Effects of BMP-4 and FSH on growth, morphology and mRNA expression of oocyte-secreted factors in cultured bovine secondary follicles

This study evaluated the effect of different concentrations of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), as well as the interaction of BMP-4 and follicle stimulating hormone (FSH) on growth, ultrastructural integrity, and expression of mRNA for growth differentiation factor-9 (GDF-9), BMP-15, maternal antigen that the embryo requires (Mater) and nucleoplasmin-2 (Npm-2) in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Follicles cultured in the presence of 50 ng/ml BMP-4 had a progressive increase in their diameters with the increase of culture period from 0 to 6 and 12 days, but no significant differences were observed among treatments. The presence of both FSH and BMP-4 in a culture medium did not stimulate follicle growth when compared to the control medium. After 12 days, the percentage of normal follicles was maintained similar to that of day 0 in the medium supplemented with both FSH and BMP-4, but no significant differences among treatments were observed after 18 days of culture. BMP-4 maintained the ultrastructural integrity of follicles after 18 days of culture, while follicles cultured in medium supplemented with FSH or both BMP-4 and FSH had oocyte with irregular zona pellucida, vesicular bodies, and an abundance of vacuoles. Follicles cultured in the presence of BMP-4 had an increase in the levels of BMP-15 mRNA, when compared to those cultured in medium supplemented with FSH alone. In conclusion, the addition of BMP-4 in culture medium contributes to preserve follicular ultrastructure, but BMP-4 did not interact positively with FSH. Regarding secondary follicles cultured in the presence of FSH, BMP-4 increases the expression of mRNA for BMP-15.(AU)

Effects of BMP-4 and FSH on growth, morphology and mRNA expression of oocyte-secreted factors in cultured bovine secondary follicles

This study evaluated the effect of different concentrations of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), as well as the interaction of BMP-4 and follicle stimulating hormone (FSH) on growth, ultrastructural integrity, and expression of mRNA for growth differentiation factor-9 (GDF-9), BMP-15, maternal antigen that the embryo requires (Mater) and nucleoplasmin-2 (Npm-2) in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Follicles cultured in the presence of 50 ng/ml BMP-4 had a progressive increase in their diameters with the increase of culture period from 0 to 6 and 12 days, but no significant differences were observed among treatments. The presence of both FSH and BMP-4 in a culture medium did not stimulate follicle growth when compared to the control medium. After 12 days, the percentage of normal follicles was maintained similar to that of day 0 in the medium supplemented with both FSH and BMP-4, but no significant differences among treatments were observed after 18 days of culture. BMP-4 maintained the ultrastructural integrity of follicles after 18 days of culture, while follicles cultured in medium supplemented with FSH or both BMP-4 and FSH had oocyte with irregular zona pellucida, vesicular bodies, and an abundance of vacuoles. Follicles cultured in the presence of BMP-4 had an increase in the levels of BMP-15 mRNA, when compared to those cultured in medium supplemented with FSH alone. In conclusion, the addition of BMP-4 in culture medium contributes to preserve follicular ultrastructure, but BMP-4 did not interact positively with FSH. Regarding secondary follicles cultured in the presence of FSH, BMP-4 increases the expression of mRNA for BMP-15.

INFLUÊNCIA DA ORIGEM E DA CONCENTRAÇÃO DE FSH SOBRE O CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS OVARIANOS ISOLADOS NA ESPÉCIE CAPRINA

Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar uma curva concentração-resposta do FSH recombinante humano (hrFSH) no cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FOPA) e antrais precoces (FOA) isolados caprinos (Fase 1); 2) comparar três diferentes origens de FSH (hipofisário porcino e recombinantes bovino e humano) durante o cultivo in vitro de FOPA e FOA caprinos isolados (Fase 2); 3) investigar se a extensão do período de cultivo, juntamente com mudanças dinâmicas na composição do meio de cultivo para cada estádio folicular, poderia melhorar a eficiência do sistema de cultivo in vitro para FOPA caprinos a taxas equivalentes aos FOA (Fase 3). Na fase 1, folículos isolados foram cultivados por 18 dias nos seguintes tratamentos: meio básico de cultivo (controle); ou meio controle suplementado com 10, 50 ou 100 mUI/mL de rhFSH. Na fase 2, FOPA e FOA foram cultivados por 18 dias e os tratamentos foram: meio base suplementado sem FSH (controle), 10, 50, ou 100 mUI/mL de pFSH (pFSH10, pFSH50 e pFSH100, respectivamente), 100 ng/mL de rbFSH (rbFSH) e 50 mUI/mL de rhFSH (rhFSH). Na fase 3, foram utilizados meios específicos para o cultivo in vitro de FOPA e FOA durante 24 ou 18 dias, respectivamente. A composição do meio de cultivo foi fixa (FOPA e FOA) ou dinâmica (FOPA). Os FOPA foram cultivados em meio fixo com alta concentração de insulina ou em meio dinâmico (insulina alta nos primeiros 6 dias, seguida de baixa insulina + GH até o final do período de cultivo) com ou sem GDF-9. Foram avaliadas a morfologia folicular, a formação de antro, a taxa de crescimento e a produção de estradiol, a viabilidade oocitária e a configuração da cromatina, bem como a expressão gênica relativa do mRNA da parede folicular, nas três fases. Na fase 1, nos FOA, a adição de FSH50 aumentou o diâmetro folicular e a taxa de crescimento, o percentual de oócitos totalmente crescidos e o diâmetro oocitário (P < 0,05) e tendeu a aumentar o percentual de oócitos em MII quando comparados ao controle (P = 0,07). Na fase 2, os tratamentos contendo pFSH apresentaram um percentual menor de folículos intactos e produção de estradiol e maior taxa de extrusão (P < 0,05). Para FOPA, a adição de pFSH10, pFSH100 e rhFSH diminuiu (P < 0,05) a retomada meiótica de oócitos em comparação aos tratamentos controle e rbFSH. Nos folículos antrais, rhFSH e pFSH10 aumentaram (P < 0,05, P = 0,08) a maturação oocitária. Em conclusão, a fonte de FSH afetou diferentemente a expressão gênica e a dinâmica folicular dos folículos pré-antrais e antrais in vitro. Na fase 3, o sistema de cultivo (fixo vs dinâmico) afetou diferentemente o resultado de todos os parâmetros avaliados, ou seja, morfologia e crescimento folicular, produção de estradiol, expressão gênica e maturação oocitária. Dependendo do sistema de cultivo, FOPA e FOA apresentaram taxas de crescimento e de maturação oocitária semelhantes quando cultivados in vitro sob as mesmas condições experimentais.

