Antifungal effect of (R) and (S)-citronellal enantiomers and their predictive mechanism of action on Candida albicans from voriconazole-resistant onychomycoses / Efeito antifúngico dos enantiômeros (R) e (S)-citronelal e seu mecanismo de ação preditivo sobre Candida albicans de onicomicoses resistentes ao voriconazol

Onychomycosis is the most common disease affecting the nail unit and accounts for at least 50% of all nail diseases. In addition, Candida albicans is responsible for approximately 70% of onychomycoses caused by yeasts. This study investigated the antifungal effect of (R) and (S)-citronellal enantiomers, as well as its predictive mechanism of action on C. albicans from voriconazole-resistant onychomycoses. For this purpose, in vitro broth microdilution and molecular docking techniques were applied in a predictive and complementary manner to the mechanisms of action. The main results of this study indicate that C. albicans was resistant to voriconazole and sensitive to the enantiomers (R) and (S)-citronellal at a dose of 256 and 32 µg/mL respectively. In addition, there was an increase in the minimum inhibitory concentration (MIC) of the enantiomers in the presence of sorbitol and ergosterol, indicating that these molecules possibly affect the integrity of the cell wall and cell membrane of C. albicans. Molecular docking with key biosynthesis proteins and maintenance of the fungal cell wall and plasma membrane demonstrated the possibility of (R) and (S)-citronellal interacting with two important enzymes: 1,3-ß-glucan synthase and lanosterol 14α-demethylase. Therefore, the findings of this study indicate that the (R) and (S)-citronellal enantiomers are fungicidal on C. albicans from onychomycoses and probably these substances cause damage to the cell wall and cell membrane of these micro-organisms possibly by interacting with enzymes in the biosynthesis of these fungal structures.

A onicomicose é a doença mais comum que afeta a unidade ungueal e representa pelo menos 50% de todas as doenças ungueais. Além disso, a Candida albicans é responsável por aproximadamente 70% das onicomicoses causadas por leveduras. Nesse estudo, foi investigado o efeito antifúngico dos enantiômeros (R) e (S)-citronelal, bem como seu mecanismo de ação preditivo sobre C. albicans de onicomicoses resistentes ao voriconazol. Para este propósito, foram aplicadas técnicas in vitro de microdiluição em caldo e docking molecular de forma preditiva e complementar para os mecanismos de ação. Os principais resultados deste estudo indicam que C. albicans foi resistente ao voriconazol e sensível aos enantiômeros (R) e (S)-citronelal na dose de 256 e 32 µg/mL respectivamente. Além disso, houve aumento da concentração inibitória mínima (CIM) dos enantiômeros na presença do sorbitol e do ergosterol, indicando que estas moléculas possivelmente afetem a integridade da parede e da membrana celular de C. albicans. O docking molecular com proteínas chave da biossíntese e manutenção da parede celular e da membrana plasmática fúngica, demonstraram a possibilidade do (R) e (S)-citronelal interagir com duas importantes enzimas: 1,3-ß-glucan sintase e lanosterol 14α-demetilase. Portanto, os achados desse estudo indicam que os enantiômeros (R) e (S)-citronelal são fungicidas sobre C. albicans de onicomicoses e provavelmente essas substâncias causem danos a parede e a membrana celular desses microrganismos possivelmente por interagir com as enzimas da biossíntese destas estruturas fúngicas.

Caracterização de corantes solvatocrômicos como marcadores físico-químicos de medicamentos homeopáticos e de amostras biológicas de sobrenadantes

