (p=0.03), PIAIA (p<0.01), PIAIA/straw (p<0.01), but this division groups by upper and lower quartiles showed no difference in fertility rate (p>0.05). However, to MT (p<0.01) and MP (p<0.01) the difference between quartiles of fertility effect was noted (MT, p=0.05 and MP, p=0.01), been higher for low fertility. It can be concluded that patterns of semen quality of batches that have distinct fertility may be similar, furthermore, there may be differences in sperm quality among batches that do not affect fertility. Thus, it takes other more accurate analysis to investigate the causes of failure on fertility of some semen batches.

Uso de sondas fluorescentes e do ensaio de ligação à membrana perivitelina de ovo de galinha (Gallus gallus) para a avaliação de espermatozóides frescos e descongelados de cão (Canis lupus familiares)

Análises seminais por meio da associação de sondas fluorescentes possibilitam a avaliação dos diversos compartimentos da célula espermática, simultaneamente, oferecendo um prognóstico mais acurado frente ao caráter subjetivo de alguns testes de rotina. Neste estudo foi utilizada a associação de três sondas fluorescentes com objetivo de avaliar a integridade da membrana plasmática (iodeto de propídio e Hoechst 33342) e o potencial de membrana mitocondrial (MitoTracker red), em sêmen fresco e descongelado de cão. Os resultados obtidos foram comparados aos resultados dos testes de rotina. Todos os testes demonstraram capacidade em detectar queda de qualidade seminal pós- descongelamento. A associação das sondas fluorescentes iodeto de propídio (IP), Hoechst 33342 (H33342) e MitoTracker red (CMXRos) mostrou-se eficaz na distinção de diferentes populações de espermatozoides em ejaculados descongelados de cão doméstico. Foram distintas 4 populações: IC (membrana plasmática íntegra e com potencial de membrana mitocondrial), IS (membrana plasmática íntegra e sem potencial de membrana mitocondrial), LC (membrana plasmática lesada e com potencial de membrana mitocondrial) e LS (membrana plasmática lesada e sem potencial de membrana mitocondrial). Esta associação permitiu também quantificar e qualificar as injúrias causadas às membranas plasmáticas das células espermáticas, pelo processo de congelamento/descongelamento, nesta espécie. Foi observada correlação (p<0,05) entre a coloração das sondas fluorescentes e a avaliação da motilidade espermática e teste hiposmótico. Desta forma, sugere-se a inclusão da combinação de sondas fluorescentes nos protocolos de análise de sêmen, como teste complementar aos vitestes convencionais, tornando mais precisa a avaliação das injúrias à célula espermática desta espécie. Entretanto, nem os testes de rotina e nem as sondas fluorescentes são hábeis em predizer a capacidade do espermatozoide de ligar-se ao ovócito, evento crucial para a fecundação. Assim, faz-se importante a adoção de testes de ligação entre espermatozoides e ovócitos nas pesquisas referentes à avaliação dos protocolos de congelamento/descongelamento do sêmen. Embora o status metabólico dos ovócitos, assim como o efeito fêmea, limitem a exatidão das interpretações, tem-se buscado substratos de ligação mais homogêneos e de mais fácil obtenção. Neste contexto, a membrana perivitelina do ovo de galinha (MPOG) tem se demonstrado eficiente na avaliação da capacidade de ligação do sêmen em diversas espécies. O teste de ligação de espermatozoides à MPOG apresenta comportamento semelhante aos resultados dos testes de rotina da avaliação do sêmen, assim como os testes com as sondas fluorescentes, apresentando diferença quando comparados sêmen fresco e sêmen descongelado (p<0,05). Neste estudo, o teste hiposmótico correlacionou-se positivamente com o número de espermatozoides ligados à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha. O comportamento da MPOG e das sondas, entre os tratamentos, demonstraram sensibilidade da membrana em distinguir sêmens de diferentes potenciais de ligação (p < 0,05) nesta espécie.

