Biomedical role of L-carnitine in several organ systems, cellular tissues, and COVID-19 / Papel biomédico da L-carnitina em vários sistemas de órgãos, tecidos celulares e COVID-19

Carnitine is a conditionally necessary vitamin that aids in energy creation and fatty acid metabolism. Its bioavailability is higher in vegetarians than in meat-eaters. Deficits in carnitine transporters occur because of genetic mutations or in conjunction with other illnesses. Carnitine shortage can arise in health issues and diseases­including hypoglycaemia, heart disease, starvation, cirrhosis, and ageing­because of abnormalities in carnitine control. The physiologically active form of L-carnitine supports immunological function in diabetic patients. Carnitine has been demonstrated to be effective in the treatment of Alzheimer's disease, several painful neuropathies, and other conditions. It has been used as a dietary supplement for the treatment of heart disease, and it also aids in the treatment of obesity and reduces blood glucose levels. Therefore, L-carnitine shows the potential to eliminate the influences of fatigue in COVID-19, and its consumption is recommended in future clinical trials to estimate its efficacy and safety. This review focused on carnitine and its effect on tissues, covering the biosynthesis, metabolism, bioavailability, biological actions, and its effects on various body systems and COVID-19.

A carnitina é uma vitamina condicionalmente necessária que auxilia na geração de energia e no metabolismo de ácidos graxos. Sua biodisponibilidade é maior em vegetarianos do que em carnívoros. Déficits nos transportadores de carnitina ocorrem devido a mutações genéticas ou em conjunto com outras doenças. A escassez de carnitina pode surgir em problemas de saúde e doenças ­ incluindo hipoglicemia, doenças cardíacas, fome, cirrose e envelhecimento ­ devido a anormalidades no controle da carnitina. A forma fisiologicamente ativa da L-carnitina suporta a função imunológica em pacientes diabéticos. A carnitina demonstrou ser eficaz no tratamento da doença de Alzheimer, várias neuropatias dolorosas e outras condições. Tem sido utilizado como suplemento dietético para o tratamento de doenças cardíacas, também auxilia no tratamento da obesidade e reduz os níveis de glicose no sangue. Portanto, a L-carnitina mostra potencial para eliminar as influências da fadiga na COVID-19 e seu consumo é recomendado em futuros ensaios clínicos para estimar sua eficácia e segurança. Esta revisão enfocou a carnitina e seu efeito nos tecidos, abrangendo a biossíntese, metabolismo, biodisponibilidade, ações biológicas e seus efeitos em vários sistemas corporais e COVID-19.

Efeito da gama-orizanol e L-carnitina sob parâmetros corporais, de performance e laboratoriais em equinos quarto-de-milha praticantes de três tambores / Gamma-orizanol and L-carnitine effect under body, performance and laboratory parameters in barrel racing competitors American quarter horses

Os animais da raça quarto de milha são conhecidos por serem usados em diversas práticas e atividades, devido à sua alta ve-locidade. A constante busca pela melhora no ganho de massa muscular e recuperação em equinos, principalmente atletas, im-pulsiona as pesquisas para suplementos sem efeitos colaterais. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros clínicos e laborato-riais em animais dessa raça, suplementados com gama-orizanol e L-carnitina antes e após a execução da prova de três tambores. Esses equinos puros de origem recebiam 200 mililitros (ml) do suplemento Energy Horse® como suplementação alimentar mis-turados à ração para os estabulados, e via oral para os animais de piquete. Executaram o percurso de uma prova de tambor em pista de tamanho oficial em 3 momentos do experimento: dia 0, dia 30 e dia 60 após o tratamento. Os animais foram clinicamente exa-minados antes e após os exercícios (coloração de mucosas ocular e oral; frequência cardíaca; frequência respiratória; e motilidade intestinal), além da pesagem e coleta de sangue para dosagem de colesterol total, proteína total, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama glutamil transpeptidase (GGT), fosfatase alcalina (FA), creatinoquinase (CK) e glicose.

The American quarter horses are known by their uses in various activities, due to their high resistance and speed. The constant search for improvement in muscle mass gain and recovery in horses, mainly athletes, drives research for supplements without side effects. The objective of the present study was to evaluate clinical and laboratory parameters in these animals supplemented with gamma-orizanol and L-carnitine, before and after the execution of the barrel racing. These pure horses would receive 200 milliliters (ml) from the Energy Horse® supplement as a feed supply for animals in stable and oral feed for picket animals. The course of a race on an official track was performed in three moments of the experiment: day 0, day 30 and day 60 after treatment. Animals were clinically examined before and after exercise, in addition to heart rate, total part, total protein, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma glutamyl transpeptidase (GGT), alkaline phosphatase (ALP), creatine kinase (CK) and glucose.