O presente estudo tem a finalidade de determinar se corantes solvatocrômicos podem ser utilizados como método de escolha de medicamentos homeopáticos para tratamento de sistemas vivos infectados com diferentes agentes infecciosos. Tal método permite analisar possíveis alterações no momento dipolo da água quando em contato com diluições homeopáticas de diferentes origens. Métodos: A pesquisa se desenvolveu a partir de sobrenadantes (SNs) colhidos de macrófagos RAW 264.7 estimulados com bacilos Calmette-Guérin (BCG) (cepa vacinal) e tratados com Silicea terra 6, 30, 200 cH, Zincum metallicum 6, 30, 200 cH e controles; desafiados com Encephalitozoon cuniculi (E. cuniculi) e tratados com Phosphorus 6, 30, 200 cH e controles; ou ainda ativados com LPS (mimetizando infecção por bactérias Gram negativas) e tratados com Aspirina 15 cH e controles. Os SNs descongelados foram diluídos 1:10 em água pura estéril e 1:100 em solução hidro-alcooólica 30%, sendo sucussionados por 100 vezes em braço mecânico automático (Autic®). Os respectivos medicamentos também foram preparados em solução hidro- alcooólica 30% do mesmo lote e sucussionados da mesma forma. Todas as amostras foram codificadas aleatoriamente, em números consecutivos, por um técnico não envolvido com a experimentação. Os códigos só foram quebrados após a análise estatística, de forma que todo o estudo foi realizado em cego. Antes de cada experimento, as amostras foram submetidas a 40 agitações verticais manuais, filtradas em filtro de malha 0.22 micrômetros e adicionadas aos corantes na proporção 1:60. Seis diferentes corantes solvatocrômicos (BDN, NNDMIA, Cumarina, Rodanina, Violeta metileno e Vermelho do Nilo) foram testados, a fim de cobrir todo o espectro de luz visível. A leitura em espectrofotômetro foi feita em cubetas descartáveis e a concentração dos corantes foi definida segundo padrões previamente estabelecidos, utilizando álcool absoluto como solvente. Todas as preparações foram feitas em capela de fluxo laminar e com o mínimo de incidência de luz possível sobre os corantes, até o momento da leitura. As condições ambientais foram controladas diariamente, sendo medidas temperatura, umidade e fluxo magnético. Antes de cada série de medidas, o equipamento foi calibrado com o mesmo álcool absoluto usado na preparação dos corantes e o comprimento de onda correspondente ao pico de absorbância foi registrado. As amostras foram analisadas em triplicata, em três séries experimentais consecutivas (N=9). O perfil de absorbância de cada medicamento foi comparado com a absorbância dos respectivos SNs. O método estatístico usado foi a ANOVA de uma via, seguido de Tukey, sendo os valores de p<0,05 considerados significantes. Testes de normalidade foram feitos por Shapiro- Wilk e eventuais outliers foram removidos após inspeção do QQ plot. Conclusão: Concluiu-se, portanto, que a Rodanina é um bom marcador de solventes submetidos à sucussão, provavelmente em função da atividade oxidativa associada; Cumarina é marcador de Phosphorus 6cH e de sobrenadantes tratados com Aspirina 15 cH e LPS; BDN é marcador de Silicea terra 6 cH, 30 cH e 200 cH, Zincum metallicum 30 cH e 200cH e Aspirina 15cH; Violeta metileno é marcador de sobrenadantes tratados com Silicea terra 30 cH e 200cH, bem como Zincum metallicum 6 cH e 200cH. Os demais corantes não apresentaram interações específicas com as amostras estudadas.