The aims of this study were: 1) investigate a concentration-response curve of human recombinant FSH (rhFSH) for in vitro culture of isolated caprine preantral and early antral follicles. (Phase 1); 2) compare three different sources of FSH (recombinant bovine, recombinant human, and porcine pituitary) during the in vitro culture of isolated caprine preantral and early antral follicles under the same experimental conditions (Phase 2); 3) investigate whether the extension of the culture period together with dynamic changes in the culture medium composition for each follicular stage could improve the efficiency of the in vitro culture system for late caprine preantral follicles (LPF) to rates equivalent to early antral follicles (EAF) (Phase 3). In phase 1, isolated follicles were cultured for 18 days in the following treatments: basic culture medium (control); or control medium supplemented with 10, 50, and 100 mIU/mL of hrFSH.In phase 2, preantral and early antral follicles were cultured for 18 days and the treatments were: base medium supplemented with no FSH (control), 10, 50, or 100 mIU/mL pFSH (pFSH10, pFSH50, and pFSH100, respectively), 100 ng/mL rbFSH (rbFSH), and 50 mIU/mL rhFSH (rhFSH). In phase 3, specific media were used for the in vitro culture of LPF and EAF during 24 or 18 days, respectively. Culture medium composition was either fixed (LPF and EAF) or dynamic (LPF). LPF were cultured either in a fixed medium with high insulin concentration, or in a dynamic medium (high insulin in the first 6 days followed by low insulin + GH until the end of the culture period) with or without GDF-9. EAF were cultured in a fixed medium containing low insulin, GH, and with or without GDF-9. Follicle morphology, antrum formation, growth rate, and estradiol production, and oocyte viability and chromatin configuration, and follicle wall mRNA relative gene expression were evaluated in the three phases. In phase 1, in antral follicles, the FSH addition at 50 mIU/mL increased follicular diameter and growth rate, the percentage of fully grown oocytes, and oocyte diameter (P < 0.05), and tended to increase the percentage of MII oocytes when compared to the control (P = 0.07). For preantral follicles, the addition of pFSH10, pFSH100, and rhFSH decreased (P < 0.05) oocyte meiotic resumption compared to control and rbFSH treatments. For antral follicles, rhFSH and pFSH10 increased (P = 0.08 P < 0.05) oocyte maturation. In conclusion, the source of FSH differently affected gene expression and follicular dynamics of preantral and antral follicles in vitro. In phase 3, the culture system (fixed vs. dynamic) differently affected the outcome of all parameters evaluated, i.e., follicle morphology and growth, estradiol production, gene expression, and oocyte maturation. Depending on the culture system, LPF and EAF had similar growth rates and oocyte maturation rates when cultured in vitro under the same experimental conditions.

