Genetic diversity of Babesia bovis studied longitudinally under natural transmission conditions in calves in the state of Rio de Janeiro, Brazil / Diversidade genética de Babesia bovis estudada longitudinalmente em condições de transmissão natural entre bezerros no estado do Rio de Janeiro, Brasil

Serum and DNA samples from 15 naturally infected calves in Seropédica, Brazil, were obtained quarterly from birth to 12 months of age, in order to longitudinally evaluate their humoral immune response against Babesia bovis and the merozoite surface antigen diversity of B. bovis. Anti-B. bovis IgG antibodies were detected by an indirect fluorescent antibody test (IFAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Using DNA amplification, sequencing and phylogenetic analysis, the genetic diversity of B. bovis was assessed based on the genes that encode merozoite surface antigens (MSA-1, MSA-2b and MSA-2c). The serological results demonstrated that up to six months of age, all the calves developed active immunity against B. bovis. Among the 75 DNA samples evaluated, 0, 3 and 5 sequences of the msa-1, msa-2b and msa-2c genes were obtained, respectively. The present study demonstrated that the msa-2b and msa-2c gene sequences amplified from blood DNA of B. bovis-positive calves were genetically diversified. These data emphasize the importance of conducting deeper studies on the genetic diversity of B. bovis in Brazil, in order to design diagnostic antigens and vaccines in the future.(AU)

Para avaliar longitudinalmente a resposta imune humoral anti-B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, entre bezerros naturalmente infectados em Seropédica, Brasil, amostras de soro e DNA de 15 bezerros foram obtidas trimestralmente, desde o nascimento até 12 meses de idade. Anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto. Usando-se amplificação de DNA, sequenciamento e análises filogenéticas, a diversidade genética de B. bovis, com base nos genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSA-1, MSA-2b e MSA-2c) foi investigada. Os resultados da sorologia demonstraram que, até os seis meses de idade, todos os bezerros desenvolveram imunidade ativa contra B. bovis. Entre as 75 amostras de DNA avaliadas, foram obtidas 0, 3 e 5 sequências dos genes msa-1, msa-2b e msa-2c. O presente estudo demonstrou que sequências dos genes msa-2b e msa-2c amplificadas a partir de amostras de sangue positivas para B. bovis de bezerros de Seropédica, foram geneticamente distintas. O presente trabalho realça a importância de se realizar estudos aprofundados sobre a diversidade genética de B. bovis no Brasil, objetivando o desenvolvimento de antígenos para o diagnóstico e vacinas no futuro.(AU)

Longitudinal evaluation of humoral immune response and merozoite surface antigen diversity in calves naturally infected with Babesia bovis, in São Paulo, Brazil / Avaliação longitudinal da resposta immune humoral e diversidade de antígenos de superfície de merozoítos em bezerros naturalmente infectados com Babesia bovis, em São Paulo, Brasil

Babesiosis is an economically important infectious disease affecting cattle worldwide. In order to longitudinally evaluate the humoral immune response against Babesia bovis and the merozoite surface antigen diversity of B. bovis among naturally infected calves in Taiaçu, Brazil, serum and DNA samples from 15 calves were obtained quarterly, from their birth to 12 months of age. Anti-B. bovis IgG antibodies were detected by means of the indirect fluorescent antibody test (IFAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The polymerase chain reaction (PCR) was used to investigate the genetic diversity of B. bovis, based on the genes that encode merozoite surface antigens (MSA-1, MSA-2b and MSA-2c). The serological results demonstrated that up to six months of age, all the calves developed active immunity against B. bovis. Among the 75 DNA samples evaluated, 2, 4 and 5 sequences of the genes msa-1, msa-2b and msa-2c were obtained. The present study demonstrated that the msa-1 and msa-2b genes sequences amplified from blood DNA of calves positive to B. bovis from Taiaçu were genetically distinct, and that msa-2c was conserved. All animals were serologically positive to ELISA and IFAT, which used full repertoire of parasite antigens in despite of the genetic diversity of MSAs.(AU)

A babesiose é uma doença infecciosa economicamente importante que afeta o gado bovino em todo o mundo. Para avaliar longitudinalmente a resposta imune humoral contra B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, entre bezerros naturalmente infectados em Taiaçu, Brasil, amostras de soro e DNA de 15 bezerros, foram obtidos trimestralmente, desde o nascimento até aos 12 meses de idade. Os anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto. A Reação em Cadeia da Polimerase foi utilizada para investigar a diversidade genética de B. bovis, com base em genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSA-1, MSA-2b e MSA-2c). Os resultados da sorologia demonstraram que até seis meses de idade todos os bezerros desenvolveram imunidade ativa contra B. bovis. Entre as 75 amostras de DNA avaliadas, foram obtidas 2, 4 e 5 sequências dos genes msa-1, msa-2b e msa-2c. O presente trabalho demonstrou que as sequências dos genes msa-1 e msa-2b amplificadas do DNA do sangue de amostras positivas a B. bovis de bezerros de Taiaçu foram geneticamente distintas, e msa-2c conservadas. Todos os animais foram soropositivos ao ELISA e ao IFAT, os quais utilizaram o repertório completo de antígenos parasitários, apesar da diversidade genética dos MSAs.(AU)

DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia bovis EM BEZERROS NATURALMENTE INFECTADOS DAS REGIÕES DE SÃO PAULO E RIO DE JANEIRO, BRASIL