Seminal analysis by means of the association of fluorescent probes allows for the simultaneous evaluation of several compartments of the spermatic cell, offering a more accurate prognostic when compared to the subjective character of some routine tests. In this study, the association of three fluorescent probes was used with the goal of evaluating the integrity of plasma membrane (propidium iodide and Hoechst 33342) and mitochondrial membrane potential (Mito Tracker red), in dog semen, both fresh and frozen. The attained results were compared to those of routine tests. All tests showed the capacity of detecting a drop in seminal quality after being unfrozen. The association of the fluorescent probes propidium iodide (IP), Hoechst 33342 (H33342) and Mito Tracker red (CMXRos) showed efficiency when differentiating sperm populations in the frozen semen of domestic dogs. There were four distinct populations: IC (intact plasma membrane and with mitochondrial membrane potential), IS (intact plasma membrane without mitochondrial membrane potential), LC (injured plasmatic membrane with mitochondrial membrane potential) and LS (injured plasmatic membrane without mitochondrial potential). This association also allows the quantification and qualification of the injuries caused on the sperm cell by the freezing/thawing process in this species. A correlation was observed between the coloring of the fluorescent probe and the evaluation of sperm motility and hypo- osmotic swelling test (p<0,05). However, the attained results with the probes showed a higher precision rate when detecting injuries to the spam cells thus suggesting the inclusion of the combination of fluorescent probes in semen analysis protocols, once evidence shows greater efficiency when compared to routine tests. Consequently, the inclusion of the combination of the fluorescent viiiprobes in the semen analysis is suggested as a complementary test, making the evaluation of the injuries to the spermatic cell of this species more precise. However, neither the routine tests nor the fluorescent probes are capable of predicting spermatozoons capability to bind to the oocyte, an crucial event to fecundation. Therefore, it is important to introduce biding assays between spermatic cells and oocytes in the research that refer to the evaluation of the freezing/ thawing semen protocols. Although the oocytes metabolic status, like the female effect, limit the accuracy of the interpretations, substrate binding that are more homogeneous and easier to obtain are being pursued. In this context, the perivitelline layer of the egg yolk has demonstrated to be efficient in evaluating the binding capacity of sperm in a number of species. The binding tests of sperm to the MPOG shows a behavior that is similar to the results obtained from semens routine evaluation tests, as well as the test with the fluorescent probes, presenting a difference when comparing fresh with unfrozen semen (p<0,05). In this study, the hypoosmotic test correlated positively to the number of spermatozoon connected to the perivitelline layer of the egg yolk. The behavior the MPOGs and that of the probes, between other treatments, demonstrated the membranes sensibility in distinguishing semen of different potential binding (p<0,05) in this species.

Uso da melatonina e do ácido ferúlico como promotores da função do espermatozoide equino criopreservado

As espécies reativas de oxigênio podem ser responsáveis por causar danos às membranas dos espermatozoides, fragmentação de DNA, entre outros fatores, influenciando assim na fertilidade principalmente no processo de criopreservação do sêmen. A melatonina (MEL) é um potente antioxidante anfifílico (hidro e lipossolúvel), o que a torna capaz de penetrar qualquer compartimento celular. O ácido ferúlico (AF) é um composto fenólico que exibe uma ampla gama de efeitos terapêuticos contra diversas doenças devido à sua potente ação antioxidante. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos antioxidantes AF e MEL na criopreservação do sêmen equino. Foram utilizados 5 ejaculados de 4 garanhões. Dentre os tratamentos aplicados, foram utilizadas duas concentrações de cada antioxidante (AF 0,5mM, AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM) além do controle (diluidor de congelação convencional BotuCrio®), totalizando 5 tratamentos. As variáveis analisadas foram cinética espermática através do sistema CASA (programa SCA - Sperm Class Analyser), morfologia, integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, com o uso das sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox Deep Red® nunca anteriormente utilizada em espermatozoides equinos. Comparações entre os tratamentos foram realizadas pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3) e as diferenças entre eles foram localizadas através do teste de Duncan. A probabilidade de P0,05 foi considerada como diferença significativa. Os resultados para características da motilidade tiveram diferença significativa em alguns aspectos, porém nenhum tratamento foi superior ao controle. A avaliação da morfologia espermática apresentou uma diminuição nos defeitos maiores nas amostras tratadas com AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM. No que diz respeito às integridades de membrana, o tratamento MEL 1µM apresentou porcentagens significativamente melhores nas células inteiramente íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de membrana mitocondrial). As células em estresse oxidativo não se diferenciaram entre os tratamentos. Previamente a este trabalho, foi realizado outro experimento para a validação da sonda fluorescente CellRox Deep Red® em espermatozoides de equinos. Foram utilizados 4 ejaculados de 4 garanhões aos quais eram submetidos aos tratamentos T0 (fração do ejaculado não submetida à indução do estresse oxidativo), T50 (50% da amostra não induzida e 50% induzida ao estresse oxidativo) e T100 (amostra induzida ao estresse oxidativo). Os dados de porcentagem de células positivas (com estresse oxidativo) foram submetidos à análise de regressão polinomial pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3). O valor do coeficiente de determinação (R2) foi igual a 0,88 e a probabilidade de P0,05 foi considerada significativa. Diante dos dois trabalhos citados acima e baseados nas análises realizadas, pode-se concluir que o tratamento MEL 1µM melhora a integridade de membranas espermáticas no processo de criopreservação do sêmen equino e que a sonda fluorescente CellRox Deep Red® é eficiente na detecção de espécies reativas de oxigênio no espermatozoide de garanhões.

