Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.(AU)

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.

Impairment on nuclear maturation rate in oocytes from cows naturally infected by bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) / Comprometimento na taxa de maturação nuclear em ovócitos de vacas naturalmente infectadas pelo herpesvírus bovino 1 (BoHV-1)

Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) is an important bovine pathogen that is responsible for causing respiratory diseases and reproductive failures. The presence of BoHV-1 in an in vitro embryo production system affects fertilization, maturation, and embryonic development. The objective of this study was to evaluate the developmental capacity of oocytes from naturally infected cows with no reproductive history. Moreover, this study investigated the presence of viral DNA in cumulus oophorus complexes (COCs). Experimental groups were differentiated by titrating the antibodies detected through seroneutralization assays, establishing three groups: seronegative animals (titer lower than 2), low titer (2 to 8), and animals with a titer above or equal to 16. COCs were obtained from 15 donors during 22 sessions of ultrasound-guided follicular aspiration. DNA was extracted from a pool of COCs obtained from all aspirations from the same donor as well as from whole blood and nested PCR reactions were performed. Only COCs with a compact layer of cumulus cells, an intact zona pellucida, and homogeneous cytoplasm were selected for in vitro culture and evaluation of nuclear maturation rate. After culturing for 24 hours, the oocytes were fixed and stained to evaluate the meiotic cell cycle stage. Oocytes that showed a chromosomal configuration in metaphase II were considered to have reached nuclear maturation. Compared with the other groups, the oocyte nuclear maturation rate in animals with a titer greater than or equal to 16 (50%) was compromised (P<0.05). However, the viral titer did not influence the maturation rate of bovine oocytes in animals exhibiting low titration (62.2%) when compared with the control group (76.7%). Viral DNA was not observed in the blood samples but was detected in the COC pool from three seropositive donors. In view of the results obtained, we conclude that natural infections by the BoHV-1 virus can compromise the nuclear maturation rate in cows, depending on the titration levels of antibodies against the virus. Moreover, viral DNA could be present in COCs, contradicting the hypothesis that seropositive animals with no history of clinical symptomatology pose a negligible risk of transmitting BoHV-1 by COCs.(AU)

Herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) é um importante patógeno bovino, responsável por causar doenças respiratórias e falhas reprodutivas. A presença do BoHV-1 em sistema de produção in vitro de embriões afeta a fertilização, a maturação e o desenvolvimento embrionário. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de desenvolvimento de ovócitos oriundos de vacas infectadas naturalmente sem histórico reprodutivo. Além disso, este estudo investigou a presença do DNA viral em Complexos Cumulus Ooforus (COCs). Os tratamentos foram definidos a partir do título de anticorpos detectados pelos ensaios de soroneutralização, sendo estabelecidos três grupos: animais soronegativos (título menor do que 2), título baixo (2 a 8) e animais com título maior ou igual a 16. Os COCs foram obtidos de 15 doadoras durante 22 sessões de aspiração folicular guiada por ultrassom. A extração do DNA foi realizada em um pool de COCs de todas as aspirações de uma mesma doadora e no sangue total para a realização das reações de Nested-PCR. Para avaliação da taxa de maturação nuclear, foram selecionados para o cultivo in vitro somente os COCs com camada compacta de células do cumulus, zona pelúcida íntegra e citoplasma homogêneo. Após 24 horas de cultivo, os ovócitos foram fixados e corados em lâmina para a avaliação do estádio do ciclo celular meiótico. Os ovócitos que apresentaram configuração cromossômica em metáfase II foram considerados como tendo alcançado a maturação nuclear. Verificou-se comprometimento na taxa de maturação nuclear ovocitária (P<0.05) nos animais de título maior ou igual a 16 (50%). No entanto, não houve influência do título viral na taxa de maturação de ovócitos bovinos em animais que apresentaram titulação baixa (62,2%) quando comparados com o grupo controle (76,7%). O DNA viral não foi identificado nas amostras de sangue, mas foi detectado no pool de COCs de três doadoras soropositivas. Diante dos resultados encontrados conclui-se que vacas infectadas naturalmente pelo vírus BoHV-1 apresentam comprometimento na taxa de maturação nuclear, dependendo do grau de titulação de anticorpos contra o vírus. Ademais, o DNA viral pode estar presente em COCs contrariando a hipótese de que animais sorologicamente positivos e sem histórico de sintomatologia clínica oferecem risco negligível de transmissão do BoHV-1 por COCs.(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

Impairment on nuclear maturation rate in oocytes from cows naturally infected by bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) / Comprometimento na taxa de maturação nuclear em ovócitos de vacas naturalmente infectadas pelo herpesvírus bovino 1 (BoHV-1)

Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) is an important bovine pathogen that is responsible for causing respiratory diseases and reproductive failures. The presence of BoHV-1 in an in vitro embryo production system affects fertilization, maturation, and embryonic development. The objective of this study was to evaluate the developmental capacity of oocytes from naturally infected cows with no reproductive history. Moreover, this study investigated the presence of viral DNA in cumulus oophorus complexes (COCs). Experimental groups were differentiated by titrating the antibodies detected through seroneutralization assays, establishing three groups: seronegative animals (titer lower than 2), low titer (2 to 8), and animals with a titer above or equal to 16. COCs were obtained from 15 donors during 22 sessions of ultrasound-guided follicular aspiration. DNA was extracted from a pool of COCs obtained from all aspirations from the same donor as well as from whole blood and nested PCR reactions were performed. Only COCs with a compact layer of cumulus cells, an intact zona pellucida, and homogeneous cytoplasm were selected for in vitro culture and evaluation of nuclear maturation rate. After culturing for 24 hours, the oocytes were fixed and stained to evaluate the meiotic cell cycle stage. Oocytes that showed a chromosomal configuration in metaphase II were considered to have reached nuclear maturation. Compared with the other groups, the oocyte nuclear maturation rate in animals with a titer greater than or equal to 16 (50%) was compromised (P<0.05). However, the viral titer did not influence the maturation rate of bovine oocytes in animals exhibiting low titration (62.2%) when compared with the control group (76.7%). Viral DNA was not observed in the blood samples but was detected in the COC pool from three seropositive donors. In view of the results obtained, we conclude that natural infections by the BoHV-1 virus can compromise the nuclear maturation rate in cows, depending on the titration levels of antibodies against the virus. Moreover, viral DNA could be present in COCs, contradicting the hypothesis that seropositive animals with no history of clinical symptomatology pose a negligible risk of transmitting BoHV-1 by COCs.(AU)

Herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) é um importante patógeno bovino, responsável por causar doenças respiratórias e falhas reprodutivas. A presença do BoHV-1 em sistema de produção in vitro de embriões afeta a fertilização, a maturação e o desenvolvimento embrionário. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de desenvolvimento de ovócitos oriundos de vacas infectadas naturalmente sem histórico reprodutivo. Além disso, este estudo investigou a presença do DNA viral em Complexos Cumulus Ooforus (COCs). Os tratamentos foram definidos a partir do título de anticorpos detectados pelos ensaios de soroneutralização, sendo estabelecidos três grupos: animais soronegativos (título menor do que 2), título baixo (2 a 8) e animais com título maior ou igual a 16. Os COCs foram obtidos de 15 doadoras durante 22 sessões de aspiração folicular guiada por ultrassom. A extração do DNA foi realizada em um pool de COCs de todas as aspirações de uma mesma doadora e no sangue total para a realização das reações de Nested-PCR. Para avaliação da taxa de maturação nuclear, foram selecionados para o cultivo in vitro somente os COCs com camada compacta de células do cumulus, zona pelúcida íntegra e citoplasma homogêneo. Após 24 horas de cultivo, os ovócitos foram fixados e corados em lâmina para a avaliação do estádio do ciclo celular meiótico. Os ovócitos que apresentaram configuração cromossômica em metáfase II foram considerados como tendo alcançado a maturação nuclear. Verificou-se comprometimento na taxa de maturação nuclear ovocitária (P<0.05) nos animais de título maior ou igual a 16 (50%). No entanto, não houve influência do título viral na taxa de maturação de ovócitos bovinos em animais que apresentaram titulação baixa (62,2%) quando comparados com o grupo controle (76,7%). O DNA viral não foi identificado nas amostras de sangue, mas foi detectado no pool de COCs de três doadoras soropositivas. Diante dos resultados encontrados conclui-se que vacas infectadas naturalmente pelo vírus BoHV-1 apresentam comprometimento na taxa de maturação nuclear, dependendo do grau de titulação de anticorpos contra o vírus. Ademais, o DNA viral pode estar presente em COCs contrariando a hipótese de que animais sorologicamente positivos e sem histórico de sintomatologia clínica oferecem risco negligível de transmissão do BoHV-1 por COCs.(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

Expressão gênica em ovócitos suínos de diferentes classificações morfológicas / Gene expression in swine oocytes in different morphological classifications

A produção in vitro de embriões suínos tem alcançado resultados insatisfatórios: ovócitos maturados in vivo produzem uma porcentagem maior de embriões em relação aos maturados in vitro. O sucesso da maturação in vitro está diretamente relacionado com a competência ovocitária. Somente ovócitos competentes são capazes de serem fecundados e terem desenvolvimento embrionário normal. A competência ovocitária pode ser avaliada por vários parâmetros. Recentemente têm sido utilizados como parâmetro os estudos da expressão de genes associados com a competência. O presente trabalho teve por objetivo avaliar diferenças na expressão dos genes BMP15, RYBP, MATER e ZAR1 em ovócitos imaturos de diferentes classes morfológicas, sendo elas: 1, 2, 3 e 4, com a finalidade de proporcionar importantes marcadores moleculares relacionados com a capacidade ovocitária. O RNA total dos ovócitos foi extraído e utilizado como molde para a síntese da primeira fita de cDNA. Os resultados da expressão gênica foram analisados utilizando-se modelo misto, considerando os dados de expressão gênica variável dependente e as classes ovocitárias variáveis independentes. Os genes BMP15, ZAR1 e RYBP apresentaram expressão semelhante nas classes ovocitárias 1, 2 e 3; somente a categoria 4 diferiu na expressão desses genes (P<0,05). O gene MATER foi expresso de forma semelhante em todas as classes ovocitárias estudadas (P>0,05). A técnica de RT-qPCR foi eficiente para detecção desses transcritos em ovócitos de diferentes classes. No entanto, para melhor entendimento do envolvimento desses transcritos na aquisição da competência ovocitária, são necessários mais estudos avaliando ovócitos de diferentes classes morfológicas, em diferentes fases de desenvolvimento, e implicação de outros genes envolvidos com a competência ovocitária.(AU)

The in vitro production of pig embryos has achieved unsatisfactory results; in vivo matured oocytes produce a higher percentage of embryos compared to in vitro maturation. The success of in vitro maturation is directly related to oocyte competence. Only competent oocytes are capable of being fertilized and have normal embryonic development. The oocyte competence can be assessed using several parameters. Recently these parameters have been used for gene expression studies associated with competence. This work aimed to evaluate differences in gene expression BMP15, RYBP, MATER, ZAR1 as endogenous control and the constitutive gene GAPDH in immature oocytes of different morphological classes which are: 1, 2, 3 and 4, in order to provide significant molecular markers linked to the ability of development. Oocytes Total RNA was extracted and used as a template for synthesis of the first cDNA strand. The results of gene expression were analyzed using a mixed model, considering the dependent gene expression data and independent ovocitary variable classes. The genes BMP15, RYBP ZAR1 and showed similar ovocitary expression in classes 1, 2 and 3 differ only in category 4 in their expression (P<0.05). The MATER gene was similarly expressed in all ovocitary classes studied (P>0.05). The RTQ-PCR technique was effective for detection of these transcripts in oocytes from different classes. However, for better understanding of the involvement of these transcripts in the acquisition of oocyte competence more studies are needed to evaluate different morphological classes of oocytes at different stages of development and the implication of other genes involved in oocyte competence.(AU)

Grb10 characterization in bovine cumulus oocyte complexes from different follicle sizes / Caracterização do Grb10 em complexos cumulus-oócito oriundos de folículos bovino de diferentes tamanhos

The objective of this study was to investigate the mRNA expression and protein localization of Grb10 gene in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) from different follicle sizes. Firstly, it was investigated the mRNA expression to correlate with maturation rates. COCs from follicles at 1-3, 4-6, 6-8 and >8mm were used to evaluate Grb10 gene expression by qRT-PCR assay and nuclear maturation rates. It was observed that more competent oocytes (from follicles at 6-8 and >8mm; P>0.05), had lower Grb10 mRNA expression levels when compared to the oocytes from follicles at 1-3 and 4-6mm (P>0.05). After it was performed an immunofluorescence analysis in COCs from different follicle sizes (1-3, 4-6, 6-8 and >8mm) to investigate Grb10 protein localization. Samples were incubated with primary antibody: Polyclonal rabbit anti-Grb10 (1:100). Primary antibody was detected using goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (1:500). Positive fluorescence signal was detected in all analyzed samples but less evident in COCs from largest follicles. These results characterized Grb10 gene in bovine COC and provide evidences for its involvement during oocyte molecular maturation.(AU)