PUBERDADE E MATURIDADE SEXUAL DE OVINOS PORTADORES DA GENÉTICA FecGE

Identificada a partir de ovelhas Santa Inês com histórico de partos múltiplos, a mutação FecGE do gene do fator de crescimento e diferenciação -9 (GDF-9), provoca um incremento na taxa de ovulação e na prolificidade. Contudo, associações do GDF-9 com a fisiologia reprodutiva dos machos não estão totalmente elucidadas e não existem estudos que relacionam este gene e tão pouco a FecGE com o desenvolvimento reprodutivo de ovinos, que controlado por mecanismos hormonais e influenciado por fatores genéticos, sofre interferência de fatores ambientais e nutricionais. A caracterização da puberdade e maturidade sexual de carneiros FecGE, além de contribuir para o conhecimento dos efeitos desta mutação sobre a fisiologia reprodutiva e desenvolvimento sexual masculino, poderá habilitar o uso destes animais na seleção e melhoramento genético de ovinos. Objetivou-se neste trabalho estudar e avaliar os efeitos da mutação FecGE sobre a fisiologia reprodutiva de cordeiros Santa Inês com foco no seu desenvolvimento sexual. Foram utilizados 36 cordeiros genotipados para a FecGE e distribuídos de acordo com seu genótipo: homozigoto não mutante e, heterozigoto e homozigoto mutantes. A cada 15 dias durante 11 meses, os cordeiros foram avaliados andrologicamente (circunferência escrotal; volume seminal; concentração, motilidade e viabilidade espermáticas e; vigor e defeitos espermáticos maiores, menores e totais) para verificar a influência da mutação sobre a fisiologia e a idade à puberdade e à maturidade sexual. Os dados foram avaliados através da análise de covariância com medidas repetidas no tempo, considerando o peso ao nascimento como covariável. Não foram observadas diferenças entre os genótipos. A mutação FecGE não influenciou os parâmetros ao longo do período experimental e as idades à puberdade (187,87 ± 6,54 dias) e à maturidade sexual (230,31 ± 9,87dias). Este trabalho permitiu que fosse verificado pela primeira vez os efeitos da FecGE sobre a fisiologia reprodutiva dos machos concluindo-se que esta mutação não tem influência sobre os parâmetros andrológicos, seminais e espermáticos assim como sobre as idades à puberdade e à maturidade sexual de cordeiros Santa Inês que podem ser utilizados como reprodutores disseminadores desta genética prolifica.

Identified on Santa Ines sheep breed with history of multiple parturitions, the mutation FecGE of the growth and diferentiation factor -9 gene (GDF-9), causes an increase in the ovulation rate and in prolificacy. Although, associations of GDF-9 with the reproductive physiology of males are not totally clarified and there are no studies which relate this gene and neither FecGE with the reproductive development of sheep, controled by hormonal mechanisms, influenced by genetic factores and that suffers interference from environmental and nutritional factors. The sexual puberty and maturity characterization of FecGE lambs, besides contribuing for the knowlodge of this mutation effects over reprodcutive physiology and male sexual development, may enable the usage of this animals on the selection and genetic improvement of sheep. The main objective of this work was to study and measure the effects of the FecGE mutation on the reproductive physiology of Santa Ines lambs, focusing on its sexual development. Thirty-six lambs genotyped for FecGE were used and distributed according to their genotype: homozygous non mutante and, heterozygous and homozygous mutants. Every 15 days through 11 months, the lambs were evaluated andrologically (scrotal circumference; seminal volume; sperm concentration, motility and viability; spermatic vigor and sperm with major, minor and total defects) to verify the influence of this mutation over physiology and puberty and sexual maturity ages. The data were submitted to covariance analysis with measures repeated in time, considering the birth weigh as covariable. Differences between the genotypes were not observed in this study. The FecGE mutation did not influence the parameters over the experimental period and over the puberty (187,87 ± 6,54 days) and the sexual maturity (230,31 ± 9,87 days) ages. This work allowed to be verified for the first time the effects of FecGE on the males reproductive physiology , concluding that this mutations does not have influence on andrological, seminal and spermatic parameters and neither on puberty and sexual maturity ages of Santa Inês lambs, whom can be used as breeding disseminators of this prolific genetics.

CULTIVO IN SITU DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS OVINOS EM MEIO CONTENDO FATOR DE CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO-9 E FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL

O objetivo desta pesquisa foi estudar os efeitos da suplementação do meio com fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9) e fator de crescimento epidermal (EGF) e suas associações com FSH, durante cultivo in situ de folículos pré-antrais ovinos, visando avaliar o crescimento, morfologia e viabilidade dos folículos; quantificar o percentual de folículos préantrais em apoptose; avaliar a expressão de genes relacionados à apoptose (BAX, Bcl2, Caspase 3 e 9) e receptor de GDF-9 (BMPR-II) de EGF (EGFR), além de testar a via de ação do EGF usando inibidor da via MAPK (PD98059). Em todos os experimentos foram utilizados fragmentos de cortex ovariano para o cultivo in situ de folículos ovarianos ovinos por oito dias. Os folículos foram classificados em primordiais ou em desenvolvimento, normais e anormais e positivos ou negativos para apoptose (teste de TUNEL). Foram testadas a concentrações de 10, 25, 50, 75 e 100 ng/mL de GDF-9 e de EGF. Foi encontrado que 25ng/mL de GDF-9 foi a menor concentração capaz de desencadear ativação e manutenção da morfologia dos folículos pré-antrais, e que a adição de FSH (50 ng/mL) ao cultivo com GDF- 9 não auxiliou no crescimento folicular, mas foi capaz de aumentar a expressão de BMPR-II, como também contribuir com a proteção contra apoptose, com a diminuição da expressão da caspase 3. Além disso foi evidenciado que a concentração de EGF (50 ng/mL) foi a melhor em promover a ativação, crescimento, além de manter a morfologia folicular, e que a presença do FSH no cultivo foi benéfico a sobrevivência dos folículos. O EGF (50 ng/mL) foi capaz de aumentar a expressão do seu receptor (EGFR) e suprimir a expressão da Bax e Caspase 3, assim como elevar a expressão de Bcl2 mostrando um potencial inibitório da apoptose. Não foi observada diferença na ação do EGF quando foi adicionado inibidor de MAPK no sistema de cultivo. Conclui-se que tanto GDF-9 como EGF associados ao FSH tem ação protetora contra apoptose nos folículos, cultivados in situ por 8 dias. Também foi possível verificar que o EGF não atua pela via de ativação MAPK.

