Efficacy of disinfectants to inactivate H1N1 influenza A virus isolated from pigs / Eficácia de desinfetantes para inativar o vírus da influenza A H1N1 isolado de suínos

The aim of this study was to access the efficacy of four disinfectants to inactivate influenza A [H1N1] 0 hour and 72 hours after disinfectant dilution. A pandemic H1N1 influenza virus isolated from a pig with respiratory disease was used to obtain inoculums containing 6.4log10 EID50/mL; 5.4log10 EID50/mL; 4.4log10 EID50/mL and 3.4log10 EID50/mL. Suspension test was composed of 400µL of viral inoculum, 100µL of organic load and 500µL of each individually diluted disinfectant and incubated for ten minutes of contact time. After a neutralizing step, each mixture was filtered on a 0.22µm membrane and 0.2mL was inoculated in six 9-day-old embryo chicken egg through allantoic route. The allantoic fluid from eggs was harvest for RT-PCR and hemagglutination test. The experiment was repeated 72 hours after disinfectant dilution. On the first assessment with fresh disinfectant, influenza virus was inactivated by oxidizing compost disinfectant and phenolic disinfectant in all virus concentrations, the quaternary ammonium compound (QAC) and glutaraldehyde association inactivated the virus up to a concentration of 5.4log10 EID50/mL. QAC disinfectant did not eliminate virus viability. Seventy-two hours after disinfectants were diluted, oxidizing compost disinfectant and QAC and glutaraldehyde association disinfectant demonstrated the same result as the evaluation with fresh disinfectant solution. Phenolic disinfectant inactivated viral inoculum up to a concentration of 5.4log10 EID50/mL. QAC had no effect on inactivating 3.4log10 EID50/ mL of influenza virus. In conclusion, three of the four disinfectants tested were effective to inactivate pandemic H1N1 influenza virus in the presence of organic load. Test result performed 72hours after disinfectant dilution suggest a decrease in the effectiveness of one disinfectant.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de quatro desinfetantes em inativar o vírus da influenza A [H1N1] 0-hora e 72-horas após a diluição dos produtos. Um vírus H1N1 pandêmico isolado previamente de um suíno com doença respiratória foi utilizado e foram obtidas quatro concentrações de inóculo contendo 6,4log10 EID50/mL; 5,4log10 EID50/mL; 4,4log10 EID50/mL and 3,4log10 EID50/mL. Para compor o teste em suspensão foram adicionados 400µL de inóculo viral, 100µL de matéria orgânica e 500µL de cada desinfetante diluído individualmente e a mesma foi incubada por 10 minutos. Após a etapa neutralizante, a suspensão foi filtrada em membrana 0,22µm e 0,2mL foi inoculado em seis ovos de galinha embrionados de nove dias de incubação, via rota alantóide. O fluido alantóide foi colhido após 72 horas para testes de hemaglutinação e RTPCR. O mesmo protocolo experimental foi repetido usando as soluções desinfetantes 72 horas após a diluição. O vírus da influenza foi inativado pelo composto oxidante e também pelo desinfetante fenólico em todas as concentrações virais testadas 0-hora após diluição. O desinfetante com associação de amônia quaternária e glutaraldeído inativou o vírus na concentração de até 5,4log10 EID50/mL. O desinfetante à base de amônia quaternária não inativou o vírus. Os resultados 72-horas após a diluição não diferiram quando comparado com 0-hora, exceto o desinfetante fenólico, o qual inativou o vírus da influenza somente até a concentração 5,4log10 EID50/ mL. Concluindo, três dos quatro desinfetantes testados foram efetivos ao inativar o vírus da influenza [H1N1] pandêmico na presença de matéria orgânica. Os resultados do teste com produtos diluídos após 72 horas sugerem redução da efetividade em, pelo menos, um desinfetante.