O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de RNAm e a localização da proteína Grb10 em complexos cumulusoócito (CCO), oriundos de folículos bovinos em diferentes fases de desenvolvimento. Primeiramente, foi investigada a expressão de RNAm e relacionada com as taxas de maturação. CCOs oriundos de folículos com diâmetro de 1-3, 4-6, 6-8 e >8mm foram utilizados para avaliar a expressão de RNAm por PCR em tempo real e para analisar os estádios de maturação nuclear. Foi observado que os oócitos mais competentes para a progressão meiótica (oriundos de folículos com diâmetro de 6-8 e >8mm; P<0.05) tiveram menor expressão de RNAm para Grb10, quando comparados aos CCOs oriundos de folículos com 1-3 e 4-6mm (P<0.05). Posteriormente, foi realizada a técnica de imunofluorescência em CCOs oriundos de folículos de diferentes tamanhos (1-3, 4-6, 6-8 e >8mm) para investigar a localização da proteína Grb10. As amostras foram incubadas com o anticorpo primário: anti-Grb10 policlonal, produzido em coelho (1:100). O anticorpo primário foi detectado utilizando um anticorpo secundário, IgG anti-coelho, produzido em cabra, conjugado com Alexa Fluor 488 (1:500). A fluorescência foi detectada em todas as amostras analisadas, porém, menos evidente nos CCOs oriundos dos folículos maiores. Os resultados apresentados neste estudo caracterizam o gene Grb10 em CCOs de bovinos e fornecem evidências do seu envolvimento na maturação molecular do oócito.(AU)

EFEITO DA MELATONINA NA MATURAÇÃO IN VITRO SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA E A QUALIDADE DE OÓCITOS BOVINOS SOB CHOQUE TÉRMICO

Conduziu-se este trabalho, com o objetivo de avaliar o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico sobre sua qualidade e expressão de genes específicos. Foram aspirados folículos ovarianos, provenientes de ovários de abatedouro, com 3 a 8 mm de diâmetro. Os oócitos foram maturados sob choque térmico em meio MIV acrescido de melatonina nas concentrações 0; 10-12 ;10-9 ; 10-6 e 10-3 M. No controle positivo, os oócitos foram maturados na ausência de melatonina (NS) sob condição convencional. Foram realizadas de três a seis baterias por análise. Foi considerado o delineamento em blocos ao acaso, sendo os blocos formados pelas baterias. As taxas de maturação e de apoptose, a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) e a atividade mitocondrial foram analisadas por modelos lineares generalizados pelo procedimento GLIMMIX (SAS®). Na análise de expressão gênica, foi utilizado como calibrador o tratamento NS e a eficiência do primer foi calculada pelo programa LinRegPCR, com os resultados analisados pelo software REST®. A taxa de maturação não diferiu entre oócitos maturados sob choque térmico com diferentes concentrações de melatonina e não diferiu entre oócitos dos tratamentos 0 M de melatonina sob choque térmico e 0 M de melatonina sob condição convencional. As concentrações 10-3 e 10-9 M de melatonina reduziram a taxa de maturação em relação ao NS. A melatonina não influenciou a taxa de apoptose. A taxa de apoptose do grupo NS foi menor do que a observada no grupo 0 M, mas não diferiu da observada no tratamento 10-3 M. A produção de EROS foi menor nos tratamentos 10-9 , 10-6 e 10-3 M e maior nos tratamentos 0 e 10-12 M. A atividade mitocondrial foi menor no tratamento 10-3 M em comparação aos demais tratamentos sob choque térmico. A atividade mitocondrial dos oócitos maturados com 10-12, 10-9 e 10-6 M de melatonina não diferiu da observada nos oócitos do tratamento NS. Oócitos do grupo 0 M apresentaram maior atividade mitocondrial comparado ao grupo NS. Houve sub expressão dos genes C-MOS nos tratamentos 10-9 e 10-12 M de melatonina e de MAPK no tratamento 10-12M. Os tratamentos 10-3 ; 10-6 e 10-9 M de melatonina apresentaram superexpressão do gene GDF9. Os genes ZAR1 e HSP40 não foram afetados pela adição de melatonina ao meio MIV ou pelo choque térmico. Conclui-se que a melatonina é capaz de proteger os oócitos contra prejuízos causados pelo choque térmico, sendo a concentração 10-6 M a mais eficiente.

The objective of this study was to evaluate the effect of melatonin addition to the in vitro maturation (IVM) medium of bovine oocytes subjected to heat shock on quality and expression of specific genes. Ovarian follicles from 3 to 8 mm of diameter, were aspirated from ovaries obtained in a slaughterhouse. Oocytes were matured under heat shock in IVM medium with melatonin, in the following concentrations: 0; 1012; 10-9 ; 10-6 e 10-3 M. In the positive control, oocytes were matured in the absence of melatonin (NS) on conventional condition. Three to six batteries were performed for each analysis. The randomized block design was utilized, being the blocks formed by the batteries. Maturation and apoptosis rate, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial activity were analyzed by generalized linear models through the GLIMIMIX procedure (SAS® ). To the gene expression analysis, the treatment NS was used as a calibrator and the primer efficiency was calculated through the program LinRegPCR, with the results being analyzed by the REST® software. Maturation rate did not differ between oocytes matured under heat shock with different melatonin concentration and did not differ between oocytes from treatments 0 M of melatonin under heat shock and 0 M of melatonin under conventional conditions. The concentrations 10-3 and 10-9 M of melatonin reduced the maturation rate in comparison to NS. Melatonin did not influence the apoptosis rate. Apoptosis rate from NS group was lower than observed on group 0 M, but it did not differ from the rate observed in the treatment 10-3 . ROS production was lower in the treatments 10-9 , 10-6 , and 10-3 M and greater in the treatments 0 and 10-12. Mitochondrial activity of oocytes matured at 10-12, 10- 9 , and 10-6 M of melatonin did not differ from the one observed in oocytes of treatment NS. Oocytes from group 0 M presented greater mitochondrial activity compared to oocytes from group NS. There was subexpression of genes c-MOS in the treatments 10-9 and 10-12 M of melatonin and of MAPK in the treatment 10-12 M. The treatments 10-3 ; 10-6 and 10-9 M of melatonin presented subexpression of the gene GDF-9. Genes ZAR1 and HSP40 were not affected by the melatonin addition to the IVM medium or by the heat shock. Concluding, melatonin is able to protect oocytes from the damage caused by heat shock, being the concentration 10-6 the most efficient.