Efeito da gama-orizanol e L-carnitina sob parâmetros corporais, de performance e laboratoriais em equinos quarto-de-milha praticantes de três tambores / Gamma-orizanol and L-carnitine effect under body, performance and laboratory parameters in barrel racing competitors American quarter horses

Os animais da raça quarto de milha são conhecidos por serem usados em diversas práticas e atividades, devido à sua alta ve-locidade. A constante busca pela melhora no ganho de massa muscular e recuperação em equinos, principalmente atletas, im-pulsiona as pesquisas para suplementos sem efeitos colaterais. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros clínicos e laborato-riais em animais dessa raça, suplementados com gama-orizanol e L-carnitina antes e após a execução da prova de três tambores. Esses equinos puros de origem recebiam 200 mililitros (ml) do suplemento Energy Horse® como suplementação alimentar mis-turados à ração para os estabulados, e via oral para os animais de piquete. Executaram o percurso de uma prova de tambor em pista de tamanho oficial em 3 momentos do experimento: dia 0, dia 30 e dia 60 após o tratamento. Os animais foram clinicamente exa-minados antes e após os exercícios (coloração de mucosas ocular e oral; frequência cardíaca; frequência respiratória; e motilidade intestinal), além da pesagem e coleta de sangue para dosagem de colesterol total, proteína total, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama glutamil transpeptidase (GGT), fosfatase alcalina (FA), creatinoquinase (CK) e glicose.(AU)

The American quarter horses are known by their uses in various activities, due to their high resistance and speed. The constant search for improvement in muscle mass gain and recovery in horses, mainly athletes, drives research for supplements without side effects. The objective of the present study was to evaluate clinical and laboratory parameters in these animals supplemented with gamma-orizanol and L-carnitine, before and after the execution of the barrel racing. These pure horses would receive 200 milliliters (ml) from the Energy Horse® supplement as a feed supply for animals in stable and oral feed for picket animals. The course of a race on an official track was performed in three moments of the experiment: day 0, day 30 and day 60 after treatment. Animals were clinically examined before and after exercise, in addition to heart rate, total part, total protein, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma glutamyl transpeptidase (GGT), alkaline phosphatase (ALP), creatine kinase (CK) and glucose.(AU)

DELIPIDAÇÃO QUÍMICA NA PRODUÇÃO IN VITRO E CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS

A delipidação química tem sido utilizada como alternativa para a melhoria da criotolerância em embriões produzidos in vitro (PIV). Este estudo foi realizado objetivando avaliar o efeito da L-carnitina (LC) sobre o desenvolvimento e a sobrevivência de embriões bovinos PIV vitrificados pelo método Cryotop no primeiro ensaio, e no segundo ensaio o efeito comparado da LC e Forskolin em embriões criopreservados por Cryotop (Experimento 1), ou por congelamento lento modificado (Experimento 2). Para isto foram avaliadas a atividade mitocondrial, o conteúdo de lipídeos intracitoplasmático (LI), a apoptose celular e a eclosão após o aquecimento. No primeiro ensaio a LC foi utilizada na concentração de 0,6 mg/mL no meio para maturação (MIV), cultivo (CIV) e/ou recultivo embrionário (REC), em quatro tratamentos: sem LC (Controle), LC adicionado ao CIV (LCiv), LC ao CIV+LC ao REC (LCivR), e LC ao MIV/CIV+ LC ao REC (LMivCR). A adição de LC aumentou (P <0,05) a produção de blastocistos em D7 em 28,6% (LCiv), a quantidade de embriões grau I em 36,9% (LCivR), a taxa de re-expansão em 22,7%, a eclosão em 20,1% (LCiv) e a atividade mitocondrial foi 1,9 vezes maior (P <0,001) (LCivR) em relação ao Controle. A quantidade LI foi 29% menor em LCiv e LCivR e 50,2% em LMivCR comparado Controle (P <0,001). No segundo ensaio os embriões foram cultivados sem adição de delipidadores (Controle), na presença de 10M de Forskolin adicionado ao CIV no D5 (FORSK) ou L-carnitina (0,6 mg/mL) adicionada ao CIV e ao recultivo (LC). A suplementação com LC aumentou a produção de blastocistos em D7 em 22,0% e de embriões grau I em 30,1% (P <0,05), em relação ao Controle e ao FORSK. No Experimento 1 a taxa de re-expansão no LC aumentou (P <0,05) 28,9% em relação ao FORSK. No Experimento 2 foram utilizados dois tratamentos Controle para congelamento lento (Clássico e Modificado). A eclosão após 48 horas foi maior (P < 0,05) no LC em comparação ao FORSK e aos Controles Clássico e Modificado (77,5%, 41,9%, 40,5%, 40,8% respectivamente). No tratamento LC foi observada diminuição (P < 0,05) de 64,7% na taxa de embriões degenerados em relação ao Controle Clássico. O tratamento com delipidadores reduziu o conteúdo de LI (P < 0,001) em 2,2 vezes em FORSK e quatro vezes no LC comparados ao Controle. A adição de 0,6 mg/mL de L-carnitina aos meios de cultivo e recultivo aumentou a taxa de produção in vitro de embriões bovinos atuando positivamente sobre a atividade mitocondrial, reduzindo a quantidade de lipídeos intracelulares e a apoptose e aumentando a criotolerância dos embriões submetidos ao protocolo de congelamento lento modificado.