Infecção pelo vírus influenza A em suínos no sul de Moçambique / Influenza A virus infection in pigs in southern Mozambique

A influenza suína (IS) é uma doença aguda e altamente contagiosa do trato respiratório de suínos, causada pelo vírus influenza A (VIA). A doença provoca perdas econômicas na suinocultura e também, tem importância na saúde pública devido ao seu potencial zoonótico. O objetivo deste trabalho foi relatar a infecção pelo VIA em suínos de Moçambique e realizar a caracterização anatomopatológica e imuno-histoquímica (IHQ) das lesões pulmonares associadas. Pulmões de 457 suínos abatidos foram avaliados e coletados 38 (8,3%) pulmões de suínos com áreas de consolidação pulmonar em um abatedouro na cidade da Matola, no Sul de Moçambique. As áreas de consolidação em cada lobo pulmonar foram classificadas em 4 graus de acordo com a extensão da lesão. Amostras de pulmões com consolidação foram submetidas ao exame histopatológico e IHQ para a detecção de antígenos do VIA, Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e Mycoplasma hyopneumoniae. Os pulmões coletados apresentaram áreas multifocais ou coalescentes de consolidação pulmonar, frequentemente, observadas nos lobos craniais, mediais e acessório. Estas lesões acometiam principalmente um ou três lobos pulmonares e as lesões de grau 1 e 2 foram as mais frequentes. As principais lesões histopatológicas observadas foram bronquiolite necrotizante (23/38), infiltrado de neutrófilos nos alvéolos (24/38), hiperplasia de pneumócitos tipo II (26/38), hiperplasia de tecido linfoide peribronquiolar (28/38), e pneumonia intersticial mononuclear (29/38). No exame de IHQ, antígenos do VIA foram detectados em 84.3% (32/38) dos pulmões com pneumonia, e a nucleoproteína do vírus foi visualizada, no núcleo de células epiteliais de brônquios e bronquíolos e em macrófagos alveolares. Suínos positivos para o VIA na IHQ eram provenientes do distrito de Matutuine (5/32), distrito da Moamba (2/32), distrito de Namaacha (21/32), distrito de Boane (3/32) e Cidade da Matola (1/32). Todas as amostras foram negativas para PCV2 e Mycoplasma hyopneumoniae pelo exame de IHQ. Os resultados demonstram que o VIA está presente e é causa de pneumonia em suínos em Moçambique.(AU)

Swine influenza (SI) is an acute and highly contagious disease of the respiratory tract of pigs caused by influenza A virus (IAV). The disease causes economic losses in swine production and is of great public importance for its zoonotic potential. The aim of the present study was to report IAV infection in pigs from Mozambique and characterize the anatomopathological and immunohistochemical features of associated lung lesions. Lungs from 457 slaughtered pigs were subjected to gross evaluation and 38 (8.3%) lungs with cranioventral consolidation were collected from a slaughterhouse in Matola City, southern Mozambique. Areas of consolidation in each lung lobe were classified in 4 grades according to the lesion extension. Samples with consolidated lung tissue were examined for histopathology and immunohistochemistry (IHC) for the presence of IAV, Porcine circovirus type 2 (PCV2) and Mycoplasma hyopneumoniae antigens. The lungs had multifocal to coalescing areas of consolidation observed most frequently in the cranial, middle, and accessory lobes. The lesions involved mainly one or three pulmonary lobes and grade 1 and 2 lesions were the most frequent. The main histopathological findings were necrotizing bronchiolitis (23/38), alveolar neutrophil infiltration (24/38), type II pneumocytes hyperplasia (26/38), peribronchiolar lymphoid tissue hyperplasia (28/38) and interstitial mononuclear cells infiltrate (29/38). Immunohistochemistry revealed positive staining in 84.3% (32/38) of the samples and IAV nucleoprotein was present in the nucleus of bronchial and bronchiolar epithelial cells and alveolar macrophages. Positive IHC pigs were from Matutuine district (5/32), Moamba district (2/32), Namaacha district (21/32), Boane district (3/32) and Matola city (1/32). All lung samples were immunohistochemically negative for PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae. These results demonstrate that IAV is a cause of pneumonia in pigs in Mozambique.(AU)

Infecção pelo vírus influenza A em suínos no sul de Moçambique / Influenza A virus infection in pigs in southern Mozambique