Expressão gênica e potencial de desenvolvimento in vitro dos complexos cumulus-oócitos ovinos tratados com roscovitina

Esta pesquisa visou avaliar o perfil de expressão de determinados genes e o potencial de desenvolvimento in vitro de complexos cumulus-oócitos (COCs) de ovinos temporariamente bloqueados no estadio de vesícula germinativa (GV) com uso da roscovitina. Neste contexto, diferentes composições de meio (com e sem soro fetal bovino e gonadotrofinas), tempos (0, 6, 12 e 20 horas) e métodos de cultivo (com e sem cobertura de óleo mineral) foram testados com intuito de garantir a máxima eficiência de inibição meiótica promovida pela roscovitina a 75µM. A avaliação do grau de expansão das células do cumulus, em estereomicroscópio, e do estadio da maturação nuclear, por meio da coloração com Hoescht 33342, revelou que a presença ou ausência de LH, FSH e soro fetal bovino não interferiu no potencial de ação da roscovitina. No entanto, máxima eficiência inibitória foi observada em meio suplementado apenas com soro fetal bovino. Foi constatado ainda que, na ausência de óleo mineral, quantidade significativamente maior de oócitos tratados com roscovitina foi mantida em GV o que reforça a hipótese de lipossolubilidade do referido inibidor. Embora o potencial de inibição meiótica da roscovitina tenha se mantido nos diferentes tempos de cultivo, a exposição prolongada dos COCs ao inibidor afetou de maneira irreversível a expansão do cumulus. Em todas as situações, a inibição meiótica foi completamente reversível após cultivo por 18 horas em meio de maturação livre de inibidor. Sendo assim, para análise da expressão gênica e desenvolvimento embrionário in vitro, foi preconizado o tratamento com roscovitina a 75µM por 6 horas na presença de soro e sem óleo mineral. Nestas condições assim como após a reversibilidade por 18 h, a quantidade relativa da maioria dos genes investigados nas células do cumulus e nos oócitos foi similar ao observado nos COCs não inibidos (controle). Do mesmo modo, não foi constatada diferença entre o tratamento com roscovitina e o controle com relação à taxa de blastocistos e à qualidade dos embriões obtidos. Portanto, o bloqueio temporário dos COCs de ovinos no estadio de GV com roscovitina a 75 µM não melhora, mas também não afeta a expressão gênica e o potencial de desenvolvimento embrionário in vitro.

This study aimed to evaluate the expression profile of certain genes and the potential of in vitro development of sheep cumulus-oocytes complexes (COCs) temporarily arrested at germinal vesicle (GV) stage using roscovitine. In this context, different medium compositions (with and without fetal bovine serum and gonadotropins), times (0, 6, 12 and 20 hours) and methods of culture (with and without mineral oil overlay) were tested in order to ensure maximum efficiency of meiotic inhibition promoted by 75¿M roscovitine. The evaluation of cumulus expansion degree, under stereomicroscope, and nuclear maturation stage, by staining with Hoechst 33342, revealed that the presence or absence of LH, FSH and fetal bovine serum did not influence the action potential of roscovitine. However, maximum efficiency of meiotic inhibition was observed in medium supplemented with fetal bovine serum. It was also found that, in the absence of mineral oil overlay, significantly higher quantity of oocytes treated with roscovitine was kept at GV, which reinforces the hypothesis of lipo-solubility of this inhibitor. Although the potential of meiotic inhibition of roscovitine had remained at different culture times, the prolonged exposure of COCs to inhibitor irreversibly affect the cumulus expansion. In all cases, the meiotic arrest was completely reversible after culture for a further 18 h in inhibitor-free medium. Therefore, for analysis of gene expression and in vitro embryo development, it was chosen the treatment with 75¿M roscovitine for 6 h under serum-supplemented medium and without mineral oil overlay. Under these conditions as well as after the reversibility for 18 h, the relative amount of most investigated genes in cumulus cells and oocytes was similar to that observed in the uninhibited COCs (control). Similarly, no difference was found between roscovitine treatment and control with respect to blastocyst rate and quality of embryos obtained. Therefore, the temporary arrest of sheep COCs at GV stage using 75 µM roscovitine does not improve, but also does not affect the gene expression and the potential of in vitro embryo development.

PRODUÇÃO DE OÓCITOS E EMBRIÕES BUBALINOS: EFEITOS DA ÉPOCA DO ANO E DA ADIÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides NA MATURAÇÃO IN VITRO

Esta pesquisa pretendeu estabelecer estratégias para aumentar a eficiência da produção in vitro de embriões (PIVE) bubalinos. Neste contexto, avaliou a eficiência de protocolos de sincronização de doadoras de oócitos bubalinas visando aumentar a disponibilidade e qualidade dos oócitos obtidos pela aspiração folicular guiada por ultrassom (OPU) e o efeito da fonte de obtenção dos oócitos sobre a quantidade e qualidade dos mesmos. Além disso, analisou-se o efeito do fotoperíodo sobre a quantidade e qualidade do oócitos disponíveis, além da competência destes expressos pelas taxas de PIVE. Por fim, avaliou-se o efeito da adição do óleo essencial de Lippia origanoides (OELO) nas concentrações de 2,5; 5,0 e 10µg/mL, no meio de maturação in vitro (MIV) sobre as taxas de maturação oocitária, qualidade embrionária e PIVE em bovinos e bubalinos. Ovários e oócitos de animais não protocolados, protocolados por aspiração prévia dos folículos e protocolados com uso de hormônios esteróides e gonadotróficos, foram avaliados ultrassonograficamente e de acordo com a qualidade dos oócitos recolhidos por OPU. Demonstrou-se não haver variação na população folicular, no número e na qualidade dos oócitos recuperados por sessão, exceto uma redução dos folículos e oócitos Grau A foi notada quando o ciclo estral foi sincronizado por aspiração prévia dos folículos(p<0,05). Em relação a fonte de obtenção, para todos parâmetros avaliados, foi notada superioridade quando oócitos são recuperados de ovários de frigorífico(p<0,05). A qualidade dos oócitos recolhidos por OPU e a PIVE bubalinos foi influenciada pelo fotoperíodo na região estudada, elevando-se durante os meses de baixa luminosidade(p<0,05), fato não observado em bovinos. Por fim, a partir de avaliações da cromatina com DAPI, encontrou-se uma elevação da taxa de maturação nuclear em bovinos quando utilizou-se concentrações de 2,5µg/mL de OELO(p<0,05). A qualidade dos embriões, expressa pelo número de células, aumentou quando utilizou-se concentrações de 2,5 e 5µg/mL do OELO em bubalinos(p<0,05). Embora não tenha alterado a taxa final de PIVE em ambas as espécies, o OELO apresentou boas perspectivas quando acrescido aos meios MIV em razão da melhoria da qualidade embrionária e da maturação nuclear dos oócitos.

