Identification and characterization of pestiviruses isolated from individual fetal bovine serum samples originated in Rio Grande do Sul state, Brazil / Identificação e caracterização de pestivírus isolados de amostras individuais de soro fetal bovino originárias do Rio Grande do Sul, Brasil

The identification of diversity of bovine pestiviruses circulating in the field is fundamental for continuous evaluation of diagnostic tests and vaccine composition. In this article we performed the genetic and antigenic characterization of twelve bovine pestiviruses isolated in the western region of Rio Grande do Sul, Brazil. The viruses were isolated from sera of bovine fetuses or from animals with clinical presentations suggestive of pestivirus infection. Genetic characterization by sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR region of the viral genome allowed for the identification of bovine viral diarrhea virus (BVDV-1a, 4/12, 33.3%), BVDV-1b (6/12, 50%) and BVDV-2 (2/12, 16.7%). The reactivity of the isolates with a panel of monoclonal antibodies raised against envelope proteins (Erns, E1 and E2) demonstrated a high antigenic variability among isolates. Thus, the active circulation of bovine pestivirus infection, with high genetic and antigenic variability, in cattle on the western border of RS was confirmed, demonstrating the importance of continuous characterization of the pestiviruses circulating in the cattle herds to keep the diagnostic and control measures up to date.(AU)

A identificação da diversidade de pestivírus bovinos que circulam no campo é fundamental para a avaliação contínua dos testes de diagnóstico e composição de vacina. Neste artigo, realizamos a caracterização genética e antigênica de doze pestivírus bovinos isolados na região oeste do Rio Grande do Sul, Brasil. Os vírus foram isolados de soros de fetos bovinos ou de animais com apresentações clínicas sugestivas de infecção por pestivírus. A caracterização genética por sequenciamento e análise filogenética da região 5'UTR do genoma viral permitiu a identificação do vírus da diarréia viral bovina (BVDV-1a, 4/12, 33,3%), BVDV-1b (6/12, 50%) e BVDV-2 (2/12, 16,7%). A reatividade dos isolados com um painel de anticorpos monoclonais criados contra proteínas do envelope (Erns, E1 e E2) demonstrou uma alta variabilidade antigênica entre os isolados. Assim, confirmou-se a circulação ativa da infecção por pestivírus bovino, com alta variabilidade genética e antigênica, em bovinos na fronteira oeste do RS, demonstrando a importância da contínua caracterização dos pestivírus circulantes em bovinos para manter atualizadas as medidas de diagnóstico e controle.(AU)

Identification and characterization of pestiviruses isolated from individual fetal bovine serum samples originated in Rio Grande do Sul state, Brazil / Identificação e caracterização de pestivírus isolados de amostras individuais de soro fetal bovino originárias do Rio Grande do Sul, Brasil

The identification of diversity of bovine pestiviruses circulating in the field is fundamental for continuous evaluation of diagnostic tests and vaccine composition. In this article we performed the genetic and antigenic characterization of twelve bovine pestiviruses isolated in the western region of Rio Grande do Sul, Brazil. The viruses were isolated from sera of bovine fetuses or from animals with clinical presentations suggestive of pestivirus infection. Genetic characterization by sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR region of the viral genome allowed for the identification of bovine viral diarrhea virus (BVDV-1a, 4/12, 33.3%), BVDV-1b (6/12, 50%) and BVDV-2 (2/12, 16.7%). The reactivity of the isolates with a panel of monoclonal antibodies raised against envelope proteins (Erns, E1 and E2) demonstrated a high antigenic variability among isolates. Thus, the active circulation of bovine pestivirus infection, with high genetic and antigenic variability, in cattle on the western border of RS was confirmed, demonstrating the importance of continuous characterization of the pestiviruses circulating in the cattle herds to keep the diagnostic and control measures up to date.(AU)

