Desenvolvimento de Técnicas de Genética Molecular para a Identificação de Fraude de Leite de Vaca em Leite e Produtos lácteos de Búfala

A crescente demanda por derivados de leite de búfalas nos últimos anos tem destacado a espécie bubalina na pecuária brasileira, encorajando muitos produtores a investir nessa área de produção. A superioridade e os benefícios à saúde humana dos componentes do leite de búfala contribuem com o aumento do consumo de seus derivados. Essa crescente demanda aliada com o fato de a produção ser sazonal e possuir maior valor agregado, pode levar a um aumento da incidência de práticas ilícitas, como adição de quantidade variáveis do leite de vaca durante a fabricação, caracterizando fraude por adulteração de produto. Alguns métodos analíticos distintos têm sido utilizados para a identificação de espécies em leite e produtos lácteos, contudo, os métodos baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são considerados as técnicas mais confiáveis e sensíveis. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivos a padronização de um método de extração de DNA que possa ser aplicado em diferentes tipos de produtos lácteos e o desenvolvimento e padronização de duas técnicas baseadas na PCR em Tempo Real como métodos para detecção de fraude: análise de HRM (High Resolution Melting) e detecção por sistema rhAmp® SNP. A extração de DNA foi padronizada para todas as amostras utilizadas, sendo dez amostras de leite e onze amostras de produtos lácteos. A técnica que apresentou maior sensibilidade na detecção de fraude foi rhAmp (1%) comparada a do ensaio HRM (5%). Ambas as técnicas podem ser utilizadas para a identificação de adulteração do produto, porém quando altos níveis de sensibilidade são necessários a técnica que utiliza rhAmp pode ser considerada a melhor opção.

The growing demand for buffalo milk products in recent years has highlighted the buffalo species in Brazilian livestock, encouraging many producers to invest in this area of production. The superiority and benefits to human health of the components of buffalo milk contribute to increased consumption of its derivatives. This growing demand coupled with the fact that production is seasonal, and has greater values added, it can lead to an increase in the incidence of illegal practices, such as the addition of variable amounts of cow's milk during production, characterizing fraud due to product adulteration. Some different analytical methods has been used to identify species in milk, and dairy products, however methods based on the Polymerase Chain Reaction (PCR) are considered the most reliable, and sensitive techniques. Thus, the present study aimed to standardize a DNA extraction method that can be applied to different types of dairy products and the development and standardization of two techniques based on Real Time PCR as methods for fraud detection: analysis of HRM (High Resolution Melting), and detecting by rhAmp® SNP system. DNA extraction was standardized for all samples used, with ten samples of milk, and twelve samples of dairy products. The technique with the highest sensitivity was rhAmp (1%) compared to the HRM assay (5%). Both techniques can be used to identify adulteration of the product, however when high levels of sensitivity are needed the technique that uses rhAmp can be considered the best option.

IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DOS PROTOZOÁRIOS TOXOPLASMA GONDII, SARCOCYSTIS NEURONA, NEOSPORA CANINUM E CRYPTOSPORIDIUM PARVUM ATRAVÉS DA TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)

Parasitos da classe Coccidia pertencentes ao filo Apicomplexa, são microrganismos que possuem importância médica e veterinária, a exemplo de Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora caninum e Cryptosporidium parvum. O conhecimento desses parasitos é de profunda importância, pois estes podem provocar graves danos aos hospedeiros. Técnicas diagnósticas modernas e cada vez mais precisas são essenciais para o melhor conhecimento destes parasitos. Objetivou-se com este estudo padronizar a técnica High Resolution Melting (HRM) para identificação e diferenciação destes protozoários, através da amplificação do gene 18S do rRNA. As amostras foram analisadas individualmente, em reações duplex e multiplex. Os resultados demonstraram que o HRM permitiu identificar e diferenciar as quatro espécies através da análise das curvas de dissociação, normalização e diferenciação. A técnica apresentou alta reprodutibilidade inter e intra-experimento, demonstradas pelos baixos coeficientes de variação (2,2% e 2,0%, respectivamente). Desta forma, a análise utilizando HRM demonstrou ser discriminatória para estas quatro espécies de protozoários.

Parasites of the class Coccidia belonging to the phylum Apicomplexa, are microorganisms Which are of medical and veterinary importance, such as Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora caninum and Cryptosporidium parvum. The knowledge Of these parasites is of profound importance as they can cause serious damage To the hosts. Modern and increasingly accurate diagnostic techniques are Essential for the better knowledge of these parasites. This study was aimed at To standardize the High Resolution Melting (HRM) technique for identification and Differentiation of these protozoa through the amplification of the 18S rRNA gene. At Samples were analyzed individually, in duplex and multiplex reactions. The The results showed that HRM allowed to identify and differentiate the four Species by analyzing the dissociation, normalization, and differentiation curves. THE Technique presented high inter- and intra-experiment reproducibility, demonstrated by the Low coefficients of variation (2.2% and 2.0%, respectively). In this way, the Using HRM has shown to be discriminatory for these four species of protozoa

Marcadores moleculares como preditores de desempenho atlético em cavalos de hipismo Molecular markers as performance predictors in horses