A influenza suína (IS) é uma doença aguda e altamente contagiosa do trato respiratório de suínos, causada pelo vírus influenza A (VIA). A doença provoca perdas econômicas na suinocultura e também, tem importância na saúde pública devido ao seu potencial zoonótico. O objetivo deste trabalho foi relatar a infecção pelo VIA em suínos de Moçambique e realizar a caracterização anatomopatológica e imuno-histoquímica (IHQ) das lesões pulmonares associadas. Pulmões de 457 suínos abatidos foram avaliados e coletados 38 (8,3%) pulmões de suínos com áreas de consolidação pulmonar em um abatedouro na cidade da Matola, no Sul de Moçambique. As áreas de consolidação em cada lobo pulmonar foram classificadas em 4 graus de acordo com a extensão da lesão. Amostras de pulmões com consolidação foram submetidas ao exame histopatológico e IHQ para a detecção de antígenos do VIA, Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e Mycoplasma hyopneumoniae. Os pulmões coletados apresentaram áreas multifocais ou coalescentes de consolidação pulmonar, frequentemente, observadas nos lobos craniais, mediais e acessório. Estas lesões acometiam principalmente um ou três lobos pulmonares e as lesões de grau 1 e 2 foram as mais frequentes. As principais lesões histopatológicas observadas foram bronquiolite necrotizante (23/38), infiltrado de neutrófilos nos alvéolos (24/38), hiperplasia de pneumócitos tipo II (26/38), hiperplasia de tecido linfoide peribronquiolar (28/38), e pneumonia intersticial mononuclear (29/38). No exame de IHQ, antígenos do VIA foram detectados em 84.3% (32/38) dos pulmões com pneumonia, e a nucleoproteína do vírus foi visualizada, no núcleo de células epiteliais de brônquios e bronquíolos e em macrófagos alveolares. Suínos positivos para o VIA na IHQ eram provenientes do distrito de Matutuine (5/32), distrito da Moamba (2/32), distrito de Namaacha (21/32), distrito de Boane (3/32) e Cidade da Matola (1/32). Todas as amostras foram negativas para PCV2 e Mycoplasma hyopneumoniae pelo exame de IHQ. Os resultados demonstram que o VIA está presente e é causa de pneumonia em suínos em Moçambique.(AU)

Swine influenza (SI) is an acute and highly contagious disease of the respiratory tract of pigs caused by influenza A virus (IAV). The disease causes economic losses in swine production and is of great public importance for its zoonotic potential. The aim of the present study was to report IAV infection in pigs from Mozambique and characterize the anatomopathological and immunohistochemical features of associated lung lesions. Lungs from 457 slaughtered pigs were subjected to gross evaluation and 38 (8.3%) lungs with cranioventral consolidation were collected from a slaughterhouse in Matola City, southern Mozambique. Areas of consolidation in each lung lobe were classified in 4 grades according to the lesion extension. Samples with consolidated lung tissue were examined for histopathology and immunohistochemistry (IHC) for the presence of IAV, Porcine circovirus type 2 (PCV2) and Mycoplasma hyopneumoniae antigens. The lungs had multifocal to coalescing areas of consolidation observed most frequently in the cranial, middle, and accessory lobes. The lesions involved mainly one or three pulmonary lobes and grade 1 and 2 lesions were the most frequent. The main histopathological findings were necrotizing bronchiolitis (23/38), alveolar neutrophil infiltration (24/38), type II pneumocytes hyperplasia (26/38), peribronchiolar lymphoid tissue hyperplasia (28/38) and interstitial mononuclear cells infiltrate (29/38). Immunohistochemistry revealed positive staining in 84.3% (32/38) of the samples and IAV nucleoprotein was present in the nucleus of bronchial and bronchiolar epithelial cells and alveolar macrophages. Positive IHC pigs were from Matutuine district (5/32), Moamba district (2/32), Namaacha district (21/32), Boane district (3/32) and Matola city (1/32). All lung samples were immunohistochemically negative for PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae. These results demonstrate that IAV is a cause of pneumonia in pigs in Mozambique.(AU)

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE ENSAIO DE RT-PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DOS SUBTIPOS DO VÍRUS INFLUENZA A (H1/H3, N1/N2) CIRCULANTES EM SUÍNOS NO BRASIL