A identificação da diversidade de pestivírus bovinos que circulam no campo é fundamental para a avaliação contínua dos testes de diagnóstico e composição de vacina. Neste artigo, realizamos a caracterização genética e antigênica de doze pestivírus bovinos isolados na região oeste do Rio Grande do Sul, Brasil. Os vírus foram isolados de soros de fetos bovinos ou de animais com apresentações clínicas sugestivas de infecção por pestivírus. A caracterização genética por sequenciamento e análise filogenética da região 5'UTR do genoma viral permitiu a identificação do vírus da diarréia viral bovina (BVDV-1a, 4/12, 33,3%), BVDV-1b (6/12, 50%) e BVDV-2 (2/12, 16,7%). A reatividade dos isolados com um painel de anticorpos monoclonais criados contra proteínas do envelope (Erns, E1 e E2) demonstrou uma alta variabilidade antigênica entre os isolados. Assim, confirmou-se a circulação ativa da infecção por pestivírus bovino, com alta variabilidade genética e antigênica, em bovinos na fronteira oeste do RS, demonstrando a importância da contínua caracterização dos pestivírus circulantes em bovinos para manter atualizadas as medidas de diagnóstico e controle.(AU)

Can anti-bothropstoxin-I antibodies discriminate between Bothrops jararaca and Bothrops jararacussu venoms?

Background Snakes of the genus Bothrops, popularly known as pit vipers, are responsible for most cases of snakebite in Brazil. Within this genus, Bothrops jararacussu and B. jararaca deserve special attention due to the severity of their bites and for inhabiting densely populated areas. Regarding the treatment of snakebites by Bothrops jararacussu, questions have been raised about the effectiveness of the specific bothropic antivenom in neutralizing myotoxic effects; however, there are no accurate data for humans. Thus, the development of a differential diagnostic kit for this species would be of great interest because it provides, for healthcare professionals, a tool that would allow us to determine whether the accident was caused by B. jararacussu or other species of the genus. It would also make it possible to evaluate the specificity of the treatment and to provide data for epidemiological studies. Methods First, we produced a species-specific polyclonal antibody - a potential biomarker of Bothrops jararacussu venom - against bothropstoxin-I (BthTx-I), which is also found in smaller quantities in the venoms of B. jararaca from southern Brazil. Results Polyclonal antibodies against bothropstoxin-I could be separated into several species-specific immunoglobulins. Then, aiming to develop a system of safe and standardized immunoassay, we produced monoclonal antibodies. Seven hybridomas were obtained. Five of them were specific to the venom of B. jararacussu and two recognized the venom of B. jararaca from the southeastern population. The use of monoclonal antibodies also made it possible to differentiate B. jararacussu from B. jararaca venom obtained from the southern population. Analyzing the reactivity of monoclonal antibodies against other bothropic venoms, we found mAb Bt-3 to be more specific than others for B. jararacussu venom. Conclusions These results show the potential of BthTx-I for producing monoclonal antibodies that differentiate between B. jararacussu and other Bothrops species venoms.(AU)

Can anti-bothropstoxin-I antibodies discriminate between Bothrops jararaca and Bothrops jararacussu venoms?

Snakes of the genus Bothrops, popularly known as pit vipers, are responsible for most cases of snakebite in Brazil. Within this genus, Bothrops jararacussu and B. jararaca deserve special attention due to the severity of their bites and for inhabiting densely populated areas. Regarding the treatment of snakebites by Bothrops jararacussu, questions have been raised about the effectiveness of the specific bothropic antivenom in neutralizing myotoxic effects; however, there are no accurate data for humans. Thus, the development of a differential diagnostic kit for this species would be of great interest because it provides, for healthcare professionals, a tool that would allow us to determine whether the accident was caused by B. jararacussu or other species of the genus. It would also make it possible to evaluate the specificity of the treatment and to provide data for epidemiological studies. Methods First, we produced a species-specific polyclonal antibody - a potential biomarker of Bothrops jararacussu venom - against bothropstoxin-I (BthTx-I), which is also found in smaller quantities in the venoms of B. jararaca from southern Brazil. Results Polyclonal antibodies against bothropstoxin-I could be separated into several species-specific immunoglobulins. Then, aiming to develop a system of safe and standardized immunoassay, we produced monoclonal antibodies. Seven hybridomas were obtained. Five of them were specific to the venom of B. jararacussu and two recognized the venom of B. jararaca from the southeastern population. The use of monoclonal antibodies also made it possible to differentiate B. jararacussu from B. jararaca venom obtained from the southern population. Analyzing the reactivity of monoclonal antibodies against other bothropic venoms, we found mAb Bt-3 to be more specific than others for B. jararacussu venom. Conclusions These results show the potential of BthTx-I for producing monoclonal antibodies that differentiate between B. jararacussu and other Bothrops species venoms.(AU)

Can anti-bothropstoxin-I antibodies discriminate between Bothrops jararaca and Bothrops jararacussu venoms?