The goal of this research was study the effects of supplementation with the growth differentiation-9 factor (GDF-9), epidermal growth factor (EGF) and their associations with FSH, during in situ culture of sheep preantral follicles, aiming evaluate the growth, morphology and viability, quantify the percentual of preantral follicles in apoptosis; evaluate the genes expression corelated to apoptosis (BAX, Bcl2, Caspase 3 e 9) and GDF-9 (BMPRII) and EGF (EGFR) receptors. Also was tested the activation of EGF pathway using the inhibitor of MAPK (PD98059) way. In all experiments, fragments of sheep ovarian cortex were utilized to in situ culture during eight days. The follicles was classificated as primordial or in development, normal and abnormal, and positive or negative to apoptosis (TUNEL test). The concentrations of 10, 25, 50, 75 e 100 ng/mL of GDF-9 and EGF were tested. It was founded that 25 ng/mL of GDF-9 was the short concentration capable to initiate activation of preantral follicles based on morphology, and FSH (50 ng/mL) addition to GDF-9 culture do not assist the follicle growth, but was capable to increase the expression of BMPR-II, and contributed to the protection of apoptosis, by the decreased expression of Caspase 3. Besides it was evident that the concentration of EGF (50 ng/mL) was the best to promote the activation, growth, beyond to keep the follicles morphology. FSH (50 ng/mL) addition to the EGF culture was beneficial to the follicles survive. The EGF (50 ng/mL) was capable to increase the expression of its receptor (EGFR), to suppress the Bax and Caspase 3 expression, and to increase the Bcl2 expression, showing a potential inhibitory effect to apoptosis. The MAPK inhibitor didn´t have any influence on the EGF action. It was concluded that GDF-9 and EGF associated to FSH have a protection action against follicle apoptosis in situ culture per eight days. In addition, it was verified that EGF do not act through the MAPK activation pathway.

Características de crescimento pré e pós-desmame em ovinos santa inês: componentes de (co)variância, parâmetros genéticos e associação com o gene FecGe

Objetivou-se neste trabalho, estimar parâmetros genéticos e fenotípicos relacionados à prolificidade, características de peso e crescimento pré- e pós-desmame, assim como determinar a influência fenotípica e genética do polimorfismo FecGE sobre estas em ovinos Santa Inês. Informações fenotípicas desde o ano 1991 até 2015, incluindo 7736 animais, 3715 machos e 4021 fêmeas, dos quais 6550 possuem pedigree completo e 781 indivíduos considerados rebanho base. As características analisadas incluíram, prolificidade (P) da ovelha, peso ao nascimento (PN), 60 (P60), desmame (PD), 180 (P180) e 365 (P365), e o ganho de peso médio diário do nascimento até o desmame (GPD), 180 (GP180) e 365 (GP365) dias de idade. As herdabilidades aditivas diretas e maternas foram 0,120±0,026 e 0,082±0,031 para P; 0,253±0,030 e 0,228±0,022 para PN; 0,077±0,046 e 0,017±0,023 para P60; 0,130±0,064 e 0,048±0,036 para PD; 0,096±0,042 e 0,215±0,032 para GPD; 0,395±0,106 e 0,116±0,040 para P180; 0,210±0,037 e 0,033±0,018 para GP180; 0,487±0,050 e 0,162±0,071 para P365 e 0,098±0,044 e 0,019±0,050 para GP365. A fração da variância fenotípica devido ao ambiente permanente materno foi 0,271±0,026; 0,077±0,053 e 0,030±0,062 para P, PD e GP365, respectivamente. A correlação genética entre os efeitos genético aditivo direto e materno variou de -0,853±0,887 até 1,000±0,040 para todas as características. As correlações genéticas entre P e as de crescimento e peso foram negativas com P60 (-0,999), GPD (-0,999), P180 (-0,999 ) e P365 (-0,877), enquanto as positivas foram PxPN (0,071), PxPD (0,071), PxGP180 (0,286) e PxGP365 (0,045). As correlações genéticas de alta magnitude foram PNxPD (0,622); P60xPD (0,855); P60xP180 (0,600); P60xGP180 (0,808); PDxP180 (0,927); PDxGPD (0,959); P180xGP180 (0,993), P180xGP180 (0,834), P365xGP180 (0,799); P365xGP365 (0.981), GPDxGP365 (0.539) e GP180xGP365 (0.858). No entanto, correlações genéticas de baixa a moderada magnitude foram encontradas entre o restante das características; assim como negativas para PNxGP365 (-0.111) e PDxGP365 (-0.132). Considerando a variação fenotípica das caraterísticas sob estudo, o genótipo maternal FecGE influenciou (p<0,05) P, PD, GPD, GP180 e GP365; enquanto o genótipo FecGE do cordeiro influenciou (p<0,05) PD, GPD, P365 e GP365. O alelo FecGE materno demonstrou efeito aditivo (p<0,05) sobre todas as características de peso pré-desmame, P180, P365 e GP365; e dominante sobre GP180. Entretanto o FecGE do cordeiro, efeito aditivo (p<0,05) sobre PN, PD e GP180, e dominante sobre GP365. Considera-se a informação dos genótipos FecGE como critério de seleção para incrementar a acurácia de estimativas dos parâmetros genéticos no melhoramento de características de importância econômica, sendo sua ação genética direta sobre a prolificidade e oferecendo um ambiente materno apropriado para o crescimento dos cordeiros independente do genótipo deles. Os resultados obtidos demonstram que pela herdabilidade aditiva direta e correlações genéticas, as características estudadas e o alelo FecGE do gene GDF9 podem ser utilizados como critérios de seleção em esquemas de melhoramento da raça Santa Inês.