The present study aims to determine whether solvatochromic dyes can be used as a method of choice for homeopathic medicines to treat living systems infected with different infectious agents. This method allows analyzing possible changes in the dipole moment of water when in contact with homeopathic dilutions of different origins. The research was developed from supernatants (SNs) collected from RAW 264.7 macrophages stimulated with bacilli Calmette-Guérin (BCG) (vaccinal strain) and treated with Silicea terra 6, 30, 200 cH, Zincum metallicum 6, 30, 200 cH, and controls. Supernatants challenged with Encephalitozoon cuniculi (E. cuniculi) and treated with Phosphorus 6, 30, and 200 cH and controls, or even from macrophages activated with LPS (mimicking infection by Gram-negative bacteria) treated with Aspirin 15 cH and controls. The thawed SNs were diluted 1:10 in sterile water, then 1:100 in 30% hydro-alcoholic solution and submitted to 100 succussions in a robotic mechanical arm (Autic®). The respective medicines were also prepared in 30% hydro- alcoholic solution from the same batch, being succussed in the same way. All samples were randomly coded in consecutive numbers by a technician not involved in the experiment. The codes were only broken after statistical analysis; thus, the study was performed entirely blind. Before each experiment, the samples were submitted to 40 manual vertical agitations, filtered in a 0.22- micrometer mesh filter, and added to the dyes in a 1:60 ratio. Six different solvatochromic dyes (BDN, NNDMIA, Coumarin, Rhodanine, Methylene Violet, and Nile Red) were tested to cover the whole visible light spectrum. The reading was done in a spectrophotometer in disposable cuvettes, and the concentration of the dyes was defined according to previously established standards, using absolute alcohol as a solvent. All preparations were carried out in a laminar flow hood, with an as little light incidence as possible on the dyes, until the moment of reading. The environmental conditions were controlled daily, being measured temperature, humidity, and magnetic flux. Before each series of measurements, the equipment was calibrated with the same absolute alcohol used in the preparation of the dyes, and the wavelength corresponding to the peak of absorbance was recorded. The samples were analyzed in triplicate, in three consecutive experimental series (N=9). The absorbance profile of each drug was compared with the absorbance of the respective SNs. The statistical method used was one-way ANOVA, followed by Tukey, with p<0.05 being considered significant. The Shapiro-Wilk test checked normality, and eventual outliers were removed after inspection of the QQ plot. Therefore, it was concluded that Rodanine is a good marker of solvents subjected to succussion, probably due to its associated oxidative activity; Coumarin is a marker of Phosphorus 6cH and of supernatants treated with Aspirin 15cH and LPS; BDN is a marker of Silicea terra 6 cH, 30 cH and 200 cH, Zincum metallicum 30 cH and 200cH and Aspirin 15cH; Methylene violet is a marker of supernatants treated with Silicea terra 30 cH and 200cH, as well as Zincum metallicum 6 cH and 200cH. The other dyes did not show specific interactions with the samples studied.

Avaliação da atividade antiviral do peptídeo P34 e moléculas da classe da 4-tiazolidinona frente a vírus de importância veterinária

A busca de novas substâncias com atividade antiviral levou este estudo a investigar a ação do peptídeo antimicrobiano P34, produzido pelo Bacillus sp. P34, frente ao herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e de moléculas sintetizadas da 2-picolilamina e 2-aminoetilpiperidina derivadas da classe da 4-tiazolidinona denominadas V19 (2a), V20 (2b), V23 (2c), V28 (2d), V29 (2e), AK11 (1a), AK16 (1d), AK17 (1e), AK18 (1b) e AK20 (1c) frente a diversos vírus que infectam animais. Inicialmente foram determinadas as concentrações não citotóxicas dos diferentes compostos, em diferentes linhagens celulares, através dos métodos MTT e vermelho neutro. A seguir a atividade antiviral foi avaliada mediante um ensaio de inibição do efeito citopático. Em todos os testes, o título viral em cultivo celular foi comparado ao título viral na presença de cada composto para a determinação do percentual de inibição (PI). O P34 demonstrou um PI de 99,94% e alto índice de seletividade (SI de 22,9). Os testes para identificar o modo de ação indicaram que o peptídeo P34 não atua sobre as células MDBK, ou receptores celulares. Em concentrações citotóxicas o P34 obteve efeito virucida e 100% de inibição viral nos ensaios de redução viral e de penetração. Foi evidenciada total inibição na produção das partículas de BoHV-1 quando as células foram tratadas com o P34 posterior a 8 h de infecção. Houve redução significativa (p< 0.01) do título do BoHV-1 na presença do P34 após 8 h de infecção (PI de 90%), chegando a 99,9% de PI após 18 h de tratamento pósinfecção. O P34 inibiu o BoHV-1 tanto no meio extracelular, inibindo a infecção celular, quanto no meio intracelular, após a infecção, impedindo o egresso. Com relação às moléculas derivadas da 4-tiazolidinona a menos tóxica foi a AK 16 (157 µg/mL) nas quatro linhagens de células (RK13, MDCK, CRFK e MDBK) e as mais tóxicas foram as AK11, AK18 e AK20 (19 µg/mL). O PI da molécula AK16 foi de 96,9%, 90,1% e 90,1% contra o EAV, FCV e CPV-2, respectivamente. O composto AK17 mostrou PI de 90,1% contra o EAV, a V20 de 78% contra BVDV, a V28 de 94,4% contra EIV e 78% contra BVDV e a V29 de 94,4% contra CPV-2. As moléculas V20 e V28 foram escolhidas para dar continuidade ao estudo frente ao BVDV. Foram determinados para V20 um SI de 16,8 e de 14,73 para V28. Nos ensaios de inibição da produção de partículas virais, adsorção, competição com receptores celulares, penetração viral e efeito virucida não foram observadas diferenças significativas entre os títulos do BVDV com e sem tratamentos com as moléculas. A associação das moléculas V20 e V28 aumentou de 78 para 82% o PI, não sendo verificada alteração no PI quando as moléculas foram associadas com os antivirais interferon- 2b ou ribavirina. Através da determinação da curva de crescimento do BVDV foi evidenciada atuação no período entre 1 a 5 h pós-infecção com o BVDV, sugerindo ação posterior à entrada viral, mas antes do egresso, provavelmente no período de síntese do RNA e enzimas virais. Os resultados demonstram que o peptídeo P34 e os compostos V20 e V28 derivados da 4tiazolidinona podem ser considerados promissores antivirais contra BoHV-1 e BVDV.