Abstract Background Snakes of the genus Bothrops, popularly known as pit vipers, are responsible for most cases of snakebite in Brazil. Within this genus, Bothrops jararacussu and B. jararaca deserve special attention due to the severity of their bites and for inhabiting densely populated areas. Regarding the treatment of snakebites by Bothrops jararacussu, questions have been raised about the effectiveness of the specific bothropic antivenom in neutralizing myotoxic effects; however, there are no accurate data for humans. Thus, the development of a differential diagnostic kit for this species would be of great interest because it provides, for healthcare professionals, a tool that would allow us to determine whether the accident was caused by B. jararacussu or other species of the genus. It would also make it possible to evaluate the specificity of the treatment and to provide data for epidemiological studies. Methods First, we produced a species-specific polyclonal antibody a potential biomarker of Bothrops jararacussu venom against bothropstoxin-I (BthTx-I), which is also found in smaller quantities in the venoms of B. jararaca from southern Brazil. Results Polyclonal antibodies against bothropstoxin-I could be separated into several species-specific immunoglobulins. Then, aiming to develop a system of safe and standardized immunoassay, we produced monoclonal antibodies. Seven hybridomas were obtained. Five of them were specific to the venom of B. jararacussu and two recognized the venom of B. jararaca from the southeastern population. The use of monoclonal antibodies also made it possible to differentiate B. jararacussu from B. jararaca venom obtained from the southern population. Analyzing the reactivity of monoclonal antibodies against other bothropic venoms, we found mAb Bt-3 to be more specific than others for B. jararacussu venom. Conclusions These results show the potential of BthTx-I for producing monoclonal antibodies that differentiate between B. jararacussu and other Bothrops species venoms.

Investigation on the monoclonal antibodies as differential markers for viral and bacterial meningitis by means of immnunohistochemistry technique / Avaliação de anticorpos monoclonais como marcadores diferenciais de meningites bacterianas e virais por meio de técnica imuno-histoquímica

Since 1996, the Laboratory of Monoclonal Antibodies Antigens and Adjuvants - Immunology Center of Adolfo Lutz Institute (IC-IAL) has been working on N. meningitidis strains antigens characterization by using a predetermined monoclonal antibodies (MoAb) panel; and the new monoclonal production has been performed for characterizing strains with unknown profiles. MoAb were obtained from different fusions performed at IAL using spleen cells and popliteal lymph nodes. Two murine hybridomas secreting MoAb anti-N. meningitidis antigens, produced and characterized in the Laboratory of IC-IAL, are presently being evaluated by immunohistochemical (IHC) technique at Immunohistochemistry Laboratory - Pathology Center, IAL. After standardizing these reactions, a protocol for performing investigation on N.meningitidis antigens by using IHQ was established. An increment in the histopathological diagnosis of meningococcal meningitis was occurred, by using MoAb specific for antigens from N. meningitidis serogroups, serotypes and subtypes, mainly in those cases without microorganisms confirmation by biomolecular techniques as PCR. The results obtained in these first tests proved to be promising, and two MoAb showed excellent results. No cross-reactivity with viral meningitis, S. pneumoniae, Rickettsia or Rubella was detected. For the further studies, it is fundamental to increase the samples size, including samples from patients with meningococcal meningitis and from individuals infected with other pathogens.