Chemical delipidation has been used as an alternative to improve the cryotolerance of in vitro produced embryos (IVP). The aim of this study was evaluate the effect of L-carnitine (LC) on the development and survival of vitrified IVP bovine embryos by the Cryotop method in the first assay, and in the second trial the effect of LC and Forskolin on Cryotop cryopreserved embryos Experiment 1), or by modified slow freezing (Experiment 2), so mitochondrial activity, intracytoplasmic lipid (LI) content, cellular apoptosis (NCA) and hatching after heating were evaluated. In the first essay LC was used at the concentration of 0,6 mg/mL in maturation culture medium (IVM), embryo culture (IVC) and / or post-thawing (REC), in four treatments: without LC (Control), LC added to CIV (LCiv), LC to CIV + LC to REC (LCivR), and LC to MIV / CIV + LC to REC (LMivCR). The addition of LC increased the production of blastocysts in D7 by 28.6% (LCiv) and the amount of embryos grade I by 36.9% (LCivR), the re-expansion rate in 22,7% and hatching in 20.1% (LCiv), and mitochondrial activity was 1.9 times higher (P <0.001) (LCivR) than Control. The LI quantity was 29% lower in LCiv and LCivR and 50.2% in LMivCR compared Control (P <0.001). In the second experiment the embryos were cultured without addition of delipidators (Control), in the presence of 10M of Forskolin added to the IVC in D5 (FORSK) or L-carnitine (0.6 mg / mL) added to the IVC and in post-thawing (LC). LC supplementation increased the production of blastocysts in D7 by 22.0% and grade I embryos by 30.1% (P <0.05), in relation to Control and FORSK. In Experiment 1, the re-expansion rate in LC increased (P <0.05) 28.9% in relation to FORSK. In Experiment 2, two Control treatments were used for slow freezing (Classic and Modified). Hatching after 48 hours was greater (P <0.05) in LC compared to FORSK and Classical and Modified Controls (77.5%, 41.9%, 40.5%, 40.8% respectively). In the LC treatment, there was a decrease (P <0.05) of 64.7% in the degenerate embryo rate in relation to the Classical Control. Treatment with delipidators reduced LI content (P <0.001) by 2.2 fold in FORSK and four times in the LC compared to Control. The addition of 0.6 mg / mL of L-carnitine to the culture medium and the post-thawing increased the rate of in vitro production of bovine embryos acting positively on mitochondrial potential, reducing the amount of intracellular lipids and cellular apoptosis and increasing cryotolerance of embryos submitted to the modified slow freezing protocol.

"ESTUDO META-ANALÍTICO DE MODULADORES NUTRICIONAIS PARA PORCAS GESTANTES E LACTANTES"

Com o aumento da produtividade e da demanda nutricional pela fêmea suína, o uso de moduladores L-carnitina, L-arginina, cromo, somatotropina e ractopamina tem sido uma alternativa para melhorar os índices produtivos. Entretanto, a variabilidade nas informações e a complexidade dos estudos envolvendo o tema exige uma abordagem mais sistêmica. Objetivou-se por meio desta meta-análise determinar o efeito do uso de moduladores nutricionais no desempenho reprodutivo e das leitegadas de porcas em gestação e lactação. A base de dados utilizada incluiu 83 artigos publicados entre os anos de 1989 e 2017, totalizando 22.608 porcas em 534 tratamentos. Critérios foram estabelecidos para a seleção dos artigos: uso de moduladores nutricionais: L-carnitina, L-arginina, cromo, somatotropina e ractopamina; conter as variáveis corporais e reprodutivas de porcas gestantes e lactantes. A meta-análise envolveu as análises de heterogeneidade, gráfica, correlação, variância e de resíduos. Não houve correlação (P>0,05) entre o uso de moduladores nutricionais e as variáveis corporais das porcas. No estudo de correlações verificou-se que a suplementação com L-carnitina, L-arginina e cromo aumentam (>0,450; P<0,05) o peso do leitão ao nascer e número de leitões nascidos vivos e o peso dos leitões ao nascer. Já o uso de somatotropina aumenta o número de leitões desmamados (0,985; P<0,01). Não houve diferença significativa (P>0,05) entre as médias dos grupos dos tratamentos com L-carnitina, cromo, e somatotropina para o consumo de ração e condição corporal das porcas. O uso de ractopamina aumentou em 3,41 % (P<0,05) a espessura de toucinho ao parto. A suplementação com L-carnitina e cromo aumentaram em 2,30 % e 4,73 % (P<0,05) o número de leitões nascidos vivos, respectivamente. O uso da L-carnitina, arginina e somatotropina proporcionaram, em média, leitões mais pesados ao nascer em relação ao controle (1,48 vs. 1,43kg; P<0,05). A administração da somatotropina aumentou em 9,01 % (P<0,05) o número de leitões desmamados em relação ao controle. Os estudos sobre o uso de moduladores nutricionais encontrados na literatura são pouco explorados quanto a condição corporal e nutricional, o que impossibilita conclusões sobre o uso adequado destes aditivos para ajustes nutricionais em porcas gestantes e lactantes. Entretanto, os moduladores nutricionais L-carnitina, L-arginina, cromo e somatotropina podem melhorar o desempenho produtivo das porcas e de suas leitegadas.

