Estudo endócrino reprodutivo e do comportamento sócio-sexual de sagui-de-tufo-preto (Callithrix penicillata) mantido em cativeiro / Reproductive endocrine and socio-sexual behavior study of black-tufted-marmoset (Callithrix penicillata) kept in captivity

A comunicação do estado reprodutivo nos primatas da família Callithrichidae, depende principalmente dos comportamentos sócio-sexuais como um sistema de sinalização primário, uma vez que nestas espécies a ovulação não é percebida pelos machos. Neste trabalho, os padrões de comportamentos sócio-sexuais foram analisados em conjunto com as concentrações de metabólitos fecais dos esteróides sexuais progesterona (MFP), estradiol (MFE) e testosterona (MFT) em casais cativos de Sagüi-de-tufos-pretos (Callithrix penicillata), nas diferentes fases do ciclo ovariano. O grupo estudado era composto por quarto casais adultos, mantidos no Centro de Reabilitação de Animais Selvagens da prefeitura de São Paulo. Os padrões comportamentais foram registrados pelo método de amostragem focal por intervalo de tempo a cada 30 segundos, cinco vezes por semana, totalizando 14.400 registros por animal. A mensuração das concentrações de metabólitos fecais dos esteroides sexuais foram realizados pelo método de enzima imunoensaio (EIE). Os resultados obtidos dessas concentrações possibilitaram a determinação endócrina das fases do ciclo ovariano (folicular e luteal) e de suas respectivas durações, assim como a determinação da fase periovulatória. Foram caracterizados 31 ciclos ovarianos completos, com duração de 24,3±4,1 dias (média ±DP), sendo que a fase folicular compreendeu 13,04±4,8dias e a fase lútea 11,2±4,2 dias. Os comportamentos sócio-sexuais (marcação por cheiro, cheirar genitália, catação e apresentação sexual) e a variável "proximidade" mostraram-se significativamente mais prevalentes na fase periovulatória do que nas demais fases do ciclo. Não houve alteração das concentrações de MFT dos machos ao longo de todo o período estudado. A análise conjunta das concentrações de metabólitos fecais de esteróides sexuais e dos comportamentos sócio-sexuais possibilitou um melhor entendimento das relações endócrino-comportamentais e reprodutivas de C. penicillata. .(AU)

The communication of the female reproductive status in Callithrichidae relies mainly on the socio-sexual behavior, as generally the ovulation is concealed in this primate family by a primary signaling system. In this study the socio-sexual behavior patterns was analyzed in association with the concentration of fecal metabolites of sex steroid hormones progesterone (MFP), estradiol (MFE) and testosterone (MFT) in captive couples of Black-Tufted-Marmoset (Callithrix penicillata), during the different phases of the ovarian cycle. The studied group was composed of four adult couples kept in the São Paulo City Wild Animals Rehabilitation Center. The behavioral patterns were record by focal samplings, with 30 seconds intervals for each observation, five days a week, totalizing 14.400 registers per animal. The measurement of fecal metabolites of progesterone (MFP), estradiol (MFE) and testosterone (MFT) proceeded by enzyme immune assay (EIA). The results allowed to determine the duration of the ovarian cycle and to characterize three different phases (follicular, periovulatory and luteal). It was possible to determine 31 complete cycles that lasted 24.3±4.1 days (Mean ± SD). The follicular and luteal phases lasted 13.04±4.8 and the luteal phase 11.2±4.2 days. The behavioral patterns (scent marking, sniff genitals, grooming and sexual presentation) were more prevalent in the periovulatory phase as the behavioral variable "proximity" as well. There were no variations in the concentration of MFT in the males during the period studied. The associated analyses of the fecal metabolite of sex steroids and the socio-sexual behaviors led to a better understanding of the factors involved in the reproduction of C. penicillata.(AU)

Indução à maturação final e ovulação de lambari (Astyanax altiparanae) com análogos do hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH)