This study aimed to develop strategies to increase the efficiency of buffalo in vitro embryo production (IVEP). In this context, we evaluated the efficiency of synchronization protocols on buffalo oocyte donor aimed at increasing the availability and quality of oocytes obtained by ovum pick-up (OPU) and the effect of the source of obtaining oocytes on the quantity and quality. In addition, we analyzed the effect of photoperiod on the quantity and quality of oocytes available on ovary, beyond the competence of those expressed by the blastocyst rate. Finally, we evaluate the effect of essential oil of Lippia origanoides (EOLO) added at concentrations of 2.5, 5.0 and 10¿g/ml, on in vitro maturation (IVM) media over oocyte maturation rate, embryo quality and IVEP on cattle and buffalo. Ovaries and oocytes of animals without protocol, protocol by prior aspiration of follicles and protocol with use of steroids and gonadotropic hormones were evaluated by ultrasonography and according to the of oocyte quality. It was demonstrated not vary the follicular population, number and quality of oocytes retrieved per session between the protocols but a reduction of follicles and Grade A oocytes was noted when the follicles were aspirated previously OPU. Regarding the oocyte source (live animals and abattoir ovaries), all evaluated parameters showed superiority when oocytes were derived from abattoir ovaries. The quality of oocytes collected by OPU and IVEP buffaloes was influenced by photoperiod in the region studied, increased when daylight decreases, which was not observed in cattle. Finally, from evaluations of chromatin stained with DAPI, it was found that bovine nuclear maturation rate increased when used concentrations of 2,5¿g/ml EOLO. The quality of oocytes, expressed by cell number, increased when used concentrations of 2.5 and 5¿g/ml of EOLO in buffaloes. Although it has not changed the blastocyst rate of PIVE in both species, the EOLO has good prospects when added to IVM media.

Effect of concentration and exposure period to butyrolactone I on meiosis progression in bovine oocytes / Efeito de concentração e tempo de exposição à butirolactona I na progressão da meiose de oócitos bovinos

The effect of concentration and exposure period of bovine oocytes to butyrolactone I (BLI) on meiotic block and in vitro maturation (IVM) kinetics was studied. In experiment 1, all oocytes were at germinal vesicle stage (GV), after 6h in culture with 0, 50 and 100µM BLI. After 12h, all oocytes cultured with 50 and 100µM BLI remained in GV. After 24h, less oocytes were in GV with 50µM (82%) than with 100µM BLI (99%, P<0.05). In experiment 2, after 6h IVM, 93% of control oocytes (IVM only) were in GV, while treated oocytes (100µM BLI for 6, 12 or 24h prior to IVM) showed less oocytes in GV with increased exposure period to BLI prior to IVM (83 and 73%, for 6h and 12h, P<0.05). For a 24h inhibition, GV rates were similar to 12h (70%, P>0.05). After 18h IVM, metaphase II (MII) rates were similar for all groups (76-81%). In experiment 3, after 6h IVM, 74% of treated oocytes (50 or 100µM BLI for 12h) were in GV. This rate was lower than for control oocytes (97.3%, P<0.05). After 18h IVM more oocytes (~80%, P>0.05) were in MII with BLI than for control (73%, P<0.05). Shorter culture periods require lower BLI concentration for meiotic block; initial nuclear maturation kinetics of oocytes cultured with BLI is accelerated, and this is affected by culture period but not by drug concentration.(AU)

Estudou-se o efeito da concentração e do tempo de exposição à butirolactona I (BLI) no bloqueio meiótico e na cinética da maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. No experimento 1, todos os oócitos encontravam-se em vesícula germinativa (VG) após 6h de cultivo nas concentrações de 0,50 e 100µM BLI. Após 12h, somente oócitos cultivados com BLI (50 e 100µM) estavam em VG. Após 24h, menos oócitos tratados com 50µM (82%) estavam em VG em relação a 100µM (99%, P<0,05). No experimento 2, após 6h de MIV, 93% dos controles (somente MIV) estavam em VG, enquanto que nos tratados (100µM BLI por 6, 12 ou 24h pré-MIV), menor proporção de oócitos permaneceu nesse estádio com o aumento do tempo de exposição à BLI antes da MIV (83 e 73% para 6 e 12h, P<0,05). Com 24h de exposição, a taxa de VG foi similar à de 12h (70%, P>0,05). A taxa de metáfase II (MII, 76-81%) foi similar para todos os tempos de exposição, após 18h de MIV. No experimento 3, após 6h de MIV, menos oócitos tratados (74% para 50 ou 100µM BLI por 12h) estavam em VG comparados aos controles (97%, P<0,05). Após 18h de MIV, mais oócitos estavam em MII com BLI (~80%, P>0,05) do que os controles (73%, P<0.05). Conclui-se que para cultivos mais curtos, a concentração mais baixa de BLI bloqueia a meiose a cinética da maturação nuclear é acelerada em oócitos expostos à BLI e isso é afetado pelo tempo de cultivo, mas não pela concentração da droga.(AU)

Interação entre células do cumulus e atividade da proteína quinase C em diferentes fases da maturação nuclear de oócitos bovinos / Interaction between cumulus cells and the activity of protein kinase C at different stages of bovine oocyte nuclear maturation

Verificou-se a influência da proteína quinase C (PK-C) no reinício e na progressão da meiose em oócitos bovinos, determinando se as células do cumulus são mediadoras da PK-C na regulação da maturação dos oócitos. Complexos cumulus-oócitos (CCO) e oócitos desnudos (OD), distribuídos aleatoriamente em seis tratamentos (T) com base na presença de um ativador da PK-C (PMA) (T1 e T2), de um forbol éster incapaz de ativar a PK-C (4a-PDD-controle) (T3 e T4) ou de apenas o meio básico (TCM-199-controle) (T5 e T6), foram cultivados por 7, 9, 12, 18 e 22 horas. A percentagem de rompimento da vesícula germinativa no grupo cultivado com PMA foi maior do que nos dois grupos controle, com e sem células do cumulus. O cultivo de CCO e OD por 12 e 18 horas demonstrou que a PK-C influencia a progressão para os estádios de metáfase I (MI) e metáfase II (MII) de maneira dependente das células do cumulus. Nos períodos de 9 e 22 horas, não foi possível observar diferença entre os grupos quanto aos diferentes estádios de maturação. A ativação da PK-C acelera o reinício da meiose independentemente das células somáticas e acelera a progressão até os estádios de MI e MII na dependência das células do cumulus.(AU)

