Detecção molecular de Ranavirus em espécies de anfíbios anuros selvagens da região centro-leste do estado de São Paulo

O objetivo do trabalho foi realizar investigação sobre ocorrência de ranavirose, infecção causada por vírus do gênero Ranavirus, família Iridoviridiae, em anfíbios anuros silvestres nos municípios de Porto Ferreira e Pirassununga, cidades da região centro-leste do estado de São Paulo, Brasil, utilizando diagnóstico molecular. Ao todo, 40 anuros adultos silvestres da espécie Leptodactylus fuscus foram capturados nos municípios citados, sendo coletados três órgãos alvos (fígado, baço e rins) de replicação viral, com registro de eventuais alterações macroscópicas nesses órgãos, e dos quais extraiu-se DNA. Na sequencia, fez-se a reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando-se primers específicos para o gene MCP (major capsid protein) de Frog Virus 3 (FV3), ranavírus circulante no Brasil, com isolado de FV3 pertencente ao biobanco do Laboratório de Higiene Zootécnica da FZEA-USP empregado como controle positivo e água livre de nuclease como controle negativo. Como resultados, em relação às alterações macroscópicas, somente um espécime apresentou hepatoesplenomegalia e hipopigmentação do coração. No entanto, ao diagnóstico molecular, nenhum dos 40 animais amostrados foi positivo à ranavirose. Tal resultado pode estar associado tanto a fatores intrínsecos (espécie, idade, resposta imune) como extrínsecos ao hospedeiro (alterações ambientais, patogenicidade viral). Em paralelo, em rãs de criação comercial, surtos por FV3 já foram detectados em vários ranários do país; contudo, essa é a primeira vez que uma prospecção para ranavirose é realizada especificamente com representantes da espécie Leptodactylus fuscus, em municípios da região centro-leste do estado de São Paulo. Assim, são necessárias mais pesquisas com espécies silvestres de rãs, particularmente no entorno de ranários com histórico de animais positivos para FV3, para melhor conhecimento da epidemiologia e dinâmica de transmissão da ranavirose entre rãs silvestres.

The objective of this study was to investigate the occurrence of ranavirus infection caused by virus belonging to genus Ranavirus, Iridoviridiae family, in wild anuran amphibians from Porto Ferreira and Pirassununga municipalities, located in the central-eastern region of the state of São Paulo, Brazil, using molecular diagnostics. In all, 40 wild adult anurans of the species Leptodactylus fuscus were captured in the mentioned municipalities, and three target organs (liver, spleen and kidneys) of the viral replication were collected, being possible macroscopic changes in these organs recorded, and from which DNA was extracted. In the sequence, the polymerase chain reaction (PCR) was carried out using primers specific for the MCP (major capsid protein) gene of Frog Virus 3 (FV3), a circulating ranavirus in Brazil, with a FV3 isolate belonging to the biobank of the Laboratory of Zootechnical Hygiene of FZEA-USP employed as positive control and nuclease-free water as negative control. As a result, in relation to macroscopic alterations, only one specimen showed hepatosplenomegaly and heart hypopigmentation. However, for molecular diagnostics, none of the 40 animals sampled were positive for ranavirus. This result may be associated to both intrinsic (species, age, immune response) and extrinsic (environmental changes, viral pathogenicity) factors to the host. In parallel, FV3 outbreaks have already been detected in several frog farms in the country. However, this is the first time that a prospection for ranavirus infection is performed specifically with specimens of the Leptodactylus fuscus from municipalities in the central-eastern region of the state of São Paulo. Thus, more studies on wild-type frogs are needed, particularly in the settings of frog farms with positive animal history for FV3, to better understand the epidemiology and dynamics of ranavirus transmission among wild frogs.

Utilização da rã-touro americana (Lithobates catesbeianus) como modelo experimental para infecção por ranavírus

Os anfíbios figuram entre um dos grupos mais diversos e de importância ecológica para o meio em que habitam porém, a redução da diversidade em nível global e a ameaça de extinção de diversas espécies os trouxe a mais uma preocupante posição de destaque. Nas últimas décadas, diversos fatores foram listados como os possíveis agentes para o declínio, em especial as causas de origem antrópica, porém as doenças emergentes, como a quitridiomicose e a ranavirose, se mostraram fortes pressões negativas a esta comunidade. A ranavirose é o termo dado a doença provocada pelos vírus do gênero ranavírus, em especial a espécie Frog virus 3 (FV3) que é a mais estudada. Sua pluralidade de hospedeiros ectotérmicos (peixes, répteis e anfíbios), distribuição geográfica abrangente e altas taxas de infectividade e letalidade tornaram a doença de notificação obrigatória por órgãos reguladores nacionais e internacionais. No país ainda existe uma incipiência de estudos a qual dificulta estimar qual a real situação de disseminação viral. Apesar de reportes de casos no país desde 2003 a única espécie atualmente afetada é a Lithobates castebeianus, popularmente conhecida como rã-touro Americana. Em nosso estudo a utilizamos como um modelo experimental para avaliar o processo de infecção que acomete os animais e tentar compreender sua evolução clínica. Para isso utilizamos um controle negativo, sem a presença viral, e três tratamentos com diferentes concentrações virais (T1: 1,9 x 10¹ p.f.u./0,05mL; T2: 1,9x 103 p.f.u/0,05mL e T3:3,1 x 105 p.f.u/0,05mL). Durante 21 dias os animais foram observados buscando manifestação de sinais clínicos. Análises moleculares de PCR convencional e Tempo-Real foram utilizadas para confirmar e quantificar a presença viral nos animais infectados, assim como análises histológicas buscaram correlacionar e avaliar as lesões observadas . Neste estudo demonstramos a suscetibilidade da rã-touro pode como um modelo apropriado para esta patologia, em especial quando relacionada a aquicultura.

Amphibians are among one of the most diverse and ecologically important groups in the environment they inhabit, but the reduction of diversity on a global level and the threat of extinction of several species has brought them to another worrying position. In recent decades, several factors were listed as potential agents for the decline, especially the causes of anthropogenic origin, but emerging diseases such as chytridmicosis and ranavirose, have shown strong negative contributions to this community. Ranavirose is the term given to the disease caused by viruses of the genus ranavirus, especially the Frog virus 3 (FV3) species that is the most studied. His plurality of ectothermic hosts (fish, reptiles and amphibians), wide geographic distribution and high rates of infectivity and lethality made a notifiable disease required by national and international regulatory bodies. In the country there is still incipient studies which makes it difficult to estimate what the actual viral spread situation. Although case reports in the country since 2003 the only species currently affected is Lithobates castebeianus, popularly known as the American bullfrog. In our study we used it as an experimental model to evaluate the infection process that affects the animals and try to understand their clinical evolution. For this we used a negative control, without viral presence, and three treatments with different viral concentrations (T1: 1,9 x 10¹ p.f.u./0,05mL; T2: 1,9x 103 p.f.u/0,05mL e T3:3,1 x 105 p.f.u/0,05mL). For 21 days the animals were observed seeking manifestation of clinical signs. Molecular analyzes of conventional and real-time PCR were used to confirm and quanitify viral presence on infected animals, as well as correlate the histological tissue damage were observed. In this study we show whether bullfrog can be used as an appropriate model for this pathology, especially when related to aquaculture