Desde 1996, o Laboratório de Anticorpos Monoclonais, Antígenos e Adjuvantes - Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz (CI-IAL) tem desenvolvido trabalhos na caracterização antigênica de cepas de Neisseria meningitidis utilizando-se painel de anticorpos monoclonais (AcMo) pré-estabelecido, e produção de novos monoclonais para a análise de cepas com perfis desconhecidos. AcMo foram obtidos das diferentes fusões realizadas no laboratório utilizando-se células esplênicas e linfonodos poplíteos. Dois hibridomas murinos secretores de AcMo anti-N. meningitidis produzidos e caracterizados no CI-IAL têm sido avaliados por meio de estudo imuno-histoquímico (IHQ) no Centro de Patologia-Laboratório de Imunohistoquímica-IAL. Com a padronização da reação, estabeleceu-se um protocolo para efetuar a pesquisa de antígenos de N. meningitidis por IHQ. Houve melhoria no diagnóstico histopatológico da meningite meningocócica, sobretudo em situações em que não há confirmação da presença do microorganismo por técnicas biomoleculares, como PCR, utilizando-se AcMo específicos para antígenos de diferentes sorogrupos, sorotipos e subtipos de N. meningitidis. O resultado obtido nos primeiros testes mostrou-se promissor, e os dois AcMo demonstraram excelentes resultados. Não houve reatividade cruzada com meningite viral, S. pneumoniae, Rickettsia ou rubéola. Nos próximos estudos, é fundamental ampliar número de amostras, incluindo-se aquelas coletadas de pacientes com meningites meningocócicas e de indivíduos infectados com outros agentes patogênicos.

Investigation on the monoclonal antibodies as differential markers for viral and bacterial meningitis by means of immnunohistochemistry technique / Avaliação de anticorpos monoclonais como marcadores diferenciais de meningites bacterianas e virais por meio de técnica imuno-histoquímica

Since 1996, the Laboratory of Monoclonal Antibodies Antigens and Adjuvants - Immunology Center of Adolfo Lutz Institute (IC-IAL) has been working on N. meningitidis strains antigens characterization by using a predetermined monoclonal antibodies (MoAb) panel; and the new monoclonal production has been performed for characterizing strains with unknown profiles. MoAb were obtained from different fusions performed at IAL using spleen cells and popliteal lymph nodes. Two murine hybridomas secreting MoAb anti-N. meningitidis antigens, produced and characterized in the Laboratory of IC-IAL, are presently being evaluated by immunohistochemical (IHC) technique at Immunohistochemistry Laboratory - Pathology Center, IAL. After standardizing these reactions, a protocol for performing investigation on N.meningitidis antigens by using IHQ was established. An increment in the histopathological diagnosis of meningococcal meningitis was occurred, by using MoAb specific for antigens from N. meningitidis serogroups, serotypes and subtypes, mainly in those cases without microorganisms confirmation by biomolecular techniques as PCR. The results obtained in these first tests proved to be promising, and two MoAb showed excellent results. No cross-reactivity with viral meningitis, S. pneumoniae, Rickettsia or Rubella was detected. For the further studies, it is fundamental to increase the samples size, including samples from patients with meningococcal meningitis and from individuals infected with other pathogens.(AU)

Desde 1996, o Laboratório de Anticorpos Monoclonais, Antígenos e Adjuvantes - Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz (CI-IAL) tem desenvolvido trabalhos na caracterização antigênica de cepas de Neisseria meningitidis utilizando-se painel de anticorpos monoclonais (AcMo) pré-estabelecido, e produção de novos monoclonais para a análise de cepas com perfis desconhecidos. AcMo foram obtidos das diferentes fusões realizadas no laboratório utilizando-se células esplênicas e linfonodos poplíteos. Dois hibridomas murinos secretores de AcMo anti-N. meningitidis produzidos e caracterizados no CI-IAL têm sido avaliados por meio de estudo imuno-histoquímico (IHQ) no Centro de Patologia-Laboratório de Imunohistoquímica-IAL. Com a padronização da reação, estabeleceu-se um protocolo para efetuar a pesquisa de antígenos de N. meningitidis por IHQ. Houve melhoria no diagnóstico histopatológico da meningite meningocócica, sobretudo em situações em que não há confirmação da presença do microorganismo por técnicas biomoleculares, como PCR, utilizando-se AcMo específicos para antígenos de diferentes sorogrupos, sorotipos e subtipos de N. meningitidis. O resultado obtido nos primeiros testes mostrou-se promissor, e os dois AcMo demonstraram excelentes resultados. Não houve reatividade cruzada com meningite viral, S. pneumoniae, Rickettsia ou rubéola. Nos próximos estudos, é fundamental ampliar número de amostras, incluindo-se aquelas coletadas de pacientes com meningites meningocócicas e de indivíduos infectados com outros agentes patogênicos.(AU)