Reactive oxygen species can be responsible for causing damage to the membranes of sperm, DNA fragmentation, among other factors influencing fertility especially in cryopreservation. Melatonin (MEL) is a potent antioxidant amphiphilic (hydro and fat soluble), which makes it able to penetrate any cell compartment. The ferulic acid (FA) is a phenolic compound that exhibits a wide range of therapeutic effects against various diseases due to their potent antioxidant effect. This study aimed to evaluate the effect of antioxidants AF and MEL in cryopreservation of equine semen. Five ejaculates from four stallions were used. Among the treatments, we used two concentrations of each antioxidant (AF 0.5mM, AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1M) beyond the control (conventional freezing extender BotuCrio®), totaling five treatments. The parameters analyzed were sperm kinetics with the CASA system (SCA program - Sperm Class Analyzer), morphology, plasma and acrossomal membrane integrity mitochondrial membrane potential, using fluorescent probes PI, Hoechst 33342, FITC-PSA and JC- 1 over production of reactive oxygen species (ROS) by the sperm with the fluorescent probe CellRox Deep Red® never previously used in equine spermatozoa. Comparisons between treatments were performed by generalized linear model (PROC GLM) of SAS (version 9.3) and the differences between them were located with the Duncan test. The probability of P0.05 was considered significant. The results for the motility characteristics were significant differences in some aspects, but no treatment was superior to the control. The evaluation of sperm morphology showed a decrease in major defects in the samples treated with AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1M. Regarding to membrane integrity, treatment MEL 1M showed significantly better in percentages of intact cells (intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential). Cells with oxidative stress not differ between treatments. Previously to this study, we performed another experiment to validate the fluorescent probe CellRox Deep Red® in equine sperm. Was used ejaculates of 4 stallion which were subjected to the treatments T0 (fraction of the ejaculate not subjected to induction of oxidative stress), T50 (50% sample uninduced and 50% induced to oxidative stress) and T100 (sample induced to oxidative stress). The data of percentage of positive cells (with oxidative stress) were submitted to polynomial regression analysis based on generalized linear model (GLM PROC) of SAS (version 9.3). The value of the coefficient of determination (R2) was 0.88 and a probability of P0.05 was considered significant. Considering the two studies cited above, and based on the analyzes, it is possible to conclude that the treatment MEL 1M improves sperm membrane integrity in the equine sperm cryopreservation process and the fluorescent probe CellRox Deep Red® is efficient in the detection of reactive oxygen species in stallions sperm.

Efeitos de diferentes diluidores sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante a refrigeração de sêmen equino / Effects of different extenders on sperm kinetic, membranes, morphology, and chromatin during equine semen cooling

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. [...] Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG.

To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. [...] It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

Efeitos de diferentes diluidores sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante a refrigeração de sêmen equino / Effects of different extenders on sperm kinetic, membranes, morphology, and chromatin during equine semen cooling

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. [...] Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. (AU)

To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. [...] It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender. (AU)