A influenza é uma doença respiratória viral aguda que afeta várias espécies de aves e mamíferos, incluindo o homem. A doença em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), tendo um impacto econômico significativo nos rebanhos suínos afetados, além de representar uma ameaça à população humana devido ao seu potencial pandêmico e zoonótico. Muito embora os subtipos virais globalmente prevalentes em suínos sejam o H1N1, H1N2 e H3N2, estes são geneticamente e antigenicamente distintos, de acordo com a região geográfica de origem. Estudos recentes realizados com isolados do IAV de suínos confirmaram que as linhagens virais detectadas no Brasil são restritas ao território brasileiro, não sendo encontrados vírus semelhantes em suínos de outros países. Desta forma, um teste de diagnóstico rápido, que seja capaz de detectar e diferenciar o subtipo do IAV em suínos é importante para o monitoramento e controle da infecção em rebanhos suínos. Além disto, no Brasil não existem testes rápidos disponíveis comercialmente, como RT-qPCR para subtipar o IAV em amostras clínicas de suínos. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e validar dois ensaios de RT-qPCR multiplex (um para a hemaglutinina viral H1pdm, H1hu, H3; e outro para a neuraminidase viral N1pdm, N1hu, N2) para a detecção e diferenciação dos subtipos H1N1, H1N2 e H3N2 do IAV circulantes em suínos no Brasil. A especificidade analítica da técnica foi de 100%, na correta identificação do subtipo e linhagem viral em 85 IAVs previamente caracterizados por sequenciamento genômico. O ensaio apresentou 100% de especificidade diagnóstica em 50 amostras negativas para o IAV e positivas para outros patógenos de suínos. O limite de detecção da RT-qPCR variou entre 5,09x103 e 5,09x101 cópias de RNA viral/L, conforme o gene avaliado. Posteriormente, 73 amostras clínicas de suínos positivas para o IAV por RT-PCR (gene da matriz) foram testadas. A RT-qPCR multiplex identificou o subtipo e a linhagem viral em 74% das amostras clínicas analisadas, sendo que o subtipo H3N2 de origem humana (46,3%) foi o mais detectado, seguido pelo H1N1 de origen pandêmica (33,3%), H1N2 de origem humana (11,1%) e HxN1pdm (3,7%). Além disto, coinfecções (3,7%) e vírus que sofreram rearranjo gênico (1,9%) foram detectados. Portanto, o ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido e validado neste estudo mostrou-se um método rápido, muito sensível e específico para a identificação dos subtipos e linhagens do IAV em amostras de suínos. A técnica descrita é economicamente viável quando comparada a outros métodos, como o sequenciamento genômico, e uma vez implementada em laboratórios de diagnóstico, poderá fornecer informações sobre a prevalência dos subtipos virais em suínos, contribuindo para o monitoramento e vigilância da influenza em rebanhos suínos.

Influenza is an acute viral respiratory disease that affects several species of birds and mammals, including humans. The disease in pigs is caused by influenza A virus (IAV), which may has a significant economic impact on the affected swine herds, posing a threat to the human population due to its pandemic and zoonotic potential. Although the prevalent virus subtypes in swine herds worldwide are H1N1, H1N2 and H3N2, these are genetically and antigenically distinct, according to the geographic region of origin. Recent studies with IAV isolates from swine confirmed that the viral lineages detected in Brazil are restricted to the Brazilian territory, and no similar viruses were found in swine from other countries. In this way, a rapid diagnostic test, able to detect and differentiate the IAV subtype in pigs is important for the monitoring and control of the infection in swine herds. In addition, in Brazil there are no rapid tests commercially available, such as RT-qPCR, to subtype IAV in swine clinical samples. This study aimed to develop and validate two multiplex RT-qPCR assays (one for viral hemagglutinin H1pdm, H1hu, H3; and another for viral neuraminidase N1pdm, N1hu, N2) for the detection and differentiation H1N1, H1N2 and H3N2 IAV subtypes circulating in swine in Brazil. The analytical specificity of the technique was 100%, identifying the correct viral subtype and lineage in 85 IAVs previously characterized by genomic sequencing. The assay presented 100% of diagnostic specificity in 50 negative samples for IAV and positive for other swine pathogens. The limit of detection of the RT-qPCR ranged from 5.09x103 to 5.09x101 copies of viral RNA/L, according to the gene evaluated. Afterwards, 73 swine clinical samples positive for IAV by RT-PCR (matrix gene) were tested. The multiplex RT-qPCR identified the viral subtype and lineage in 74% of the clinical samples analyzed, which the human-origin H3N2 (46.3%) subtype was the most detected, followed by the pandemic-origin H1N1 (33.3%), human-origin H1N2 (11.1%) and HxN1pdm (3.7%). In addition, co-infections (3.7%) and reassortant viruses (1.9%) were detected. Therefore, the multiplex RT-qPCR assay developed and validated in this study showed to be a rapid, very sensitive and specific method for IAV subtyping and lineages identification in swine samples. The technique described is cost-effective when compared to other methods, such as genomic sequencing, and once implemented in diagnostic laboratories, may provide information on the prevalence of viral subtypes in pigs, contributing to the monitoring and surveillance of influenza in swine herds.

