Resumo
As células-tronco de origem mesenquimal provenientes do tecido endometrial (CTMsE) e seu meio condicionado (MC) apresentam propriedades terapêuticas, e são alternativas promissoras para estudos na medicina veterinária. Estudos envolvendo CTMsE e seu MC ainda são considerados escassos na espécie bovina até o presente momento. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de diferenciação, perfil imunofenotípico, estabilidade cromossômica, eficiência de clonicidade, resposta à criopreservação das CTMsE de bovinos coletadas em duas fases do ciclo estral. Adicionalmente, avaliar o secretoma, produção de citocinas e de prostaglandina E2 (PGE2) das CTMsE estimuladas ou não com lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano. Para tanto, foi colhido o útero de fêmeas hígidas (Fase II n=6/ Fase III n=6) para o isolamento das CTMsE por digestão enzimática. CTMsE em primeira passagem foram avaliadas quanto ao número de cromossomos e as em segunda passagem foi conduzido o ensaio de clonicidade. As CTMsE em terceira passagem (P3) foram submetidas a diferenciação nas linhagens adipogênica, condrogênica e osteogênica e caracterizadas em relação ao perfil imunofenotípico por citometria de fluxo (CF) (vimentina, CD29, CD44, MHC-II, CD34) e imunocitoquímica (vimentina e CD44). Adicionalmente, as CTMsE em P3 foram criopreservadas utilizando-se dois meios de criopreservação e avaliadas por CF antes e após a criopreservação. Para avaliação da produção de citocinas, PGE2 e análise do secretoma, o MC das CTMsE foi colhido após 2, 6, 12 e 24 horas de desafio (grupo tratado - GT) ou não (grupo controle - GC) com LPS bacteriano. As proteínas identificadas foram classificadas de acordo com os processos biológicos, função molecular, componente celular e classe proteica. De acordo com os resultados foi observado uma população celular homogênea, com morfologia fibroblastóide e aderente ao plástico. Na análise por CF as CTMsE expressaram elevada marcação para CD29, CD44 e vimentina, baixa marcação para CD34 e ausência de expressão para o marcador MHC-II. Ainda, apresentaram estabilidade cromossômica, alta eficiência de clonicidade e diferenças (P>0.05) na produção de citocinas e PGE2 após desafio ou não com LPS. Diferenças não foram observadas (P>0.05) entre os meios ou fase após o descongelamento. Foram identificados 397 grupos de proteínas no GT e 302 no GC. Houve um enriquecimento positivo para proteínas relacionadas à resposta antibacteriana, ativação dos macrófagos, atividade de hidrolase e enzimas inibitórias no GT, e moléculas de atividade estrutural e filamentos intermediários no GC. Pode-se concluir que as CTMsE de bovinos apresentam nas condições experimentais clonicidade, multipotencialidade, estabilidade cromossômica e satisfatória resposta à criopreservação, o que corrobora para o estabelecimento de bancos de células para uso terapêutico ou novos estudos in vitro. Adicionalmente, tais células respondem ao LPS na concentração utilizada, por meio da produção de citocinas, podendo este modelo ser utilizado para avaliação da resposta inflamatória. Ainda, a secreção de proteínas principalmente relacionadas ao remodelamento, resposta imune e angiogênese fazem destas células e de seus meios, promissores para futura aplicação na terapia celular.
Mesenchymal stem cells from the endometrial tissue (MSCsE) and their conditioned medium (CM) have important therapeutic properties and are alternatives for studies in veterinary medicine. Studies involving MSCsE and its CM are still considered scarce in the bovine species until now. Thus, the aim of this study was to evaluate evaluate the potential of differentiation, immunophenotypic profile, chromosomal stability, clonicity efficiency and cryopreservation response of MSCsE from bovines collected in two phases of the estrous cycle. Additionally, to evaluate the secretoma production of cytokine and prostaglandin E2 (PGE2) of MSCsE stimulated or not with bacterial lipopolysaccharide (LPS). For this, the uterus of healthy females (Phase II n = 6 / Phase III n = 6) was collected for isolation of MSCsE by enzymatic digestion. MSCsE in first passage were evaluated for the number of chromosomes and the second passage was conducted the clonicity assay. The MSCsE in third passage (P3) were differentiated into the adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineages and characterized by the immunophenotypic profile by flow cytometry (FC) (vimentin, CD29, CD44, MHC-II, CD34) and immunocytochemistry (vimentin, CD44). Additionally, MSCsE in P3 were cryopreserved using two cryopreservation medium: and evaluated by FC before and after cryopreservation. For evaluation of cytokine, PGE2 production and analysis of the secretome, CM was collected after 2, 6, 12 and 24 hours of challenge (treated group - TG) or not (control group - CG) with LPS. The identified proteins were classified according to the biological processes, molecular function, cellular component and protein class. According to the results, was observed a homogeneous cell population, with a fibroblastoid morphology and adherent to the plastic. In FC analysis, the MSCsE expressed high labeling for CD29, CD44 and vimentin, low labeling for CD34 and absence of expression for the MHC-II marker. Still, they presented chromosomal stability, high efficiency of clonicity and differences (P<0.05) in the production of cytokines and PGE2 after stimulus or not with LPS. Differences were not observed (P>0.05) between the medium or phase after thawing. 397 groups of proteins were identified in GT and 302 in CG. There was a positive enrichment for proteins related to antibacterial response, macrophages activation, hydrolase activity and inhibitory enzymes in TG, and structural activity molecules and intermediate filaments in CG. It is possible to conclude that bovine MSCsE present in the experimental conditions clonicity, multipotentiality, chromosomal stability and satisfactory cryopreservation response, which corroborates for the establishment of cell banks for therapeutic use or new in vitro studies. Additionally, these cells respond to LPS at the concentration used, by the production of cytokines, and this model can be used to evaluate the inflammatory response.