The increase in productivity and nutritional demand by sows, the use of modulators L-carnitine, L-arginine, chromium, somatotropin and ractopamine has been an alternative to improve the productive indexes. However, the variability in information and the complexity of studies involving the subject requires a more systemic approach. The objective of this meta-analysis was to determine the effect of the use of nutritional modulators on the reproductive performance and litter of sows in gestation and lactation. The database used included 83 articles published between 1989 and 2017, totaling 22,608 sows in 534 treatments. Criteria were established for the selection of articles: use of nutritional modulators: L-carnitine, L-arginine, chromium, somatotropin and ractopamine; contain the body and reproductive variables of pregnant and lactating sows. The meta-analysis involved analyzes of heterogeneity, graph, correlation, variance and residuals. Don´t were significant correlations (P>0.05) between the body variables of the sows and nutritional modulators and their use. In correlation study, the L-carnitine, L-arginine and chromium supplementation increases (>0.450; P<0.05) the birth piglets weight and liveborn number. Somatotropin administration increased the weaner piglets number (0.985; P<0.01). There were no significant difference (P>0.05) between the means of groups with L-carnitine, chromium, and somatotropin for feed intake and body condition of the sows. Ractopamine use increased in 3.41% (P<0.05) the backfat thickness at farrowing. Supplementation with L-carnitine and chromium increased in 2.30 % e 4.73 % (P<0.05) the alive piglets number, respectively. The use of L-carnitine, L-arginine and somatotropin provided heavier piglets at birth in relation to control groups (1.48 vs. 1.43kg; P<0.05). Somatotropin administration increased in 9.01% (P<0.05) the of weaned piglets number in relation to control group. Studies on the use of nutritional modulators found in the literature are poorly explored in body and nutritional condition terms, which makes it impossible to reach conclusions about the proper use of these additives for nutritional adjustments in pregnant and lactating sows. However, the nutritional modulators L-carnitine, L-arginine, chromium and somatotropin can improve the productive performance of sows and their litters.

EFEITO DA L-CARNITINA SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN REFRIGERADO DE EQUINOS

A tecnologia de refrigeração do sêmen equino tem sido estudada pelo interesse na manutenção do potencial fertilizante dos espermatozoides. Durante o processo de refrigeração, particularmente no armazenamento do sêmen refrigerado por longos períodos, uma grande quantidade de células espermáticas perde sua capacidade fecundante. A L-carnitina (LC) desempenha papel fundamental no metabolismo espermático, pois fornece energia facilmente disponível por meio da -oxidação, afetando positivamente a motilidade espermática. Baseado nisto, o objetivo deste trabalho foi investigar a correlação entre os níveis seminais e séricos de LC e a função espermática, e avaliar os efeitos da LC sobre a qualidade de espermatozoides equinos armazenados a 5 ºC em diluidor à base de leite desnatado. Para tal, primeiramente foram utilizadas amostras de sêmen e sangue oriundas de 14 garanhões da raça Quarto de Milha, uma amostra de cada garanhão (n=14), onde o conteúdo de LC no plasma sanguíneo e no plasma seminal foi determinado por espectrofotometria. No segundo momento, quatro ejaculados de quatro garanhões da raça Quarto de Milha foram utilizados (n=16). Cada ejaculado foi dividido para formação dos grupos experimentais, os quais foram adicionados de LC: 0 (controle), 0,5, 1 e 2 mM. A motilidade espermática, a integridade da membrana plasmática e acrossomal, o conteúdo intracelular de ROS e a estabilidade da membrana plasmática foram avaliados imediatamente após atingir 5ºC (0 h) e após, 24, 48 e 72 h. Houve correlação positiva entre L-carnitina no plasma seminal e ambas a concentração espermática (r = 0,6055) e a integridade das membranas plasmática e acrossomal (r = 0,6971), sugerindo um papel para L-carnitina como marcador da qualidade do sêmen de garanhões. Além disso, a adição de L-carnitina (1 e 2 mM) ao diluidor à base de leite desnatado preservou a manutenção da motilidade de espermatozoides equinos armazenados a 5 ºC por 48 horas.

The equine sperm cooling technology has been studied in the interest of maintaining fertilizing potential of sperm over an extended period. During the cooling process, particularly in the refrigerated semen extended storage, a large portion of the sperm cells lose their fertilizing capacity. L-carnitine (LC) plays a key role in sperm metabolism, providing readily available energy through -oxidation, which positively affect sperm motility. Based on this, the objective of this study was to investigate the association between serum and seminal LC and sperm function and evaluate the effect of LC on the quality of stallions semen stored at 5 ° C in a Milk-based semen extender. To do this, first was used samples of semen and blood coming from 14 Quarter Horses stallions, where the LC content in blood plasma and seminal plasma was determined by spectrophotometry. In a second moment, ejaculated (n = 16) of four Quarter Horse stallions were used. Each ejaculate was split to formation of experimental groups which were added LC: 0 (control), 0.5, 1 and 2 mM. Sperm motility, integrity of plasmatic and acrosomal membranes, intracellular ROS content and stability of the plasmatic membrane were evaluated immediately after reaching 5 ° C (0 h) and after 24, 48 and 72 h. There was a positive correlation between L-carnitine in seminal plasma and both sperm concentration and integrity of plasmatic and acrosomal membranes, suggesting a role for L-carnitine as a marker of semen quality of stallions. Furthermore, the addition of L-carnitine (1 and 2mM) in Milk-based semen extender preserved the maintenance of equine sperm motility stored at 5 ° C.