Swine Influenza Virus: Standardization of a nested RT-PCR and subtyping of field samples circulating in Brazil from 2012-2018

O vírus influenza A (IAV) causa doença respiratória aguda em suínos, caracterizada por alta morbidade nos rebanhos. Os IAVs possuem RNA segmentado de senso negativo, contribuindo para mutações e rearranjos genéticos do vírus. As glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os principais alvos da resposta imune do hospedeiro, e mutações nas mesmas contribuem para a diversidade genética do IAV. Três subtipos do vírus da influenza suína (SIV) circulam mundialmente nos suídeos: H1N1, H1N2 e H3N2. A rápida identificação dos subtipos é importante para monitorar o SIV, auxiliando na detecção de possíveis surtos e variações antigênicas virais. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste de RT-PCR para detectar subtipos de SIV presentes no Brasil, analisando suas distribuições combinada a dados sorológicos dos anos de 2012-2018. O delineamento de primers específicos para regiões de HA, foi realizado a partir de sequências de amostras brasileiras previamente depositadas no GenBank. Amostras caracterizadas de H1N1pdm09, H3N2 e H1Delta foram utilizadas como referências. Realizou-se uma primeira (One Step RT-PCR) e uma segunda (Nested PCR) reação para padronizar o teste. Noventa e duas amostras de campo, positivas para IAV, dos anos de 2012 a 2018, foram utilizadas para validar o RT-PCR. A sensibilidade foi avaliada a partir do teste de limite de detecção e a especificidade a partir de ensaios de primers cruzados nas amostras controle. Os produtos de PCR amplificados, a partir das amostras de campo, foram sequenciados, realizando-se a análise filogenética, bem como o cálculo do p-distance entre amostras de mesmo subtipo. Sequências parciais de HA, das amostras de H1pdm do estudo e de amostras de outros anos, foram traduzidas e comparadas. Subtipagem do gene N de amostras positivas para H1Delta foi executada. Realizou-se análises sorológicas em 949 amostras de soro obtidas nos anos de 2017-2018, avaliando a presença de anticorpos contra H1N1pdm09 e H3N2 pelo teste de Inibição da Hemaglutinação (HI). O teste Nested foi mais sensível que a reação One-step. Não houve amplificação cruzada inespecífica. Setenta e uma (71/92-77%) das amostras de campo foram subtipadas pelo Nested RT-PCR, sendo 14 (14/71-20%) coletadas em 2012-2013, 35 (35/71-49%) em 2014-2015, e 22 (22/71-31 %) em 2017-2018. Em 2012-2015, a maioria foram positivas para H1N1pdm09, seguido de H1Delta e H3N2, havendo também co-infecção de H1N1pdm09+H3N2 e H1N1pdm09+H1Delta. Em 2017-2018 observou-se mais amostras positivas para H1Delta, seguido de H1N1pdm e H3N2, sendo co-infecção também foi observada. Das amostras positivas para H1Delta, apenas 57% (12/21) foram subtipadas para o gene N, a maioria positiva para N2. Das amostras de soro analisadas, 716 foram positivas para IAV, e em 2017 e 2018 a ocorrência de H3N2 foi maior que a de H1N1pdm09 bem como a co-infecção por H1N1pdm09 e H3N2. Pela análise filogenética, sequências parciais de cada subtipo analisado se agruparam em grupos semelhantes. Na análise de p-distance identificou-se dissimilaridade entre as amostras de H1Delta e de H1N1pdm09 nos períodos analisados. O alinhamento de aminoácidos de sequências parciais de H1N1pdm de diferentes anos, mostraram variações residuais, especialmente em sítios antigênicos. A técnica de Nested RT-PCR mostrou-se rápida, sensível e específica, sendo recomendada para a subtipagem de SIV. Existe a circulação de quatro subtipos de SIV no Brasil. Nos anos de 2012-2015 uma maior ocorrência de H1N1pdm foi evidenciada, porém o H3N2 foi o mais observado em 2017-2018. A análise de resíduos de aminoácidos das sequências de H1N1pdm demonstrou substituições pontuais entre amostras de diferentes anos, sugerindo a evolução do vírus ao longo do tempo. Estudos relacionados à caracterização genética de SIVs circulantes no Brasil são essenciais para entender a evolução dos vírus e suas características antigênicas