Produção de hibridomas secretores de anticorpos anti-Neospora caninum para uso em imunodiagnóstico / Production of hybridomas secreting anti-Neospora caninum antibodies for use in immunodiagnostic

The Neospora caninum is a protozoan Apicomplexa with greater involvement in abortions worldwide. The economic losses determined by neosporosis also include abortions besides the early disposal of cows, costs for replacing animals in the herd, drop in milk production as well as milk in fat production. The immunological diagnosis involves purchasing costly diagnostic kits on the market. Therefore, the aim of this study was the production of hybridomas secreting polyclonal antibodies with affinity to Neospora caninum (Nc-1 strain) for immunodiagnostic use. For antibodies production, we used sonicated protozoa from Vero cells in culture, purified by filtration. These tachyzoites were employed for immunization of BALB / c mice using saponin as adjuvant, which allowed obtaining polyclonal antibodies capable of revealing fluorescein reaction in indirect immunofluorescence. The fusion of splenic cells, from the immunized mice with myeloma cells SP2 / 0 resulted in 72.4% hybridomas secreting anti-Nc-1antibodies. These hybridomas secreted antibodies positive to N. caninum and negative to Toxoplasma gondii.

O Neospora caninum é um protozoário apicomplexa com maior implicação em abortamentos em muitos países do mundo. As perdas econômicas determinadas pela neosporose incluem além dos abortamentos também o descarte precoce de vacas, os custos de reposição de novos animais no rebanho, a queda na produção leiteira, bem como na produção da gordura no leite. O diagnóstico imunológico envolve a aquisição de kits diagnósticos existentes no mercado os quais apresentam alto custo. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi à produção de hibridomas secretores de anticorpos policlonais com afinidade ao Neospora caninum (cepa Nc-1) para utilização em imunodiagnósticos. Para a produção dos anticorpos usou-se o protozoário sonicado, proveniente da cultura em células VERO, que foi purificado por filtração. Esses taquizoítos foram utilizados na imunização dos camundongos BALB/c, usando-se como adjuvante a saponina, o que permitiu a obtenção de anticorpos policlonais capazes de revelar a fluoresceína na reação da imunofluorescência indireta. A fusão das células esplênicas, provenientes dos camundongos imunizados com as células de mieloma SP2/0 resultou na obtenção de 72,4% de hibridomas secretores de anticorpos anti-Nc-1. Esses hibridomas secretaram anticorpos positivos ao N. caninum e negativos ao Toxoplasma gondii.

Produção de hibridomas secretores de anticorpos anti-Neospora caninum para uso em imunodiagnóstico

The Neospora caninum is a protozoan Apicomplexa with greater involvement in abortions worldwide. The economic losses determined by neosporosis also include abortions besides the early disposal of cows, costs for replacing animals in the herd, drop in milk production as well as milk in fat production. The immunological diagnosis involves purchasing costly diagnostic kits on the market. Therefore, the aim of this study was the production of hybridomas secreting polyclonal antibodies with affinity to Neospora caninum (Nc-1 strain) for immunodiagnostic use. For antibodies production, we used sonicated protozoa from Vero cells in culture, purified by filtration. These tachyzoites were employed for immunization of BALB / c mice using saponin as adjuvant, which allowed obtaining polyclonal antibodies capable of revealing fluorescein reaction in indirect immunofluorescence. The fusion of splenic cells, from the immunized mice with myeloma cells SP2 / 0 resulted in 72.4% hybridomas secreting anti-Nc-1antibodies. These hybridomas secreted antibodies positive to N. caninum and negative to Toxoplasma gondii.