The aim of this study was to evaluate the effect of protein kinase C (PK-C) on the meiotic resumption and progression in bovine oocyte, and to determine if the cumulus cells mediate the PK-C action in the regulation of bovine oocyte nuclear maturation. Cumulus-oocyte complexes (COC) and denuded oocytes (DO), randomly allotted to 6 treatments (T) based on the presence of an activator of PK-C (PMA) (T1 and T2), or a phorbol ester unable to activate PK-C (4aPDD-control) (T3 and T4) or a basic culture medium (T5 and T6), were cultivated for 7, 9, 12, 18 and 22 hours. The percentage of germinal vesicle breakdown (GVBD) was higher when the oocytes were cultured with PMA than in the control groups with and without cumulus cells. However, PK-C was dependent of cumulus cells to affect the progression to the stages of metaphase I (MI) and metaphase II (MII) at 12 and 18 hours of culture. At 9 and 22 hours, no difference among groups was detected. PK-C accelerates the meiotic resumption independently of the somatic cells but depends on cumulus cells for the progression to the stages of MI and MII.(AU)

TÉCNICAS DE COLORAÇÃO CROMOSSÔMICA PARA ESTÁGIOS ESPECÍFICOS DA MATURAÇÃO NUCLEAR DE OÓCITOS BOVINOS

This study was designed to determine the efficiency of three different technics for staining bovine oocyte in the germinal vesicle (GV), metafase I (MI) and metafase II (MII) stages. In these stages, oocytes without cumulus cells were fixed in acetic acid:methanol (1:3) either on slides (FLL) or in petri dishes (FPL) and stained with 1% of lacmoid in phosphate buffered saline (PBS). Also, the oocytes were randomized divided in a third treatment, in which they were fixed on slides immersed in acetic acid:methanol (1:3) and stained with Giemsa (FLG). In the GV stage, the percentage of oocytes accurately identified in the FLL (93.5%) was significantly higher than in the FPL (53.1%; 2=9.84; p=0.0017) and FLG (55.2%; 2=9.03; p=0.0027) treatment groups. However, the proportion of oocytes in the MI and MII stages correctly stained with FLL technic (MI 41.7% and MII 41.9%) was statistically lower than that observed in the FPL (MI 90.0%, ²=13.25; p=0.0003, and MII 92.8%, ²=12.45; p=0.0004) and FLG (MI 83.3%, ²=10.69; p=0.0011, and MII 89.7%, ²=12.24; p=0.0005) treatment groups. With these results, it can be established that the efficiency of the technic to fix and to stain bovine oocyte depends on the nuclear maturation stage to be investigated.

O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar a eficácia de três técnicas de coloração nuclear de oócitos bovinos nos estágios de vesícula germinativa (VG), metáfase I (MI) e metáfase II (MII). Nestes três estágios de maturação nuclear, os oócitos, sem as células do cumulus, foram fixados em ácido acético:metanol (1:3) em lâminas (fixados em lâmina e corados com lacmóide; FLL) ou placa de petri (fixados em placa e corados com lacmóide; FPL) e corados com lacmóide a 1% em PBS (phosphate buffered saline). Os oócitos foram também distribuídos aleatoriamente a um terceiro grupo, no qual foram fixados em lâmina e corados com Giemsa (fixados em lâmina e corados com Giemsa; FLG). No estágio de VG, a percentagem de oócitos corretamente identificados no tratamento FLL (93,5%) foi significativamente maior do que nos tratamentos FPL (53,1%; ²9,84; p-0,0017) e FLG (55,2%; 2=9,03; p=0,0027). No entanto, a proporção de oócitos nos estágios de MI e MII precisamente corados com a técnica FLL (MI 41,7% e MII 41,9%) foram estatisticamente inferiores do que aquelas observadas nos tratamentos FPL (MI 90,0%, ²13,25; p=0,0003, e MII 92.8%, 2=12,45, p=0,0004) e FLG (MI 83,3%, 2=10,69; p=0,0011, e MII 89,7%, ²=12,24; p=0,0005). Assim sendo, os resultados demonstraram que a eficácia das técnicas de fixação e coloração dos oócitos bovinos depende do estágio de maturação nuclear que está em estudo.

Técnicas de coloração cromossômica para estágios específicos da maturação nuclear de oócitos bovinos

This study was designed to determine the efficiency of three different technics for staining bovine oocyte in the germinal vesicle (GV), metafase I (MI) and metafase II (MII) stages. In these stages, oocytes without cumulus cells were fixed in acetic acid:methanol (1:3) either on slides (FLL) or in petri dishes (FPL) and stained with 1% of lacmoid in phosphate buffered saline (PBS). Also, the oocytes were randomized divided in a third treatment, in which they were fixed on slides immersed in acetic acid:methanol (1:3) and stained with Giemsa (FLG). In the GV stage, the percentage of oocytes accurately identified in the FLL (93.5%) was significantly higher than in the FPL (53.1%; 2=9.84; p=0.0017) and FLG (55.2%; 2=9.03; p=0.0027) treatment groups. However, the proportion of oocytes in the MI and MII stages correctly stained with FLL technic (MI 41.7% and MII 41.9%) was statistically lower than that observed in the FPL (MI 90.0%, ²=13.25; p=0.0003, and MII 92.8%, ²=12.45; p=0.0004) and FLG (MI 83.3%, ²=10.69; p=0.0011, and MII 89.7%, ²=12.24; p=0.0005) treatment groups. With these results, it can be established that the efficiency of the technic to fix and to stain bovine oocyte depends on the nuclear maturation stage to be investigated.

O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar a eficácia de três técnicas de coloração nuclear de oócitos bovinos nos estágios de vesícula germinativa (VG), metáfase I (MI) e metáfase II (MII). Nestes três estágios de maturação nuclear, os oócitos, sem as células do cumulus, foram fixados em ácido acético:metanol (1:3) em lâminas (fixados em lâmina e corados com lacmóide; FLL) ou placa de petri (fixados em placa e corados com lacmóide; FPL) e corados com lacmóide a 1% em PBS (phosphate buffered saline). Os oócitos foram também distribuídos aleatoriamente a um terceiro grupo, no qual foram fixados em lâmina e corados com Giemsa (fixados em lâmina e corados com Giemsa; FLG). No estágio de VG, a percentagem de oócitos corretamente identificados no tratamento FLL (93,5%) foi significativamente maior do que nos tratamentos FPL (53,1%; ²9,84; p-0,0017) e FLG (55,2%; 2=9,03; p=0,0027). No entanto, a proporção de oócitos nos estágios de MI e MII precisamente corados com a técnica FLL (MI 41,7% e MII 41,9%) foram estatisticamente inferiores do que aquelas observadas nos tratamentos FPL (MI 90,0%, ²13,25; p=0,0003, e MII 92.8%, 2=12,45, p=0,0004) e FLG (MI 83,3%, 2=10,69; p=0,0011, e MII 89,7%, ²=12,24; p=0,0005). Assim sendo, os resultados demonstraram que a eficácia das técnicas de fixação e coloração dos oócitos bovinos depende do estágio de maturação nuclear que está em estudo.