Efeito de agentes delipidantes durante o cultivo no desenvolvimento embrionário e conteúdo lipídico de embriões bovinos produzidos in vitro.

A criopreservação de embriões produzidos in vitro (PIV) é afetada pelas altas concentrações de gotículas lipídicas que se acumulam no interior dos blastômeros. A remoção parcial de lipídios intracitoplasmáticos, por estímulo da lipólise química no citoplasma celular ou pela diminuição da captação e síntese de ácidos graxos pelas células, pode ser uma alternativa para melhorar a criopreservação desses embriões. Neste sentido, objetivou-se estimar o efeito de alguns agentes delipidantes, L-carnitina e o isômero trans-10 cis-12 do ácido linoleico conjugado (CLA), durante o cultivo na quantidade, qualidade e conteúdo lipídico de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram utilizados 2.448 ovócitos de grau 1 e 2 obtidos de ovários de abatedouro, que foram maturados in vitro por 24h a 38,5ºC, 5% de CO2. Após a co-incubação dos complexos cumulus ovócitos (COC) com os espermatozoides (16-18 horas), os possíveis zigotos foram distribuídos em quatro tratamentos: T1) Controle (n=616): meio fluido de oviduto sintético (SOF), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB); T2) L-carnitina (n=648): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 0,6 mg mL-1de L-carnitina; T3) CLA (n=627): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 100 M de trans-10 cis-12 CLA; e T4) L-carnitina+CLA (n=597): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 0,6 mg mL-1de L-carnitina e 100 M de trans-10 cis-12 CLA. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas no dia 2 e dia 7 de cultivo e, os blastocistos expandidos (Bx) foram armazenados para quantificação de lipídios utilizando o corante Sudan Black B. Os dados de produção de embriões foram analisados pelo teste Chi-quadrado (P<0,05) e os de quantificação de lipídios por análise de variância (ANOVA) (P<0,05). A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre todos os tratamentos (T1=95±4,3; T2=95±3,5; T3=95±3,7 e T4=95±3,1). A taxa de blastocisto foi superior (P<0,05) no grupo controle do que nos demais tratamentos que não diferiram (P>0,05) entre si tanto no D6 (T1=19±2,7; T2=13±2,4; T3=14±2,6 e T4=13±2,6), quanto no D7 (T1=49±3,5; T2=39±3,0; T3=42±3,9 e T4=39±3,9). Não foi observada diferença entre os tratamentos (P>0,05) quanto à velocidade de desenvolvimento, sendo que em todos os grupos a maioria dos embriões de D7 encontravam-se no estágio de blastocisto expandido. Os embriões do T2 apresentaram menor quantidade de lipídios no citoplasma do que os de T1 (P=0,0138) e de T3 (P=0,0261), sendo que os do T4 foram semelhantes (P>0,05) aos demais tratamentos. Os resultados obtidos indicaram que a suplementação com agentes delipidantes não afeta a qualidade, mas afeta negativamente a produção de embriões. Entretanto, a presença de L-carnitina durante o cultivo in vitro (CIV) diminuiu a quantidade de lipídios sugerindo que sua utilização pode resultar em embriões com maior resistência a criopreservação.

Cryopreservation of in vitro produced (IVP) embryosis affected by the high concentrations of lipid droplets that accumulate inside the blastomeres. Therefore, the partial removal of intracytoplasmic lipids by chemical lipolysis stimulation or by decreasing uptake or synthesis of fatty acids by cells can be an alternative to improve cryopreservation of IVP embryos. For that, this study aimed to evaluate the effect of some delipidant agents, L-carnitine and the trans-10 cis-12 isomer conjugated linoleic acid (CLA), during culture on the quantity, quality and lipid content of bovine embryos produced in vitro. A total of 2,448 oocytes graded 1 and 2, obtained from slaughterhouse ovaries were matured in vitro for 24 hours at 38.5 ° C, 5% CO2. After co-incubation (16-18 hours) of sperm and cumulus oocyte complex (COC), the presumptive zygotes were distributed into four treatments: T1) Control (n=616): sinthect oviduct fluid (SOF) medium supplemented with 5% bovine calf serum (FCS); T2) L-carnitine (n=648): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 0.6 mg ml-1 of L-carnitine; T3) CLA (n=627): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 100 uM trans-10 cis 12 CLA; and T4) L-carnitine + CLA 2 (n=597): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 0.6 mg ml-1 of L-carnitine and 100 uM of trans-10 cis-12 CLA. The cleavage and blastocyst rates were evaluated on day 2 and day 7 of culture, and expanded blastocysts (Bx) were stored for lipid quantification by Sudan Black B stain. Embryo production data were analyzed by Chi-square test (P<0.05) and lipids quantification by analysis of variance (ANOVA) (P<0.05). Cleavage rate was similar (P>0.05) among all treatments (T1=95±4.3; T2=95±3.5; T3=95±3.7 e T4=95±3.1). Blastocyst rate was higher (P<0.05) on the control group than the other treatments, wich were similar (P>0.05) among on D6 (T1=19 ± 2.7; T2=13±2.4; T3=14±2.6 and T4=13±2.6) and on D7 (T1=49±3.5; T2=39±3.0; T3=42±3.9 and T4=39±3.9). There was no difference between treatments (P>0.05) on the development speed, and for all treatments the majority of D7 embryos were already on expanded blastocyst stage. Embryos from T2 showed lower cytoplasmic lipids than those from T1 (P=0.0138) and T3 (P=0.0261), being T4 similar to all treatments. The results suggested that supplementation with delipidant agents had not affected quality but had negatively affected embryo production. However, the presence of L-carnitine during in vitro culture (CIV) decreased the amount of lipids, suggesting that its use can result in bovine IVP embryos more resistant to cryopreservation.