The search for new substances with antiviral activity has led this study to investigate the action of the antimicrobial peptide P34, produced by Bacillus sp. P34 against bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and of the synthetic molecules 2-picolylamine and 2-aminoethylpiperidine, which are derived from the class of thiazolidin-4-one named V19 (2a), V20 (2b), V23 (2c), V28 (2d), V29 (2e), AK11 (1a), AK16 (1d), AK17 (1e), AK18 (1b) and AK20 (1c) in opposition to several viruses that infect animals. Initially non-cytotoxic concentrations of the different compounds were determined, in different cell lines, through the MTT and neutral red methods. Then, the antiviral activity was evaluated by an assay of the cytopathic effect inhibition. In all tests, the viral titer in cell culture was compared to the viral titer in the presence of each compound to determine the percentage of inhibition (PI). The P34 demonstrated a PI of 99.94% and high selectivity index (SI 22.9). Tests to identify the mode of action indicated that the peptide P34 has no effect on MDBK cells, or cell receptors. In cytotoxic concentrations P34 obtained virucidal effect and 100% inhibition in viral reduction viral and penetration assays. Total inhibition was observed in the production of the BoHV-1 particles when cells were treated with P34 after 8 h of infection. There was a significant reduction (p <0.01) in BoHV-1 titer in the presence of P34 after 8 h of infection (PI 90%), reaching 99.9% PI after 18 h postinfection treatment. P34 inhibited BoHV-1 as extracellularly, inhibiting cell infection, as intracellularly, after infection, preventing its egress. Regarding molecules derived from thiazolidin-4-one the less toxic was AK16 (157 µg/mL) in the four cell lines (RK13, MDCK, CRFK and MDBK), and the most toxics were AK11, AK18 and AK20 (19 µg/mL). The PI of AK16 molecule was 96.9%, 90.1% and 90.1% against EAV, FCV and CPV-2, respectively. The compound AK17 showed PI of 90.1% against EAV, V20 of 78% against BVDV, V28 of 94.4% against EIV and 78% against BVDV and the V29 of 94.4% against CPV-2. V20 and V28 molecules were chosen to continue the study against BVDV. To V20 and V28 molecules, were determined SI of 16.8 and 14.73, respectively. In assays of inhibition of production of viral particles, adsorption, competing with cellular receptors, viral penetration and virucidal effect no significant differences were observed between titers the BVDV with and without treatment with the molecules. The association of V20 and V28 molecules increased the PI from 78 to 82%, and changes in the PI were not verified when the molecules were associated with antiviral interferon- 2b and ribavirin. Through the determination of BVDV growth curve, was observed activity in the period between 1 to 5 h post-infection with BVDV, suggesting further action on viral entry, but probably, before the egress, in the period of RNA synthesis and viral enzymes. The results demonstrate that peptide P34 and compounds V20 and V28 derived from thiazolidin4-one can be considered as promising antiviral against BoHV-1 and BVDV.