Synergistic impact of -linolenic acid and -tocopherol on in vitro maturation and culture of buffalo oocytes

Abstract The objective of the current study was to investigate the synergistic impact of -Tocopherol and -Linolenic acid (100 µM) on IVM and IVC of Nili Ravi buffalo oocytes. Oocytes were obtained from the ovaries of slaughtered buffaloes within two hours after slaughter and brought to laboratory. Buffalo cumulus oocyte complexes were placed randomly in the five experimental groups included; GROUP 1: Maturation media (MM) + 100 µM ALA (control), GROUP 2: MM + 100 µM ALA + 50M -Tocopherol, GROUP 3: MM + 100 µM ALA + 100M -Tocopherol, GROUP 4: MM + 100 µM ALA + 200 M -Tocopherol and GROUP 5: MM + 100 µM ALA + 300 M -Tocopherol under an atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5 °C for 22-24 h. Cumulus expansion and nuclear maturation status was determined (Experiment 1). In experiment 2, oocytes were matured as in experiment 1. The matured oocytes were then fertilized in Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate (TALP) medium for about 20 h and cultured in synthetic oviductal fluid (SOF) medium to determine effect of -Linolenic acid (100 µM) and -Tocopherol in IVM medium on IVC of presumptive zygotes. To study the effect of -Linolenic acid (100 µM) in IVM media and increasing concentration of -tocopherol in the culture media on early embryo development (Experiment 3), the presumptive zygotes were randomly distributed into the five experimental groups with increasing concentration of -tocopherol in culture media. Higher percentage of MII stage oocytes in experiment 1(65.2±2.0), embryos at morula stage in experiment 2 (30.4±1.5) and experiment 3 (22.2±2.0) were obtained. However, overall results for cumulus cell expansion, maturation of oocyte to MII stage and subsequent embryo development among treatments remain statistically similar (P > 0.05). Supplementation of -tocopherol in maturation media having -Linolenic acid and/or in embryo culture media did not further enhance in vitro maturation of oocyte or embryo production.

Resumo O objetivo do presente estudo foi investigar o impacto sinérgico do -tocoferol e do ácido -linolênico (100 µM) na MIV e CIV de oócitos de búfala Nili Ravi. Os oócitos foram obtidos dos ovários de búfalos abatidos duas horas após o abate e levados ao laboratório. Complexos de oócitos cumulus de búfalo foram colocados aleatoriamente nos cinco grupos experimentais incluídos; GRUPO 1: Meio de maturação (MM) + 100 µM ALA (controle), GRUPO 2: MM + 100 µM ALA + 50 µM -tocoferol, GRUPO 3: MM + 100 µM ALA + 100 µM -tocoferol, GRUPO 4: MM + 100 µM ALA + 200 M -tocoferol e GRUPO 5: MM + 100 µM ALA + 300 M -tocoferol sob uma atmosfera de 5% de CO2 em ar a 38,5 °C por 22-24 h. A expansão cumulus e o estado de maturação nuclear foram determinados (Experimento 1). No experimento 2, os oócitos foram maturados como no experimento 1. Os oócitos maturados foram então fertilizados em meio de Tyrode's Albumina Lactato Piruvato (TALP) por cerca de 20 h e cultivados em meio de fluido oviductal sintético (SOF) para determinar o efeito do ácido -linolênico (100 µM) e -tocoferol em meio IVM em IVC de presumíveis zigotos. Para estudar o efeito do ácido -linolênico (100 µM) em meio IVM e aumentar a concentração de -tocoferol no meio de cultura no desenvolvimento inicial do embrião (Experimento 3), os presumíveis zigotos foram distribuídos aleatoriamente nos cinco grupos experimentais com concentração crescente de -tocoferol em meios de cultura. Maior porcentagem de oócitos em estágio MII no experimento 1 (65,2 ± 2,0), embriões em estágio de mórula no experimento 2 (30,4 ± 1,5) e experimento 3 (22,2 ± 2,0) foram obtidos. No entanto, os resultados gerais para a expansão das células do cumulus, maturação do oócito para o estágio MII e desenvolvimento embrionário subsequente entre os tratamentos permanecem estatisticamente semelhantes (P> 0,05). A suplementação de -tocoferol em meios de maturação com ácido -linolênico e / ou em meios de cultura de embriões não aumentou ainda mais a maturação in vitro de oócitos ou a produção de embriões.

Fator de crescimento derivado das plaquetas, retinol e insulina na regulação da maturação nuclear de oócitos bovinos e suas conseqüências no desenvolvimento embrionário / Platelet-derived growth factor, retinol and insulin in the regulation of bovine oocyte nuclear maturation and their consequent effect in the embryonic development

O objetivo desse trabalho foi verificar as ações do fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF;P), da insulina (I), do retinol (R) e de suas associações(PI, PIR, IR e PR) na maturação nuclear (MN)de oócitos bovinos e suas consequências no desenvolvimento embrionário (DE). O meio básico para maturação dos oócitos nos diferentes tratamentos foi o TCM-199 modificado acrescido de PVA (controle). No DE, foram utilizados os grupos R, PIR, IR, um controle negativo (PVA) e um controle positivo, contendo soro fetal bovino e gonadotrofinas (SFBHOR). Os fatores P, I, R e suas associações não aceleraram a MN em 7h mas sim após 18h (P<0,001), com exceção dos tratamentos R e PR, nos quais as percentagens de metáfase II foram, respectivamente, de 4,7(porcento) e 8,3(porcento), similares à obtida no grupo-controle (0,0(porcento)). Considerando um nível de significância de P<0,0001 em comparação ao grupo-controle, os maiores índices de matáfase II foram obtidos na presença das associações IR (19,0(porcento)) e PIR (21,3(porcento)). No DE, R (18,3(porcento)), PIR (13,9(porcento)) e IR (10,6(porcento)) incrementaram os índices de clivagem, comparados ao PVA (0,0(porcento);P<0,001), porém não atingiram os índices do grupo SFBHOR (53,8(porcento);P<0,001). Conclui-se que insulina e PDGF aceleram a MN e suas ações são potencializadas pelo retinol. Os índices de clivagem de oócitos maturados na presença de R, IR e PIR são superiores aos do PVA, mas significativamente inferiores aos maturados em SFBHOR (AU)