O Neospora caninum é um protozoário apicomplexa com maior implicação em abortamentos em muitos países do mundo. As perdas econômicas determinadas pela neosporose incluem além dos abortamentos também o descarte precoce de vacas, os custos de reposição de novos animais no rebanho, a queda na produção leiteira, bem como na produção da gordura no leite. O diagnóstico imunológico envolve a aquisição de kits diagnósticos existentes no mercado os quais apresentam alto custo. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi à produção de hibridomas secretores de anticorpos policlonais com afinidade ao Neospora caninum (cepa Nc-1) para utilização em imunodiagnósticos. Para a produção dos anticorpos usou-se o protozoário sonicado, proveniente da cultura em células VERO, que foi purificado por filtração. Esses taquizoítos foram utilizados na imunização dos camundongos BALB/c, usando-se como adjuvante a saponina, o que permitiu a obtenção de anticorpos policlonais capazes de revelar a fluoresceína na reação da imunofluorescência indireta. A fusão das células esplênicas, provenientes dos camundongos imunizados com as células de mieloma SP2/0 resultou na obtenção de 72,4% de hibridomas secretores de anticorpos anti-Nc-1. Esses hibridomas secretaram anticorpos positivos ao N. caninum e negativos ao Toxoplasma gondii.

Produção de hibridomas secretores de anticorpos anti- Neospora caninum para uso em imunodiagnóstico / Production of hybridomas secreting anti-Neospora caninum antibodies for use in immunodiagnostic

The Neospora caninum is a protozoan Apicomplexa with greater involvement in abortions worldwide. The economic losses determined by neosporosis also include abortions besides the early disposal of cows, costs for replacing animals in the herd, drop in milk production as well as milk in fat production. The immunological diagnosis involves purchasing costly diagnostic kits on the market. Therefore, the aim of this study was the production of hybridomas secreting polyclonal antibodies with affinity to Neospora caninum (Nc-1 strain) for immunodiagnostic use. For antibodies production, we used sonicated protozoa from Vero cells in culture, purified by filtration. These tachyzoites were employed for immunization of BALB / c mice using saponin as adjuvant, which allowed obtaining polyclonal antibodies capable of revealing fluorescein reaction in indirect immunofluorescence. The fusion of splenic cells, from the immunized mice with myeloma cells SP2 / 0 resulted in 72.4% hybridomas secreting anti-Nc-1antibodies. These hybridomas secreted antibodies positive to N. caninum and negative to Toxoplasma gondii.(AU)

O Neospora caninum é um protozoário apicomplexa com maior implicação em abortamentos em muitos países do mundo. As perdas econômicas determinadas pela neosporose incluem além dos abortamentos também o descarte precoce de vacas, os custos de reposição de novos animais no rebanho, a queda na produção leiteira, bem como na produção da gordura no leite. O diagnóstico imunológico envolve a aquisição de kits diagnósticos existentes no mercado os quais apresentam alto custo. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi à produção de hibridomas secretores de anticorpos policlonais com afinidade ao Neospora caninum (cepa Nc-1) para utilização em imunodiagnósticos. Para a produção dos anticorpos usou-se o protozoário sonicado, proveniente da cultura em células VERO, que foi purificado por filtração. Esses taquizoítos foram utilizados na imunização dos camundongos BALB/c, usando-se como adjuvante a saponina, o que permitiu a obtenção de anticorpos policlonais capazes de revelar a fluoresceína na reação da imunofluorescência indireta. A fusão das células esplênicas, provenientes dos camundongos imunizados com as células de mieloma SP2/0 resultou na obtenção de 72,4% de hibridomas secretores de anticorpos anti-Nc-1. Esses hibridomas secretaram anticorpos positivos ao N. caninum e negativos ao Toxoplasma gondii.(AU)

Production and characterization of monoclonal antibodies against Campylobacter fetus subsp. venerealis / Produção e caracterização de anticorpos monoespecíficos contra Campylobacter fetus subsp. venerealis

Myeloma cells Sp2/0-Ag14 and spleen cells from BALB/c mouse immunized with sonicated Campylobacter fetus subsp. venerealis NCTC 10354 were fused with polyethylene glycol (PEG) for the selection of clones producing antibodies. Clones were obtained by limiting dilution and screened for the production of specific antibodies to C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 by indirect ELISA and western blot against a panel of bacteria: C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354, C. fetus subsp fetus ADRI 1812, C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, C. lari NCTC 11352, and Arcobacter skirrowii LMG 6621 for the ELISA and C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 and C. sputorum biovar sputorum LMG 6647 for the western blotting. Fifteen clones producing monoclonal antibodies (MAbs) anti-C. fetus subsp. venerealis of the IgM (1) and IgG (14) classes were further screened for species-specificity. Four clones of the 15 obtained were producers of species-specific monoclonal antibodies (MAbs): two were specific for C. fetus subsp. venerealis and two were specific for C. fetus subsp. fetus. None of the clones were reactive against C. sputorum biovar sputorum LMG 6647. All clones recognized a protein with molecular mass of approximately 148 kDa from lysed C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354.(AU)