ADIÇÃO DE ÁCIDO LINOLÊNICO E L-CARNITINA NA MATURAÇÃO OOCITÁRIA: EFEITOS SOBRE O METABOLISMO CELULAR, POTENCIAL DE DESENVOLVIMENTO E CRIOTOLERÂNCIA DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

Com o intuito de aperfeiçoar os resultados da criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV), este estudo foi conduzido com o objetivo principal de avaliar o impacto da suplementação do meio de maturação in vitro (MIV) com ácido linolênico (ALA), associado ou não à L-carnitina (L-car), sobre a maturação e qualidade do oócito, especialmente no que se refere ao metabolismo lipídico, e sobre o desenvolvimento e resistência à criopreservação dos embriões produzidos. Para tanto, em uma primeira etapa (Experimentos I e II) foram realizados experimentos de dose-resposta para determinar as concentrações ideais de ALA (0, 10, 50 ou 100 µM) e L-car (0, 1, 5 ou 10 mM) a serem adicionadas ao meio de MIV, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) ou 0,6% de albumina sérica bovina (BSA). Foram avaliados os efeitos do ALA e L-car sobre a maturação nuclear e citoplasmática (avaliação mitocondrial, acúmulo lipídico intracelular e produção de espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS) em oócitos bovinos) e o subsequente desenvolvimento embrionário. No Experimento I, a adição de 100 µM de ALA em meio de MIV suplementado com SFB resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático e do acúmulo intracelular de ROS, assim como aumento (P<0,05) do potencial de membrana mitocondrial (PMM), em relação às demais concentrações de ALA. No entanto, nenhum desses efeitos prejudicou (P>0,05) a maturação oocitária e o subsequente potencial de desenvolvimento embrionário. No Experimento II, a suplementação do meio de MIV com L-car resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático, na presença de SFB. Somados os efeitos da concentração de 10 mM de L-car na presença de SFB sobre a redução (P<0,05) do PMM e elevação (P<0,05) do conteúdo de ROS e, do efeito negativo (P<0,05) da suplementação do meio de MIV com BSA sobre o desenvolvimento embrionário, conclui-se que a suplementação com 5 mM de L-car na presença de SFB superou os resultados dos demais grupos. Em uma segunda etapa (Experimento III), baseado nos resultados dos experimentos anteriores foi avaliado o efeito da suplementação com ALA (100 µM), L-car (5mM) ou a associação de ambos os tratamentos (ALA + L-car), durante o cultivo de MIV com 10% de SFB, sobre o subsequente desenvolvimento in vitro, qualidade embrionária (avaliada pela contagem do número total de células e taxa de apoptose), conteúdo intracelular de ROS e acúmulo lipídico intracitoplasmático, além da criotolerância embrionária. Para tanto, oócitos foram fecundados durante 24 horas e os prováveis zigotos cultivados in vitro (CIV). Foram avaliadas a taxa de clivagem (48 hpi) e o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (D7 do CIV). Estes foram vitrificados e posteriormente reaquecidos para avaliação da sobrevivência embrionária pós-criopreservação, após 24 h e, taxa de eclosão após 48 h de re-cultivo in vitro. Também nesta etapa, foi avaliada a regulação da expressão de genes envolvidos com o metabolismo lipídico (regulação da lipogênese: SCD1, FASN e SREBP1; regulação da via metabólica de -oxidação: CPT1B e CPT2), em oócitos suplementados com ALA e/ou L-carnitina durante o cultivo de MIV, e nos embriões produzidos. Os tratamentos com ALA e L-car realizados na etapa de MIV não suportaram os efeitos positivos observados nos estudos anteriores sobre a redução do acúmulo lipídico e melhora do potencial de desenvolvimento oocitário. Os tratamentos não alteraram o conteúdo lipídico e consequentemente a criotolerância dos embriões resultantes. Apesar disso, houve melhora da qualidade embrionária pela redução do índice apoptótico e acúmulo de ROS. A expressão dos genes relacionados à lipogênese sofreram influência do tratamento com os suplementos realizado na MIV. Porém, para os genes relacionados à lipólise, um possível efeito positivo foi perdido e, talvez seja necessário o tratamento na etapa de CIV. Portanto, mais estudos são necessários para avaliar a etapa mais adequada da PIV para se realizar a suplementação com ALA, L-car e a associação de ambos os tratamentos, objetivando alterar o conteúdo lipídico e consequentemente a criotolerância embrionária.