The aim of the present study was to determine the effect of platelet-derived growth factor (PDGF; P), insulin (I) retinol, (R) and their interactions (PI, PIR, IR and PR) on oocyte nuclear maturation (NM) and, consequent, embryonic development (ED). The basic medium for oocyte maturation in the treatments was the modified TCM-199, supplemented with PVA (control). To study the embryonic development, the oocytes were divided in three treatments, R, PIR e IR, a negative (PVA) and a positive control group (containing calf fetal serum and gonadotrophic hormones; FCSHOR). The PDGF, insulin, retinol and their interactions did not change the kinetic of the NM, in seven hours of culture (P=0.4492) but it changed after 18 hours of maturation (P<0.001) except in the treatments R and PR (P<0.001), in which the percentages of metaphase II were, respectively, 4.7% and 8.3%. These results were similar to the control group (0.0%). Considering a significant level of P<0.0001 in comparison to the control group, the higher rates of metaphase II were obtained in the presence of IR (19.0%) and PIR (21.3%). The higher rates of MII were observed when the oocytes were matured in the presence of insulin and retinol. In the embryonic development, R (18.3%), PIR (13.9%) and IR (10.6%) increased the rate of cleavage when compared to PVA group (0.0%; P<0.001). However, the oocytes were not competent enough to reach the rate obtained in the FCSHOR group (53.8%; P<0.001). In conclusion, insulin and PDGF accelerate NM and their effects are enhanced by retinol. In the embryonic development, oocytes matured in the presence of either R, IR or PIR have higher cleavage rate than PVA group but lower than those matured in the FCSHOR group. (AU)

The effect of the synthetic oviductal fluid medium (SOF) supplemented with insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of canine oocytes (Canis familiaris) / Influência do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) adicionado ao meio fluido sintético de tuba uterina (SOF) sobre a maturação in vitro de oócitos caninos (Canis familiaris)

The follicular growth and oocyte maturation knowledge are very important to the development and improvement of new biotechnologies such as in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. In order to the necessity of clarify the basic mechanisms related to canine oocyte maturation, this investigation focuses on the evaluation of the effect of insulin-like growth factor-i (IGF-I), added to synthetic oviductal fluid medium (SOF) on the in vitro maturation of domestic dog oocytes. Thirty-seven bitches undergoing ovariohysterectomy for castration or due to pathological conditions of the uterus were selected as oocytes donors (n=875). The oocytes were allocated in the following groups: M0 (stained in the collections time), Control (72h in SOF) and Experimental (72h in SOF plus 100 ng IGF-I). After 72 hours of maturation the oocytes nuclear status were assessed by Hoechst 33342 dye. The best results in terms of oocyte harvest were observed in those juvenile donors, females in estrus, nuliparous and pure breeds. No significant differences were observed between treatments control (SOF) or experimental (IGF-I).

O conhecimento da regulação do crescimento folicular e da maturação oocitária é de grande importância no desenvolvimento e aperfeiçoamento de novas biotecnologias como a fecundação in vitro e a transferência nuclear. Considerando-se a necessidade de elucidação dos mecanismos básicos envolvidos na maturação oocitária na espécie canina, a presente pesquisa foi desenvolvida com o objetivo de avaliar o efeito do fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I), adicionado ao meio fluido sintético de tuba uterina (SOF), sobre a maturação de oócitos caninos. Foram utilizadas 37 cadelas submetidas à ovariohisterectomia, eletivas e terapêuticas, como doadoras dos complexos cumulus oócitos grau 1 (n=875) que foram alocados em três grupos: M0 (coloração no momento da colheita), Controle (72 h no meio SOF) e Experimental (72h no meio SOF + 100 ng de IGF-I). Após 72 horas de maturação dos oócitos o estádio de maturação nuclear foi avaliado, por meio de coloração com Hoechst 33342. Os maiores índices de recuperação das estruturas foram obtidos daquelas doadoras com raças definidas, fêmeas jovens, nulíparas e em estro. Não houve diferenças estatísticas entre os dados analisados quanto à maturação nuclear entre os grupos controle (SOF) e experimental (IGF-I).

Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina na maturação in vitro de oócitos bovinos

Como um importante mensageiro biológico, o óxido nítrico (NO) exibe vários efeitos durante os processos fisiológicos e patofisiológicos, incluindo a maturação de oócitos de mamíferos. O objetivo do presente estudo foi investigar a ação da inibição simultânea da NOS envolvida na síntese de NO pela adição no meio de maturação in vitro de diferentes concentrações de AG, avaliando o efeito da inibição específica da iNOS sobre a maturação nuclear e citoplasmática in vitro. No experimento 01, COC foram cultivados com diferentes concentrações de AG (1, 10 e 100 mM e 100 mM de AG mais 10-5 M de SNP) durante 24 h, onde foi avaliada a expansão das células do cumulus, o estádio de maturação nuclear e a integridade da membrana plasmática do oócito e das células do cumulus. No experimento 02, avaliou-se o efeito do NO na migração dos grânulos corticais para cada grupo de COC tratado com diferentes concentrações de AG. Os meios de maturação dos tratamentos foram cultivados e armazenados a –200C para dosagem de NO2-, NO3-, E2 e P4. Os oócitos foram fertilizados somente com as concentrações que não interferiram no processo de maturação nuclear. A adição de 10-5 M de SNP não reverteu a inibição da progressão de MI para MII e aumentou significativamente a concentração de NO3- e NO2-. Nenhuma concentração de AG adicionada no meio de maturação alterou significativamente a concentração de E2 no meio. Não houve diferença significativa (P>0,05) na concentração de P4 entre as concentrações de 1 e 10 mM de AG. A concentração de 100 mM de AG diminuiu significativamente a concentração deste esteróide. A concentração de 1 mM de AG não diminuiu a migração dos grânulos corticais e a de 10 mM promoveu migração parcial em 96,1 ± 6,4 % dos oócitos. Nas de 100 mM e 100 mM com SNP a 10-5 M de SNP, os grânulos corticais distribuídos-se somente na zona medular central. A adição de 10 mM de AG no meio de maturação diminuiu significativamente (P<0,05) a taxa de clivagem quando comparada com grupo controle, mas não diferiu significativamente quando comparada ao grupo em que foi adicionado 1 mM de AG. A adição de 10 mM de AG diminuiu significativamente (P<0,05) a taxa de produção de blastocistos quando comparada a taxa observada no grupo controle e 1 mM de AG, contudo 1 mM de AG não diferiu significativamente do controle. Os resultados indicam que o NO derivado da iNOS é mediado por fatores que afetam a maturação in vitro de oócitos bovinos