Vários estudos procuram associar genética e fenótipo positivo para o desempenho atlético em equinos. Neste contexto, dois estudos foram desenvolvidos com o objetivo de investigar a base molecular de uma possível melhora nas variáveis fisiológicas utilizando a suplementação oral de substâncias ergogênicas e utilizar estes parâmetros como marcadores moleculares de desempenho. Para isso, no primeiro estudo, uma técnica de high resolution melting do SNP g.66493737C>T no gene da miostatina (MSTN) utilizando sondas não marcadas foi desenvolvida como forma de triagem genotípica. Vinte e três cavalos de salto foram genotipados com uma sonda não marcada com um C3-spacer. Sete animais apresentaram curvas de melting inconsistentes, enquanto os demais 16 animais foram genotipados com sucesso com um nível médio de confiança de 84,4%. A frequência de T/T foi de 63,6%, de T/C foi de 31,8%, e de C/C foi de 4,5%. Em seguida, dezesseis cavalos de salto foram suplementados durante oito semanas com placebo (n = 8) ou creatina (n = 8, 1ª semana = 0,3 g/kg, 2ª-8ª semana = 0,05 g/kg), para avaliação dos efeitos da creatina sobre os níveis de miostatina plasmática. Peso corporal, creatina, miostatina, creatinina e creatina quinase (CK) foram avaliadas em 0, 4 e 8 semanas de suplementação. A suplementação com creatina não alterou o peso corporal, creatinina, CK, e miostatina. A creatina sérica foi significativamente maior na 4ª semana, mas não na 8ª semana de suplementação. A estratificação dos dados por sexo dentro de cada grupo não afetou a análise estatística; a estratificação pelo genótipo não foi possível. No segundo estudo, os efeitos da suplementação oral com ácido linoleico conjugado (CLA) sobre o peso corporal, o influxo de lactato nos eritrócitos através do transportadores de monocarboxilato (MCTs) e na expressão dos gene MCT1, CD147 e PPRA- na medula óssea foram avaliados. Doze pôneis receberam CLA (n = 6, 0,01% PV) ou óleo de milho (n = 6, dieta isocalórica). Os dados foram coletados em 0, 30 e 60 dias. CLA não afetou o peso corporal e o influxo de lactato. Embora não seja significativo, houve um aumento na expressão de PPRA- no grupo CLA e do influxo de lactato eritrocitário. Por outro lado, os animais do grupo controle apresentaram uma diminuição de expressão dos três genes avaliados, bem como do influxo de lactato eritrocitário, embora de forma não significativa. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o uso de substâncias ergogênicas com o objetivo de modificar a expressão e compreender a regulação de genes, como o MSTN e MCT1/CD147, pode ajudar na escolha do melhor genótipo e fenótipo para a prática esportiva, e torná-los marcadores genéticos e moleculares de desempenho, não só em cavalos de salto, mas em outras raças e esportes.

Several studies aim to make an association between genetic background and positive phenotype for sports practice in horses. In this context, two studies were developed with the aim of investigate the molecular basis of a possible improvement in physiological variables using oral supplementation with well-known ergogenic aids in order to use these parameters as molecular markers of performance. For that, in the first study, a high resolution melting analysis to identify the SNP g.66493737C>T in the MSTN gene using unlabeled probes was developed and used as a rapid genotype screening. Twenty three jump horses were genotyped with a C3-spacer unlabeled probe. Seven animals revealed inconsistent melting curves, but the remaining 16 animals were successfully genotyped with a mean level of confidence of 84.4%. Frequency of T/T was 63.6%, T/C was 31.8%, and C/C was 4.5%. Hereafter, sixteen jump horses were supplemented during 60 days with placebo (n = 8) or creatine monohydrate (n = 8, 1st week = 0.3 g/kg, 2-8th week = 0.05 g/kg), in order to evaluate the effects of creatine on plasma myostatin levels. Body weight, creatine, myostatin, creatinine and CK were evaluated in blood samples at 0, 4 and 8 weeks of supplementation. Creatine monohydrate did not change body weight, creatinine, creatine kinase (CK), and myostatin. Serum creatine was significantly increased at week 4, but not at week 8 of creatine supplementation. Stratification of data by sex within each group did not affect the statistical analysis; stratification by genotype was not possible. In the second study, the effects of oral supplementation with CLA on body weight, lactate influx into RBCs through the monocarboxylate transporter (MCT), and in the gene expression of MCT1, CD147 and PPRA- in bone marrow was evaluated. Twelve ponies received CLA (n = 6, 0.01% BW) or corn oil (n = 6, isocaloric). Data were collected at 0, 30 and 60 days. CLA did not affect body weight, and lactate influx into erythrocytes. Although not significant, there was an increase in PPRA- expression and in RBC lactate influx in CLA group. In the other hand, control animals presented decreased gene expression of all genes and erythrocytes lactate influx along the period of supplementation, but not significantly. Taken together, those results indicate that the use of ergogenic aids with the purpose of modify the expression and understand the regulation of genes, such as MSTN gene and MCT1/CD147, can help to select the best genotype and phenotype for sport practice, and make those genes candidates of genetic and molecular markers of performance, not only in jump horses, but in other breeds and sports.