In order to improve the results of cryopreservation of bovine in vitro produced (IVP) embryos, this study was conducted with the main objective to assess the impact of in vitro maturation medium (IVM) supplementation with linolenic acid (ALA), associated or not with L-carnitine (L-car), on oocyte maturation and quality, specially regarding to lipid metabolism and on development and cryoresistance of produced embryos. Therefore, in a first step (Experiments I and II) were performed dose-response experiments to determine the optimal concentrations of ALA (0, 10, 50 or 100 µM) and L-car (0, 1, 5 or 10 mM) to be added to IVM medium, supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) or 0.6% bovine serum albumin (BSA). The effects of ALA and L-car on nuclear and cytoplasmic maturation [mitochondrial evaluation, intracellular lipid accumulation and intracellular production of reactive oxygen species (ROS)] and subsequent embryonic development were evaluated. In Experiment I, the IVM supplementation with 100 mM of ALA in FCS-supplemented medium resulted in reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid and intracellular ROS accumulation, as well as, increased (P<0.05) mitochondrial membrane potential (MMP), relative to the other ALA concentrations. However, none of these effects damaged (P<0.05) oocyte maturation and the subsequent embryo development potential. In Experiment II, the IVM medium supplementation with L-car resulted in significant reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid content even in the FCS presence. Combined effects of 10 mM L-car in FCS-supplemented medium on MMP reduction (P<0.05), ROS production increase (P<0.05), and the negative effect (P<0.05) on embryonic development of BSA IVM medium supplementation, we can conclude that concentration of 5 mM L-car in the presence of FCS exceeded the results of the other groups. Based on previous experiments results, in a second step (Experiment III), the effects of supplementation with ALA (100 µM), L-car (5 mM) or a combination of both treatments (ALA + L-car) during IVM culture, with 10% FCS were evaluated on subsequent embryo development and quality (assessed by total cell number and apoptosis rate), intracellular lipid and ROS content, in addition to embryonic cryotolerance. For this, oocytes were fertilized for 24 h and the presumptive zygotes in vitro cultured (IVC). Cleavage rate (48 hpi) and embryonic development until blastocyst stage (D7 IVC) were evaluated. Blastocysts were vitrified and subsequently warmed for post-cryopreservation embryo survival evaluation, after 24 h, and hatching rate, after 48 h IVC. The gene expression regulation of lipid metabolism related genes (lipogenesis regulation: SCD1, FASN and SREBP1; -oxidation pathway regulation: CPT1B and CPT2), was also performed in this step. There were evaluated ALA and/or L-car supplemented oocytes during IVM culture, and the produced embryos. The treatments made in IVM step did not support the positive effects observed in the previous studies on the lipid content reduction and the improvement in oocyte development potential. They did not change the lipid content and therefore, embryonic cryotolerance. Despite this, there was an improvement in embryo quality by reduction of the apoptotic index and ROS production. Lipogenesis-related genes expression was influenced by the treatment conducted during IVM. However, for lipolysis-related genes, a potential positive effect was losted and, may be need the treatment on IVC step. Therefore, further studies are necessary to assess the most appropriate IVP step to perform ALA, L-car and the combination of both treatments supplementation, aiming changes in lipid content, and consequently the embryonic cryotolerance.