A presente tese foi dividida em três capítulos, no primeiro é apresentada uma revisão bibliográfica dos temas relacionados à tese, os outros dois capítulos são manuscritos gerados a partir dos experimentos realizados durante o doutorado. No manuscrito I (capítulo II) avaliamos o desempenho reprodutivo de fêmeas de lambari (Astyanax altiparanae) usando diferentes protocolos de reprodução em cativeiro, como a administração de análogo do hormônio liberador de gonadotrofina de salmão (sGnRHa) e extrato de pituitária de carpa (CPE), bem como sem o uso de terapia hormonal. Foram realizados dois experimentos consecutivos com machos e fêmeas maduros de lambari (seis meses de idade) usando dose única (Exp. 1) ou fracionada (10% + 90% - intervalo de 12h) (Exp. 2). No Exp. 1, seis doses de sGnRHa (variando de 1 a 160 g kg -1 ) foram aplicadas em três repetições (cinco fêmeas e 10 machos cada); no Exp. 2, três doses de sGnRHa (10, 100 e 1000 g kg -1 ) foram aplicadas em quatro repetições (cinco fêmeas e 10 machos cada). Em ambos os experimentos, 6 mg de CPE kg -1 e solução salina foram usados como controles positivo e negativo, respectivamente. A quantificação de 17-20-dihidroxi-4- pregnen-3-ona (17,20-P) e níveis plasmáticos de prostaglandina F2 e avaliações histológicas ovarianas foram introduzidas no Exp. 2 separando fêmeas desovadas e não desovadas. Usando uma única dose, a taxa de desova foi baixa e semelhante entre todos os grupos (de 0 a 20%). Usando doses fracionadas, a taxa de desova de CPE (60%) foi maior do que todos os outros grupos (de 10 a 25%), com exceção da dose mais alta de sGnRHa (40%). A desova e elevação dos níveis de 17,20-P ocorreram em algumas fêmeas do controle negativo (Exp. 2). Portanto, a terapia com doses fracionadas de CPE melhorou a ovulação de lambari, mas não foi condicional para a obtenção da ovulação. Apenas as fêmeas não desovadas induzidas com doses fracionadas de CPE, mas não com sGnRHa e nem no controle negativo, atingiram a maturação final. Além disso, a desova nos grupos com sGnRHa ocorreu em uma extensão semelhante à do controle negativo e os grupos tratados com sGnRHa não mostraram qualquer resposta dose-dependente considerando todas variáveis avaliadas. Portanto, é possível que a desova nos grupos sGnRHa se deva apenas ao agrupamento de peixes, semelhante ao controle negativo. Em conclusão, a dose fracionada de CPE foi o único tratamento que provocou maturação final em todas as fêmeas tratadas e um aumento significativo no desempenho reprodutivo em comparação com todos os outros tratamentos. No manuscrito II (capítulo III) avaliamos o efeito do análogo do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRHa) com e sem domperidona no desempenho reprodutivo de lambari e na liberação de 17,20-P e PGF 2 , bem como avaliação histológica das estruturas ovarianas em dois experimentos independentes e consecutivos. No primeiro experimento cinco doses de LHRHa (20, 60, 180, 540 e 1620 g kg -1 ) foram testadas com três repetições cada, enquanto no segundo experimento a dose de 180 g kg -1 foi testada em combinação com 20 mg kg -1 de domperidona (D) com quatro repetições. Em ambos os experimentos utilizamos solução salina 0,9% como controle negativo e 6 mg de CPE kg -1 como controle positivo e as fêmeas de todos os grupos receberam duas injeções (10% + 90% - intervalo de 12h). As doses testadas de LHRHa não apresentram resultados superiores aos do controle negativo. Associando o LHRHa com D não foram obtidos resultados superiores ao LHRHa sem associação, sugerindo que a dopamina parece não apresentar um papel no controle neuroendócrino da reprodução dessa espécie ou que este antidopaminérgico não é o mais indicado para o lambari. O grupo tratado com CPE foi o único com melhor desempenho que o controle negativo, indicando que o CPE foi a melhor terapia hormonal para induzir a desova em lambari (entre os testados por nós). Houve uma diminuição nas taxas de fertilização e eclosão que coincidiram com as duas doses mais altas de LHRH (540 e 1620 g kg -1 ), sugerindo que essas doses podem ter causado uma superestimulação da hipófise na produção de LH, a qual pode ter afetado a qualidade dos ovos.