A babesiose é uma doença infecciosa economicamente importante que afeta o gado bovino em todo o mundo, endêmica e importante causa de morbidade e mortalidade em bovinos no Brasil. A doença é causada por Babesia bigemina e B. bovis, protozoários parasitas intraeritrocíticos do filo Apicomplexa, agentes de enorme importância econômica em regiões tropicais e subtropicais. Merozoitos de B. bovis possuem em sua superfície, pelo menos, cinco glico-proteínas, que pertencem à família de antígenos variáveis de superfície do merozoíto (VMSA). A família VMSA de B. bovis inclui os genes msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b e msa-2c. Estes antígenos são altamente imunogênicos e contêm epítopos sensíveis à neutralização e, por conseguinte, têm sido considerados como antígenos candidatos para o desenvolvimento de vacinas de subunidades contra B. bovis. No entanto, estes antígenos de superfície são geneticamente diversificados entre diferentes isolados de B. bovis, O que resulta em diferenças antigénicas entre vários isolados de B. bovis. A fim de avaliar a resposta imune humoral contra B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, amostras de soro e DNA de sangue de 30 bezerras, sendo 15 da Fazenda Pesagro, Seropédica, Rio de Janeiro, e outras 15 da Fazenda Germânia, Taiaçu, São Paulo, foram obtidas trimestralmente, desde o nascimento até aos 12 meses de idade. Os Anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto (IELISA). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi utilizada com o objetivo de avaliar a diversidade genética de B. bovis, com base em genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSAs). Os resultados da sorologia demonstram que, a partir dos seis meses de idade, todas as bezerras foram soropositivas para B. bovis. Entre as 150 amostras de DNA testadas para a presença de três fragmentos de genes de msa de B. bovis, amplicons positivos foram obtidos em 14 amostras para msa-1, 24 para msa-2b e 34 para msa-2c de bezerras da Fazenda Pesagro e em 9 amostras para msa-1, 28 para msa-2b e 34 para msa-2c em amostras de bezerras da Fazenda Germânia. O sequenciamento foi realizado pelo método de Sanger para os fragmentos de genes msa-2b (n = 3), msa- 2c (n = 5) de Seropédica e msa-1 (n = 2), msa-2b (n = 5), msa-2c (n = 5) de Taiaçu. A análise filogenética foi realizada pelo método de Máxima verossimilhança e modelos GTR + G, GTR + G + I e GTR + G+ I para MSA-1, MSA-2b e MSA-2c, respectivamente. As sequências de MSAs dos genes msa-2b e msa-2c de Seropédica posicionaram-se em dois clados, enquanto que as sequências de MSAs dos genes msa-1 e msa-2b de Taiaçu posicionaram-se em dois clados, e sequências do gene msa-2c agruparam-se em um único clado. Os resultados da sorologia mostram que foi atingida a estabilidade endêmica em ambas as fazendas. Com base nas sequências do gene msa-2b, amplificadas no presente estudo, e a análise filogenética, pode-se afirmar que as amostras de B. bovis das fazendas Pesagro e Germânia dividem-se em dois grupos genotipicos, havendo um genótipo compartilhado por ambas as fazendas.

Babesiosis, an economically important infectious disease that affects cattle worldwide, is endemic and important cause of morbidity and mortality of cattle in Brazil. The disease is caused by Babesia bigemina and B. bovis, apicomplexan intraerythrocytic protozoa parasites, which are agents of huge economic importance in tropical and subtropical regions. B. bovis merozoites present at least five (glyco-) proteins on their surfaces, which belong to a family of variable merozoite surface antigens (VMSA). The members of the VMSA family consist of merozoite surface antigen msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b, and msa-2c. These antigens are highly immunogenic and contain neutralization-sensitive epitopes, and therefore have been considered as candidate antigens for developing subunit vaccines against B. bovis. However, these surface antigens are genetically diverse among different isolates of B. bovis, which results in antigenic differences among various B. bovis isolates. In order to evaluate the humoral immune response against B. bovis and genetic diversity of merozoite surface antigens of B. bovis, serum and DNA blood samples of 30 dairy calves, 15 from Seropedica, state of Rio de Janeiro, and the other 15 from a herd located in Taiaçu, state of São Paulo were obtained quarterly, since the birth up to 12 months of age. IgG antibodies to B. bovis were detected by Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay (ELISA) tests. Polymerase Chain Reaction (PCR) was used aiming to assess the genetic diversity of B. bovis, based on genes that encode merozoite surface antigens (MSAs). The serology results demonstrate that up to six months of age all calves were seropositive to B. bovis. Among the 150 DNA blood samples tested for the presence of three B. bovis-msa gene fragments, positive amplicons were obtained in 14 samples for msa-1, 24 samples for msa-2b and 34 for msa-2c from calves of Pesagro herd, 9 samples for msa-1, 28 for msa-2b and 34 for msa-2c from calves of Germânia herd. Sequencing, by Sanger method, was performed for msa-2b (n=3), and msa-2c (n=5), genes fragments of Seropedica and msa-1(n=2), msa-2b (n=5), and msa-2c (n=5), genes fragments of Taiaçu. The phylogenetic analysis was performed by Maximum Likelihood method and models GTR+G, GTR+G+I and GTR+G+I for MSA-1, MSA-2b and MSA-2c, respectively. The Seropedica MSAs sequences namely msa-2b and msa-2c were positioned in two clades, and a Taiaçu MSAs sequence, that is msa-1 and msa-2b, were positioned in two clades, while msa-2c sequences were all grouped in only one clade. Serology results show that endemic stability has been achieved in both farms. Based on the msa-2b gene sequences amplified in the present study, and the phylogenetic analysis, it can be stated that the B. bovis samples from the Pesagro and Germânia farms are classified into two genotypic groups, having one genotype shared by both farms.