This research aimed to estimate genetic and phenotypic parameters related to prolificity, and pre and post weaning growth and weight traits, as well as to determine the phenotypic and genetic influence of FecGE polymorphism on these traits, in Santa Inês sheep. Phenotypic information from 1991 to 2015, including 7736 animals, 3715 rams and 4021 dams, of which 6550 have complete pedigree and 781 individuals considered herd base. The analyzed traits included prolificity (P), weight at birth (BW), 60 (W60), weaning (WW), 180 (W180) and 365 (W365), and mean daily weight gain from birth to Weaning (ADG), 180 (ADG180) and 365 (ADG365) days of age. The direct additive and maternal heritabilities were 0.120±0.026 and 0.082±0.031 for P; 0.253±0.030 and 0.228±0.022 for PN; 0.077±0.046 and 0.017±0.023 for P60; 0.130±0.064 and 0.048±0.036 for PD; 0.096±0.042 and 0.215±0.032 for GPD; 0.395±0.106 and 0.116±0.040 for P180; 0.210±0.037 and 0.033±0.018 for GP180; 0.487±0.050 and 0.162±0.071 for P365 and 0.098±0.044 and 0.019±0.050 for GP365. The fraction of the phenotypic variance due to the permanent maternal environment was 0.271±0.026; 0.077±0.053 and 0.030±0.062 for P, WW and ADG365, respectively. The genetic correlation between genetic additive and maternal effects ranged from -0.853±0.887 to 1.000±0.040 over all traits. Genetic correlations between P and growth and weight traits were negative with W60 (-0.999), ADG (-0.999), W180 (-0.999) and W365 (-0.877), while the positive were PxBW (0.071), PxWW (0.071), PxADG180 (0.286) and PxADG365 (0.045). The genetic correlations of high magnitude were BWxWW (0.622); W60xWW (0.855); W60xW180 (0.600); W60xADG180 (0.808); WWxW180 (0.927); WWxADG (0.959); W180xADG180 (0.993), W180xADG180 (0.834), W365xADG180 (0.799); W365xADG365 (0.981), ADGxADG365 (0.539) and ADG180xADG365 (0.858). However, low to moderate magnitude genetic correlations were found among the rest of the characteristics; as well as negative for PNxGP365 (-0.111) and PDxGP365 (-0.132). Considering the phenotypic variation of the studied traits, maternal FecGE genotype influenced (p<0.05) P, WW, ADG, ADG180 and ADG365; while lamb FecGE genotype influenced (p<0.05) WW, ADG, W365 and ADG365. Maternal FecGE allele showed an additive effect (p <0.05) on all preweaning weight characteristics, W180, W365 and ADG365; and dominant over ADG180. However the lamb's FecGE, additive effect (p<0.05) on BW, WW and ADG180, and dominant on ADG365. Hence, FecGE genotype information must be considered as selection criteria increasing the accuracy of genetic parameters estimates to improve economic important traits, with its direct genetic action on prolificity and providing an appropriate maternal environment for lamb growing independent of his genotype. The results obtained in this research demonstrate that using direct additive heritability and genetic correlations, the traits studied and the FecGE allele of the GDF9 gene can be used as selection criteria in Santa Inês breeding schemes.

EFEITO DA PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSSEA 15 (BMP15), DO FATOR DE CRESCIMENTO E DIFERENCIACÃO 9 (GDF9) NA PRESENÇA DE BAIXA OU ALTA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS INCLUSOS EM TECIDO OVARIANO

O objetivo do presente estudo foi investigar a influência da concentração de insulina sobre o efeito da adição do Fator de Crescimento e Diferenciação 9 (GDF9) e a Proteína Morfogenética Óssea 15 (BMP15) isoladamente ou em associação sobre o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos inclusos em tecido ovariano. Fragmentos oriundos de um mesmo par ovariano foram distribuídos aletoriamente para o grupo controle não cultivado ou cultivados in vitro por 7 dias em meios de cultivo contendo baixas (10 ng/mL) ou altas (10 g/mL) concentrações de insulina na ausência de GDF9 e BMP15 isoladamente ou em associação. O tratamento com insulina baixa mostrou uma porcentagem significativamente maior de folículos normais do que o tratamento com insulina alta. A adição de BMP15 sozinho ou em associação com GDF9 ao meio contendo insulina baixa reduziu a percentagem de folículos normais (P <0,05). Contudo, a adição de BMP15 e GDF9 isoladamente ou em associação a um meio de cultivo contendo de insulina alta aumentou significativamente a percentagem de folículos normais. O meio contendo somente insulina baixa ou insulina alta suplementada com BMP15 e BMP15 + GDF9 após sete dias de cultivo mostrou uma maior percentagem de folículos secundários do que o controle não cultivado. Em conclusão, na presença de concentração fisiológica de insulina (10 ng/mL), a suplementação do meio com GDF9 e BMP15 isoladamente ou em combinação não mostrou qualquer vantagem. Entretanto, para a manutenção de um padrão de desenvolvimento folicular (diâmetro nas diferentes categorias) semelhante ao in vivo, a concentração de 10 g/mL de insulina é indicada.