The present thesis was divided into three chapters, in the first one a review of the themes related to the thesis is presented, the other two chapters are manuscripts prepared from the experiments carried out during the doctorate. In the manuscript I (chapter II) we evaluated lambari (Astyanax altiparanae) reproductive performance using different protocols of reproduction in captivity, such as the administration of analogue of salmon gonadotropin- releasing hormone (sGnRHa) and carp pituitary extract (CPE) as well as without the use of hormonal therapy. We performed two consecutive experiments with mature lambari males and females (six months old) using single (Exp. 1) or fractioned doses (10% + 90% - 12h interval) (Exp. 2). In Exp. 1, six sGnRHa doses (ranging from 1 to 160 g kg -1 ) were applied in three replicates (five females and 10 males each); in Exp. 2, three sGnRHa doses (10, 100 and 1000 g kg -1 ) were applied in four replicates (five females and 10 males each). In both experiments 6 mg of CPE kg -1 and saline solution were used as positive and negative controls, respectively. Quantification of 17-20-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20-P) and prostaglandin F 2 plasma levels and ovarian histological evaluations were introduced in Exp. 2 via the separation of spawned and unspawned females. Using a single dose, the spawning rate was low and similar between all groups (from 0 to 20%). Using fractioned doses, the spawning rate of CPE (60%) was higher than all other groups (from 10 to 25%), with the exception of the highest sGnRHa dose (40%). Spawning and elevation of 17,20-P levels occurred in some females of the negative control (Exp. 2). Therefore, only CPE fractioned doses therapy improved lambari ovulation but were not conditional for obtaining ovulation. Only unspawned females treated with fractioned CPE doses, but neither sGnRHa nor negative control, attained final oocyte maturation.In addition, spawning in sGnRHa groups occurred in a similar extent as in negative control and sGnRHa-treated groups did not show any dose dependent response considering all variables measured. Therefore, it was possible that spawning in sGnRHa groups were just due to grouping of fish, similar to negative control. In conclusion, the fractioned dose of CPE was the only treatment that provoked final oocyte maturation in all treated females and a significant enhance in reproductive performance comparing to all other treatments. In the manuscript II (chapter III) we evaluated the effect of luteinizing hormone-releasing hormone ethylamide analogue (LHRHa) with and without domperidone on reproductive performance of lambari and the quantification of plasma levels of 17,20-P and PGF 2 , as well as histological evaluation of ovarian structures in two independent and consecutive experiments. In the first, five doses of LHRHa (20, 60, 180, 540 and 1620 g kg -1 ) were tested with three replicates each, while in the second the dose of 180 g kg -1 was tested in combination with 20 mg kg -1 domperidone (D) with four replicates. In both experiments, we used 0.9% saline as a negative control and 6 mg CPE kg -1 as a positive control and the females of all groups received two injections (10%; and 90% after 12 h). The doses we tested of LHRHa did not show results superior to those of the negative control. When associating LHRHa with D, we did not obtain results superior to LHRHa without association, suggesting that dopamine does not seem to play a role in the neuroendocrine control of the reproduction of this species or that this antidopaminergic is not the most suitable for lambari. The group treated with CPE was the only one with better performance than the negative control, indicating that CPE was the best hormonal therapy to induce spawning in lambari (among those tested by us). There was a decrease in fertilization and hatching rates that coincided with the two highest doses of LHRH (540 and 1620 g kg -1 ), suggesting that these doses may have caused an overstimulation of the pituitary in the production of LH, which may have affected egg quality.

Esteroidogênese testicular durante o desenvolvimento sexual pós-natal em Galea spixii (Wagler, 1831)

O desenvolvimento testicular e a manutenção da espermatogênese são controlados por gonadotrofinas e testosterona, cujos efeitos são modulados por uma rede complexa de fatores produzidos localmente e, entre eles, os estrógenos estão em causa. Uma compreensão da dinâmica dos hormônios esteroides sexuais mostra-se importante para revelar as funções durante o desenvolvimento testicular. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo aprofundar os conhecimentos sobre a espermatogênese do Galea spixii, associando a atuação das enzimas do complexo citocromo P450: P450 aromatase e P450c17 (17--hidroxilase/17,20-liase) importantes para a biossíntese de hormônios ligados à reprodução durante o desenvolvimento sexual pós-natal. Fragmentos de testículos de preás machos nas fases impúbere, pré-púbere, púbere e pós-púbere foram coletados no Centro de Multiplicação da Universidade Federal Rural do Semiárido, Mossoró, RN, fixados em Paraformoaldeido 4%, e processados para Imunohistoquímica. Durante as fases do desenvolvimento sexual a enzima P450c17 apresentou imunomarcação positiva apenas nas células de Leydig. A imunomarcação da enzima P450 aromatase foi positiva em diferentes tipos celulares ao longo do desenvolvimento sexual do Galea spixii. A síntese de estrógenos no parênquima testicular do G. spixii não ficou restrita às células somáticas, as células germinativas também mostraram capacidade de converter andrógenos em estrógenos.

The testis development and maintenance of spermatogenesis are controlled by gonadotropins and testosterone, whose effects are modulated by a complex factor locally produced, and the estrogens are involved. An understanding of the dynamics of sex steroid hormones shown to be important to reveal the functions during testicular development. Thus, the aimed was study the spermatogenesis of Galea spixii, associating the performance of cytochrome P450 complex: P450 aromatase and P450c17 (17--hydroxylase / 17,20-lyase) important for the biosynthesis of hormones related to reproduction during postnatal sexual development. Fragments of G. spixii male testes in immature, prepubertal, pubertal and post-pubertal were collected at Centro de Multiplicação da Universidade Federal Rural do Semiárido, Mossoró, RN, fixed in Paraformaldehyde 4%, and processed for immunohistochemistry. Cytochrome P450c17 expression in testicular parenchyma showed a positive reaction only in Leydig cell clusters. The expression of cytochrome P450 aromatase in testicular parenchyma were different during the sexual development of Galea spixii. During sexual development of Galea spixii was observed that estrogen synthesis was not restricted to somatic cells (Leydig cells / Sertoli cells), the germ cells have also shown to be capable to convert androgens into estrogens via aromatase.