L-CARNITINE AND TRANS-10, CIS-12 CONJUGATED LINOLEIC ACID ON IN VITRO BOVINE EMBRYO PRODUCTION AND CRYOPRESERVATION

RESUMO ZOLINI, Adriana Moreira, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, junho de 2015. L-carnitina e ácido linoléico conjugado trans-10, cis12 na produção e criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. Orientador: Ciro Alexandre Alves Torres. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da adição de L-carnitina, um acelerador do metabolismo lipídico, e ácido linoléico conjugado (trans-10, cis-12) em diferentes fases da produção in vitro de embriões sobre o desenvolvimento e criotolerância embrionária. Em todos os experimentos, embriões foram produzidos in vitro utilizando-se complexos cumulos-oócitos (CCO) provenientes de ovários coletados em abatedouro. Foram calculadas as taxas de clivagem (dia 3 do cultivo), taxa de formação de blastocistos expandidos e blastocistos em estágio avançado de desenvolvimento (dia 7 do cultivo) em função do total de CCO inseminados. Embriões em estágio de blastocisto expandido foram coletados de cada tratamento no dia 7 do cultivo in vitro e submetidos ao congelamento lento. Avaliou-se a taxa de reexpansão e eclosão embrionária 24, 48 e 72 h após o descongelamento em função do total de embriões descongelados. No experimento 1, oócitos fertilizados foram incubados em meio de cultivo contendo diferentes concentrações de L-carnitina (0,00; 0,75; 1,50 ou 3,03 mM) suplementado ou não com 5 % de soro fetal bovino (SFB). A adição de L-carnitina ao meio de cultivo na concentração de 1,5 mM melhorou a taxa de formação de blastocistos em estágio avançado de desenvolvimento quando comparado ao grupo controle (15,2±2,0 vs. 11,2±1,5; P<0,05). A L-carnitina também apresentou efeito positivo sobre a reexpansão embrionária 24 e 48 h pós-descongelamento quando adicionada na concentração de 0,75 e 3,03 mM (77,4±4,5; 80,1±4,0 e 75,0±5,5; 78,0±4,2 vs. 64,0±4,7; 67,4±4,7) ao meio de cultivo (P<0,05). Não houve interação entre os efeitos da adição de L-carnitina e SFB ao meio de cultivo embrionário. Apesar da suplementação do meio de cultivo com SFB ter melhorado o desenvolvimento embrionário (27,2±1,1 vs. 19,4±0,9; P<0,01), houve uma redução das taxas de reexpansão 24, 48 e 72 h pós-descongelamento (65,8±2,9; 67,8±2,8; 66,0±3,0 vs. 78,1±3,8; 81,4±3,0; 79,1±3,5; P<0,01). No experimento 2, os embriões foram cultivados em meio contendo L-carnitina (0,75 mM) ou ácido linoleíco conjugado (CLA 100 mM) durante as primeiras 96 h, últimas 72 h ou durante todo o cultivo in vitro. A suplementação do meio de cultivo com L-carnitina ou CLA durante diferentes vii fases do cultivo in vitro não afetou o desenvolvimento e a criotolerância embrionária. No experimento 3, avaliou-se o desenvolvimento e a crioresistência embrionária quando oócitos foram maturados em meio suplementado com L-carnitina (3.03 mM) e/ou CLA (100 mM). L-carnitina e CLA não afetaram o desenvolvimento embrionário quando adicionados ao meio de maturação. Apesar da L-carnitina não ter afetado a a taxa de reexpansão embrionária pós-descongelamento, o CLA apresentou efeito negativo sobre a eclosão embrionária 72h pós-descongelamento (53,3±3,6 vs. 65,1±4,3; P<0,05) quando adicionado ao meio de maturação oócitaria. Como conclusão, a L-carnitina melhora a criotolerância de embriões produzidos in vitro quando adicionada à concentração de 0,75 mM ao meio de cultivo embrionário. Já o CLA apresenta efeito negativo sobre a sobrevivência embrionária após o descongelamento quando adicionado ao meio de maturação oócitaria.

ABSTRACT ZOLINI, Adriana Moreira, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, June, 2015. L-carnitine and trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid on in vitro bovine embryo production and cryopreservation. Advisor: Ciro Alexandre Alves Torres. High lipid content in embryo is associated with low freezing tolerance. This study assessed the effects of exogenous L-carnitine and trans-10, cis-12 (t10, c12) conjugated linoleic acid (CLA) on in-vitro development and cryotolerance of bovine embryos when added during different stages of in vitro production of embryos. For all experiments, embryos were produced in vitro using slaughterhouse cows oocytes. Cleavage rates on Day 3, blastocyst and advanced blastocyst (hatching/hatched blastocyst) formation rates on Day 7 were calculated from the total number of oocytes subjected to in vitro fertilization (IVF). Expanded blastocysts-stage embryos from each treatment were harvested on Day 7 and subjected to slow freezing. Embryo viability was assessed 24, 48 and 72 h after thawing. In experiment 1, fertilized oocytes were incubated with different L-carnitine concentrations (0.0, 0.75, 1.50 or 3.03 mM) in the presence or absence of fetal bovine serum (FBS). There was an improvement (P<0.05) on embryo development when 1.5 mM of L-carnitine was added to in vitro culture (IVC) medium. L-carnitine had also a positive effect (P<0.05) on post thaw embryo competence when supplemented at 0.75 and 3.03 mM during IVC. There was no interaction (P>0.05) between the effects of L-carnitine and FBS supplementation on IVC on embryo development and cryosurvival. Although FBS supplementation had increased blastocyst development (P<0.05), it reduced the reexpansion rates at 24, 48 and 72 h post thawing. In experiment 2, L-carnitine (0.75 mM) or CLA (100 mM) were supplemented during the first 96 h, last 72 h or throughout the entire IVC period. There was no effect of L-carnitine or CLA supplementation during different periods of IVC on embryo development and cryotolerance. In experiment 3, embryo development and cryosurvival were evaluated when oocytes were maturated in medium supplemented with L-carnitine (3.03 mM) or/and CLA (100 mM). No effect of L-carnitine and CLA supplementation during in vitro maturation (IVM) on IVP embryo development was detected. Although there was no effect (P>0.05) of L-carnitine supplementation on embryo cryotolerance, CLA showed a negative effect (P<0.05) on embryo cryosurvival when added during IVM. In conclusion, L-carnitine improved embryo cryosurvival ix when added at 0.75 mM during IVC and CLA supplementation during IVM has a negative effect on post thaw embryo survival.