The aim of the present study was to investigate the influence of medium with different insulin levels on the in vitro effect of GDF9 and BMP15 related to the survival and development of caprine preantral follicles enclosed in ovarian tissue. Fragments from the same ovarian pair were randomly assigned to non-cultured control treatment or in vitro cultured for 7 days in -MEM containing 10 ng/mL (Low) or 10 g/mL (High) insulin concentrations in the absence or presence of BMP15 and/or GDF9. Low insulin treatment showed a significant higher percentage of normal follicles than High insulin treatment. The addition of BMP15 alone or in association with GDF9 to the medium containing low insulin reduced (P<0.05) the percentage of normal follicles. However, the addition of BMP15 and GDF9 alone or in association to high insulin medium significantly enhanced the percentage of normal follicles. The medium containing Low insulin alone or High insulin supplemented with BMP15 and BMP15+GDF9 treatments after seven days of culture showed a higher percentage of secondary follicles than noncultured control. In conclusion, in the presence of physiological concentration of insulin (10 ng/mL), the medium supplementation with GDF9 and BMP15 alone or in combination did not showed any advantage. However, for a follicular development close to in vivo scenario, a concentration of 10 g/mL insulin is indicated.

Genes relacionados à prolificidade em uso de programas de conservação e melhoramento de ovinos.

A prolificidade (número de cordeiros nascidos por ovelhas expostas à reprodução) está relacionada à taxa de ovulação e pode ser considerada como um parâmetro importante no aumento da produtividade. Atualmente, a fenotipagem dessa característica só pode ser avaliada em fêmeas em idade reprodutiva e, em geral, apresenta um custo relativamente alto para espécie. No entanto, esta é uma característica controlada por poucos genes de forma que pode ser factível a implementação de esquemas de seleção por marcadores moleculares. Três genes de efeito principal tem sido considerados para explicar grande parte dos fenótipos de partos múltiplos: GDF9, BMP15 e BMPR1- b. O presente trabalho foi executado de forma a aumentar o conhecimento dos polimorfismos existentes nestes genes em raças localmente adaptadas de ovinos bem como avaliar a possibilidade de aplicar conhecimento adquirido em programas de conservação e melhoramento no Brasil. No primeiro experimento, 252 animais da raça Morada Nova provenientes de testes de desempenho do Programa de Melhoramento genético participativo da raça foram genotipados para presença ou ausência do alelo FecGE do gene GDF9, inicialmente descrito apenas na raça Santa Inês. A referida mutação foi identificada em alta frequência na raça Morada Nova e ela não aparenta estar associada a características de produção/crescimento usadas nos testes de desempenho da raça Morada Nova. No segundo experimento, sequências completas dos genes: BMP15, BMPR1-b e GDF9 foram obtidas por dados de sequenciamento de nova geração de 75 ovinos de diferentes raças provenientes do repositório do Consórcio Internacional do Genoma Ovino (ISGC). Foram identificados um total de 1610 SNPs a partir de dados de sequenciamento de nova geração de 75 genomas ovinos. Pelo menos três SNPs foram identificados na região de exon dos genes BMPR1-b e BMP15, que resultaram em alterações não conservativa de aminoácidos e, portanto, são candidatos imediatos a serem testados em raças com históricos de partos múltiplos. A identificação e seleção destes SNPs serão usadas para compor um painel de baixa densidade para a prolificidade e, depois de validados em raças prolíficas com histórico de parto simples e múltiplos, poderão ser usados para otimizar programas de conservação e melhoramento de ovinos.

The prolificacy (number of lambs per sheep exposed to reproduction) is mainly related to ovulation rate and can be considered as an important parameter in sheep productivity. This phenotype can only be evaluated in reproductive age female and still has a reasonable cost. On the other hand, it is know this trait is controlled by few genes and it might be feasible to implement marker assisted selection scheme. Three major genes have been recognized to explain phenotypes related to litter size: GDF9, BMP15 and BMPR1-b. The objective of the present study was to increase the knowledge of existing polymorphisms in genes related to prolificacy in locally adapted sheep breeds and evaluate its use in conservation and breeding programs in Brazil. In the first experiment it was genotyped, for the FecGE mutation (GDF9), 252 Morada Nova animals who participated in breed performance tests The FecGE mutation is not restricted to Santa Ines breed and it was found in high frequency in Morada Nova sheep. In addition, this mutation does not appear to be associated with production traits used on performance tests of Morada Nova sheep breed. The second experiment was analyze the complete sequence of genes: BMP15, BMPR1-b and GDF9 from 75 sheep of different breeds from the International Consortium repository Genome Ovine (ISGC). It was identified a total of 1610 SNPs from 75 sheep genomes. Three SNPs from BMP15, BMPR1-b genes change in non-conservative amino acid. The identification and selection of these SNPs will be used to develop a low density panel for prolificacy that might be applied to conservation and breeding programs.