Influenza A virus (IAV) causes an acute respiratory disease in pigs, characterized by high morbidity in the herds. The IAVs have a segmented negative sense genomic RNA, which contributes to genetic mutations and virus rearrangements. The surface glycoproteins haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are the main targets of host immune response, and mutations in these glycoproteins contribute to the genetic diversity of the virus. Three subtypes of swine influenza virus (SIV) circulate worldwide in the swine population: H1N1, H1N2 and H3N2. Rapid identification of viral subtypes is important for virus monitoring, assisting the detection of possible outbreaks and viral antigenic variations. The objective of this study was to standardize a RT-PCR test for the detection of SIV subtypes present in Brazil, analyzing their distribution combined with serological data from 2012-2018. The delineation of specific primers for the HA region was carried out from sequences of Brazilian samples, previously deposited at GenBank database. Characterized samples of H1N1pdm09, H3N2 and H1Delta were used as references. A first (One Step RT-PCR) and a second (Nested PCR) reaction was performed to standardize the test. Ninety-two field samples, previously positive for IAV, from 2012 to 2018 were used for the test validation. Sensitivity was assessed from the detection limit test and specificity from cross primer assays in control samples. The amplified PCR products from the field samples were sequenced and phylogenetic analysis was performed, as well as the p-distance calculation between samples of the same subtype. Partial HA sequences of H1pdm, from samples of the study and from other years, were translated and compared. Subtyping the N gene of H1Delta positive samples was performed. Serological analyzes were performed on 949 serum samples obtained from 2017-2018, evaluating the presence of antibodies against H1N1pdm09 and H3N2 by the Hemagglutination Inhibition (HI) test. The Nested test was more sensitive than the One-step reaction. There was no nonspecific cross amplification. Seventy-one (71/92-77%) of the field samples were subtyped by the Nested RT-PCR, 14 (14/71-20%) collected in 2012-2013, 35 (35/71- 49%) in 2014-2015, and 22 (22/71-31%) in 2017-2018. In 2012-2015, most of the samples were positive for H1N1pdm09, followed by H1Delta and H3N2, with H1N1pdm09 + H3N2 and H1N1pdm09 + H1Delta co-infection. In 2017-2018, there were more positive samples for H1Delta, followed by H1N1pdm and H3N2, and co-infection was also observed. From the H1Delta positive samples, only 57% (12/21) were subtyped for the N gene, with the majority positive for N2. A total of 716 serum samples were positive for IAV, and in 2017-2018 the occurrence of H3N2 was higher than H1N1pdm09 as well as the co-infection between H1N1pdm09+H3N2. By the phylogenetic analysis, partial sequences of each analyzed subtype have grouped into similar clusters. The p-distance analysis identified dissimilarity between samples into the H1Delta cluster and samples into H1N1pdm09 group. Amino acid alignment of H1N1pdm partial sequences, from different years, showed residual variations, especially at antigenic sites. The Nested RT-PCR technique was fast, sensitive and specific, which is recommended for SIV subtyping. Four subtypes of SIV circulate in Brazil. In 2012-2015 a higher occurrence of H1N1pdm was evidenced, but H3N2 was the most observed in 2017-2018. Analysis of amino acid residues of the H1N1pdm sequences demonstrated point substitutions between samples from different years, suggesting the evolution of the virus over time. Studies related to the genetic characterization of circulating SIVs in Brazil are essential to understand the evolution of viruses and their antigenic characteristics.