CARACTERIZAÇÃO ANDROLÓGICA DE CARNEIROS SANTA INÊS PORTADORES DO POLIMORFISMO FECGE

O fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9) é codificado por um gene de mesmo nome e é membro da superfamília do fator de crescimento transformante (TGF-). Um alelo do GDF9, o polimorfismo FecGE, tem sido estudado e está ligado ao aumentando da taxa de ovulação em ovelhas homozigotas, cujos efeitos resultam em fenótipos prolíficos, contribuindo para o aumento no número de crias. O GDF9 também atua em células relacionadas à reprodução dos machos. No entanto são escassos ou inexistentes os relatos sobre sua ação, assim como os efeitos do FecGE, sobre as características andrológicas de carneiros. Como os machos podem deixar um maior número de descendentes em sua vida reprodutiva, quando comparado às fêmeas, torna-se importante seu papel na disseminação de material genético. Objetivou-se com esse trabalho traçar o perfil clínico-andrológico, seminal e espermático e possíveis efeitos do polimorfismo FecGE, do gene GDF9 sobre o potencial reprodutivo de carneiros da raça Santa Inês. O experimento foi desenvolvido na região do Agreste Sergipano, nos meses de junho, agosto e outubro de 2014, que corresponderam a três diferentes ciclos de espermatogênese. Trinta e quatro machos, sexualmente maduros, genotipados para o FecGE, foram distribuídos em grupos de acordo com seu genótipo: WW selvagem e, EW heterozigoto e EE homozigoto para o FecGE. Realizaram-se avaliações andrológicas quanto à: biometria testicular e epididimária; volume seminal; concentração, morfologia e viabilidade espermática e; cinética computadorizada e, integridade de membrana plasmática (IMP) associada ao potencial de membrana mitocondrial (PMM) ou à capacitação e reação acrossomal dos espermatozoides (CTC). Algumas características testiculares e epididimárias como circunferência escrotal, altura e espessura do testículo esquerdo, largura da cauda do epidídimo esquerdo e; a altura, espessura e volume do testículo direito, foram superiores (P<0,05) nos animais selvagens, comparados aos demais. Para a maioria dos parâmetros seminais os genótipos não apresentaram diferenças entre si (P>0,05). Somente a frequência de batimento flagelar cruzado (BCF) foi maior (P<0,05) para os animais homozigotos mutantes. Os genótipos não diferiram (P>0,05) quanto à integridade de membrana plasmática associada ao potencial de membrana mitocondrial e a capacitação e reação acrossomal. Apesar de influenciar alguns aspectos andrológicos conclui-se que de um modo geral o polimorfismo do FecGE não diminui a capacidade reprodutiva de carneiros sendo viável seu uso para a disseminação da mutação.

The growth and differentiation factor - 9 (GDF9) is encoded by a gene of the same name and is a member of the superfamily of transforming growth factor - (TGF-). An allele of GDF9, the FecGE polymorphism, has been studied and is connected to increasing the ovulation rate in sheep homozygous, which effects result in phenotypes prolific, contributing to an increase in the number of offspring. The GDF9 also active in cells related to the reproduction of males. However there are few or no reports of its action, as well as the effects of FecGE on the andrologic characteristics of rams. As males can leave a larger number of offspring in their reproductive life, than the females, it becomes important role in the dissemination of genetic material. The objective of this work to establish a clinical-andrologic profile, semen and sperm and possible effects of FecGE polymorphism, the GDF9 gene on the reproductive potential of sheep Santa Ines. The experiment was conducted in Sergipe Agreste region, in June, August and October 2014, corresponding to three different cycles of spermatogenesis. Thirty-four males, sexually mature, genotyped for FecGE were divided into groups according to their genotype: WW wild and EW - heterozygous and EE - homozygous for the FecGE. There were andrologic assessments of testicular and epididymal biometrics; seminal volume; concentration, morphology and sperm viability and; computed kinetics and plasma membrane integrity (IMP) associated with the mitochondrial membrane potential (MMP) or training and acrosome reaction of sperm (CTC). Some testicular and epididymal characteristics as scrotal circumference, height and thickness of the left testicle, tail width of the left epididymis and; height, thickness and volume of the right testicle, were higher (P <0.05) in wildlife, compared to the others. For most seminal parameters genotypes had no significant (P> 0.05). Only the beat cross frequency (BCF) was higher (P <0.05) in animals homozygous mutants. The genotypes did not differ (P> 0.05) on the integrity of plasma membrane associated with the mitochondrial membrane potential and the training and acrosome reaction. Although influence some aspects andrological is concluded that in general the polymorphism FecGE not diminish the reproductive capacity of sheep and their use feasible to spread the mutation.