Orientações para o diagnóstico de influenza em suínos / Guidelines for diagnosis of swine influenza

Este trabalho descreve a colheita adequada de amostras, as técnicas/procedimentos disponíveis para o diagnóstico de influenza A em suínos, assim como os resultados e suas respectivas interpretações, para auxiliar médicos veterinários de campo na identificação dessa doença. Em suínos vivos, as amostras adequadas são: secreção nasal, fluido oral e sangue (soro). Para suínos mortos, colher preferencialmente amostras de pulmão com consolidação cranioventral. Secreção nasal e fragmentos de pulmão refrigerado são utilizados para detectar partícula viral viável (isolamento viral - IV) ou ácido nucleico viral (RT-PCR convencional e RT-PCR em tempo real). As amostras não devem ser congeladas, pois o vírus é inativado a -20°C. A caracterização molecular dos isolados é feita pela análise filogenética obtida pelo sequenciamento de DNA. O soro é utilizado para a detecção de anticorpos (Acs) por meio do teste da inibição da hemaglutinação e ELISA. O fluido oral pode ser utilizado para detecção de anticorpo (ELISA) ou de vírus. Fragmentos de pulmão fixados em formol a 10% são examinados microscopicamente para identificar pneumonia broncointersticial e para detecção de antígeno viral pela imuno-histoquímica (IHQ). Para o sucesso do diagnóstico, as amostras devem ser colhidas de suínos que estão preferencialmente na fase aguda da doença, para aumentar as chances de detecção viral. As melhores opções para o diagnóstico de influenza A em suínos vivos são RT-PCR e isolamento viral de amostras de swab nasal ou fluido oral. Pulmão para análise por RT-PCR, isolamento viral ou IHQ é a amostra de escolha em suínos mortos. Testes sorológicos têm valor diagnóstico limitado e são utilizados apenas para determinar o estado imune do rebanho, não indicando doença clínica, pois os Acs são detectados 7-10 dias pós-infecção (fase subaguda). O diagnóstico de influenza é importante para avaliar o envolvimento desse agente no complexo de doença respiratória suína. Além disso, o isolamento do vírus influenza é essencial para o monitoramento dos principais subtipos circulantes em uma determinada região ou país, assim como para a detecção de novos rearranjos virais, já que influenza é considerada uma zoonose.(AU)

This article is intended to describe the adequate sample collection, the laboratory procedures/techniques, the expected results and their interpretation for diagnosis of influenza infection in swine, serving as a support for field veterinarians. In live pigs, the samples to be taken are nasal secretions, oral fluids and blood. For dead pigs, preference should be given to samples of cranioventral lung consolidation. Nasal discharge and chilled lung fragments are used for detection of virus (virus isolation - VI) or viral nucleic acids (conventional RT-PCR and real-time RT-PCR). Samples should not be frozen, because the virus is inactivated at -20°C. Molecular characterization of isolates is performed by phylogenetic analysis of gene sequences obtained by DNA sequencing. Serum is used for the detection of antibodies using hemagglutination inhibition (HI) test and ELISA. Oral fluid may be used for either antibody (ELISA) or viral detection. Fragments of lung fixed in 10% formaldehyde are used for histopathological analysis to identify bronchointerstitial pneumonia, and for immunohistochemistry (IHC) for antigens. For a successful diagnosis, sampling should be preferably performed in the acute phase of the disease to improve chances of virus detection. The best options to perform the diagnosis of influenza A in a swine herd are RT-PCR and VI from nasal swabs or oral fluid in live pigs and/or lung tissue for RT-PCR, VI or IHC in dead pigs. Serological tests are of very limited diagnostic value and are useful only to determine the immune status of the herd, not indicating clinical disease, because antibodies are detected after 7-10 days post infection (subacute phase). The diagnosis of influenza is important to evaluate the involvement of this agent in the complex of respiratory diseases in pigs. Furthermore, the isolation of influenza virus is essential for monitoring the main subtypes circulating in a given region or country, as well as for the detection of potential new viral reassortants, because influenza is considered a zoonosis.(AU)

Histopathological and immunohistochemical findings of swine with spontaneous influenza A infection in Brazil, 2009-2010 / Achados histopatológicos e imuno-histoquímicos de suínos com infecção espontânea de influenza A no Brasil, 2009-2010