Regulação da divergência folicular in vivo: uma abordagem molecular / Regulation of follicular deviation in vivo: a molecular approach

O controle local da seleção folicular em mamíferos ainda é pouco compreendido. O objetivo do presente estudo foi identificar fatores locais, receptores e rotas de sinalização envolvidas na seleção do folículo dominante e atresia dos subordinados em bovinos. Em um primeiro estudo, avaliou-se a regulação e função do FGF10 e do seu receptor FGFR2b durante a divergência folicular. A expressão de FGF10 e FGFR2b foi significativamente maior nas células da teca e granulosa, respectivamente, provenientes dos folículos subordinados. A injeção intrafolicular de FGF10 inibiu o crescimento folicular de maneira dose dependente e reduziu significativamente a síntese de estradiol. Nas células da granulosa, a injeção de FGF10 diminuiu a expressão de RNAm de CYP19A1 e ciclina D2, enquanto que uma tendência de aumento da expressão do receptor FGFR2b foi observada. Nas células da teca, um aumento significativo na expressão de FGF10 foi observado nos folículos tratados com FGF10. Em um segundo estudo, o padrão de expressão dos receptores de BMPs e das proteínas BMP15 e GDF9 foram avaliados em vacas ovariectomizadas em diferenes dias em relação ao inicio da onda folicular, comparando os dois maiores folículos antes (dia 2), durante (dia 3) ou após a divergência folícular (dia 4). No dia 2 da onda folicular, foi observada maior expressão do receptor BMPR-1A e tendências a maior expressão dos receptores BMPR-2 e -1B nos futuros folículos subordinados. No dia 3, quando os folículos dominantes e subordinados são identificados, a expressão de BMPR-1B e -2 foi maior nos folículos subordinados. No dia 4, o receptor BMPR1B (RNAm e proteína) foi significativamente mais expresso nas células da granulosa de folículos atrésicos. O aumento da expressão do BMPR1B durante a atresia folicular foi confirmado nas células da granulosa de folículos induzidos à atresia através do tratamento com FGF10 ou inibidor dos receptores de estradiol. A abundância de BMP15 e GDF9 no fluído folicular não diferiu entre folículos dominantes e subordinados. Em um terceiro estudo, buscou-se identificar rotas de sinalização diferentemente ativas nas células da granulosa durante a divergência. Os níveis de MAPK fosforilada foram significativamente superiores nos futuros folículos dominantes (dia 2), mas não diferiram entre os dois maiores folículos durante ou após a divergência. Folículos subordinados apresentaram maiores níveis de STAT3 fosforilada em relação aos seus respectivos dominantes em todos os pares de folículos coletados, sendo observado um aumento significativo em folículos atrésicos coletados no dia 4. Em conclusão, os resultados sugerem que a expressão reduzida de FGF10 e do receptor FGFR2b possibilitam o crescimento e diferenciação do folículo dominante, enquanto que o aumento da sinalização do FGF10 no folículo subordinado está associado com a atresia. O perfil de expressão dos receptores BMPR-2, -1B e -1A indica que os mesmos apresentam funções na regulação da divergência folicular em bovinos. A fosforilação da MAPK é um marcador inicial de dominância folicular, mas não é diferentemente regulada durante e após a divergência, enquanto que o padrão de ativação da STAT3 sugere que essa via está envolvida na morte das células da granulosa

The role of local factors in follicular selection in mammals is not fully understood. The aim of the present study was to identify local factors, receptors and intracellular signaling pathways involved in bovine dominant follicle selection and subordinate follicles atresia. In the first study, the pattern of mRNA expression and function of FGF10 and its receptor FGFR2b was evaluated during bovine follicle deviation. FGF10 and FGFR2b were significantly more expressed in theca and granulosa cells retrieved from subordinate follicles, respectively. Intrafollicular FGF10 treatment in the larger follicle dose-dependently inhibited follicle growth and significantly reduced estradiol secretion. In granulosa cells, FGF10 treatment decreased CYP19A1 and cyclin D2 mRNA expression whereas FGFR2b tended to be more expressed after treatment. In theca cells, a significant increase in FGF10 expression was observed in FGF10-treated follicles. In a second study, BMPRs, BMP15 and GDF9 expression was evaluated in cows ovariectomized when the size of the largest and second largest follicle did not have a significant difference (D2), had slight difference (D3) or marked difference (D4). At day 2 of follicular wave, it was observed a significant increase in BMPR1A expression whereas BMPR-2 and - 1B tended to be more expressed in future subordinate follicles. At day 3, when dominant and subordinate follicles are reliably identified, BMPR-2 and 1B were more expressed in subordinate follicles. At day 4, BMPR1B (mRNA and protein) was significantly more expressed in granulosa cells from atretic follicles. The increased BMPR1B expression during atresia was confirmed in granulosa cells from follicles induced to atresia with FGF10 or estradiol receptor antagonist treatment. Similar levels of BMP15 and GDF9 proteins were observed in follicular fluid from dominant and subordinate follicles. In a third study, we aimed to identify intracellular signaling pathways differentially activated in granulosa cells during deviation. Phosphorylated MAPK was more abundant in the future dominant follicle, but did not differ between follicles at the expected moment and after follicular deviation. Subordinate follicles phosphorylated STAT3 levels tended to increase at day 3 and were significantly greater at day 4 in comparison to dominant follicles. In conclusion, present results suggest that decreased FGF10 and FGFR2b expression allows dominant follicle growth and differentiation whereas increased FGF10 signaling in the subordinate follicle induces atresia. The patterns of BMPR- 2, -1B and -1A indicate that these receptors play roles during follicle deviation. Phosphorylated MAPK abundance is an early marker of follicle dominance, but is not differentially regulated during and after deviation. The functional status of STAT3 suggests that this pathway is involved in granulosa cell death