Swine influenza (SI) is caused by the type A swine influenza virus (SIV). It is a highly contagious disease with a rapid course and recovery. The major clinical signs and symptoms are cough, fever, anorexia and poor performance. The disease has been associated with other co-infections in many countries, but not in Brazil, where, however, the first outbreak has been reported in 2011. The main aim of this study was to characterize the histological features in association with the immunohistochemical (IHC) results for influenza A (IA), porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in lung samples from 60 pigs submitted to Setor de Patologia Veterinária at the Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV-UFRGS), Brazil, during 2009-2010. All of these lung samples had changes characterized by interstitial pneumonia with necrotizing bronchiolitis, never observed previously in the evaluation of swine lungs in our laboratory routine. Pigs in this study had showed clinical signs of a respiratory infection. Swine samples originated from Rio Grande do Sul 31 (52%), Santa Catarina 14 (23%), Paraná 11 (18%), and Mato Grosso do Sul 4 (7%). Positive anti-IA IHC labelling was observed in 45% of the cases, which were associated with necrotizing bronchiolitis, atelectasis, purulent bronchopneumonia and hyperemia. Moreover, type II pneumocyte hyperplasia, alveolar and bronchiolar polyp-like structures, bronchus-associated lymphoid tissue (BALT) hyperplasia and pleuritis were the significant features in negative anti-IA IHC, which were also associated with chronic lesions. There were only two cases with positive anti-PCV2 IHC and none to PRRSV. Therefore, SIV was the predominant infectious agent in the lung samples studied. The viral antigen is often absent due to the rapid progress of SI, which may explain the negative IHC results for IA (55%); therefore, IHC should be performed at the beginning of the disease. This study has shown how important a careful histological evaluation is for the diagnosis. Since 2009, a new histological feature of swine pneumonia in animals with respiratory clinical signs has been observed in samples from pigs with clinical respiratory disease submitted to SPV-UFRGS. In addition, the results proved the importance of histological evaluation for swine herd health management.(AU)

Influenza suína (IS) é uma doença altamente contagiosa, de curso rápido e pronta recuperação, causada pelo vírus influenza tipo A (SIV). Os principais sinais clínicos são tosse, febre, anorexia e baixo desenvolvimento. A doença está presente em outros países e, geralmente, está associada com outros agentes infecciosos. No Brasil, a primeira descrição ocorreu em 2011 e foi associada ao vírus H1N1 pandêmico (pH1N1). O principal objetivo deste estudo foi caracterizar as alterações histológicas em casos de doença respiratória suína sugestiva de IS e estudar a associação dessas alterações com os resultados de imuno-histoquímica (IHQ) anti-vírus da influenza A (SIV), anti-circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e anti-vírus da síndrome reprodutiva e respiratória (PRRSV). Para tanto, foram estudadas amostras de pulmões de 60 suínos selecionadas dos materiais do arquivo do Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV-UFRGS), de casos de doença respiratória remetidos no período de 2009 a 2010 e que apresentavam alterações histopatológicas compatíveis com pneumonia viral causada pelo SIV. Todas as amostras apresentavam pneumonia intersticial e bronquiolite necrótica muito peculiar que não eram vistas antes na rotina do nosso laboratório. Trinta e uma amostras (52%) tiveram origem no estado do Rio Grande do Sul, 14 (23%) do Paraná, 11 (18%) de Santa Catarina e quatro (7%) do Mato Grosso do Sul. A IHQ para IA confirmou a presença do agente viral em 45% das amostras analisadas. Os achados histológicos mais significativos associados à IHQ positiva para IA foram bronquiolite necrótica, atelectasia, broncopneumonia purulenta e hiperemia. Por outro lado, as alterações histológicas dos pulmões estudados, mais significativamente associadas às IHQ negativa para IA foram hiperplasia dos pneumócitos tipo II, estruturas similares a pólipos em alvéolo e bronquíolo, hiperplasia de tecido linfoide associado a brônquios (BALT) e pleurite, que são alterações associadas a processos crônicos. Somente dois casos apresentaram marcação positiva na IHQ para PCV2 e nenhum pulmão foi positivo para PRRSV. Esses resultados sugerem que as lesões histológicas encontradas no presente estudo foram, predominantemente, causadas pelo SIV. Os casos negativos de IHQ para IA (55%) podem ser explicados pela ausência do antígeno viral nos tecidos estudados. Como o curso da doença é muito rápido, o teste de IHQ é mais indicado para diagnóstico no início da doença. Este estudo possibilitou demonstrar um conjunto de novas alterações histológicas pulmonares de suínos com problemas respiratórios, observadas em amostras pulmonares enviadas ao SPV-UFRGS a partir de 2009. O presente trabalho também reforça a importância de estudos histopatológicos dos casos de campo para auxiliar na monitoria da sanidade dos rebanhos suínos.(AU)