Para a produção de anticorpos monoclonais contra Campylobacter fetus subsp. venerealis foram utilizadas as linhagens de células de mieloma Sp2/0-Ag14 e células de baço de camundongos BALB/c imunizados com sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354. A detecção dos anticorpos monoclonais foi realizada por ELISA indireto utilizando antígeno sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354. A clonagem foi realizada por diluição limitante e os clones foram caracterizados por ELISA indireto utilizando um painel de bactérias escolhidas em função da prevalência e habitats: C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354, C. fetus subsp. fetus ADRI 1812, C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, C. lari NCTC 11352 e Arcobacter skirrowii LMG 6621; e no "western blotting" utilizando antígenos sonicados de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 e C. sputorum biovar sputorum LMG 6647. Foram obtidos 15 clones produtores de anticorpos anti- C. fetus subsp. venerealis das classes IgM (1) e IgG (14). Quatro clones dentre os 15 clones obtidos foram produtores de anticorpos monoclonais espécie-específicos: dois clones reagiram com maior especificidade contra C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 e dois clones reagiram com maior especificidade contra C. fetus subsp. fetus ADRI 1812. Nenhum dos clones reagiu contra C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, comprovando a especificidade dos anticorpos monoclonais testados. Todos os clones reconheceram uma proteína de massa molecular de aproximadamente 148 kDa no sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354.(AU)

Função de PD-1 na apoptose de linfócitos T na Leishmaniose visceral canina

Cães infectados com Leishmania infantum, apresentam uma redução do número de linfócitos T. PD-1(programmed cell death 1) um novo membro da família B7-CD28, é expresso por células do sistema imune e sua ligação a PD-L1 (CD274) ou PD-L2 (CD273) induz à desativação dos linfócitos T ou à apoptose. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão de PD-1 e seus ligantes bem como sua função na indução de apoptose de linfócitos T, secreção de TNF- e IL-4, óxido nítrico e na carga parasitária em cães com leishmaniose visceral. Observamos que na leishmaniose visceral canina PD-1 e seus ligantes participam na indução da apoptose celular de linfócitos T, estão regulando a produção de óxido nítrico, TNF-, IL-4, além da carga parasitária. Esse estudo ajuda a esclarecer o mecanismo da resposta imunológica e drogas imunoterapeuticas como anticorpos monoclonais bloqueadores que podem influenciar na LVC.

Dogs infected with Leishmania infantum showed a reduction in the number of lymphocytes T. PD-1 (Programmed cell death 1) a new member of the B7-CD28 family, it is expressed by cells of the immune system and its binding to PD-L1 (CD274) or PD-L2 (CD273) induces deactivation of T cells or apoptosis. This study aimed to evaluate the PD-1 expression and its ligands as well as their role in T lymphocyte induction of apoptosis, TNF- and IL-4 secretion, nitric oxide production and parasite load in dogs with visceral leishmaniasis. We observed that in canine visceral leishmaniasis PD-1 and its ligands involved in induction of apoptosis of T lymphocytes, are regulating the nitric oxide production, TNF-, IL-4, as well as the parasitic load. This study helps to clarify the mechanism of immune response and immunotherapeutic drugs such as blocking monoclonal antibodies that can influence the LVC.

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra toxina épsilon de Clostridium perfringens Tipo D / Production and characterization of monoclonal antibodies against Clostridium perfringens Type D epsilon toxin

Clostridium perfringens tipo D é o agente etiológico da enterotoxemia em ruminantes, causada pela toxina épsilon e caracterizada por edema cardíaco, pulmonar, renal e cerebral. Anticorpos monoclonais contra toxina épsilon de C. perfringens tipo D foram produzidos a partir da fusão da linhagen de mieloma P3-X63-Ag8 653 com células do baço de camundongos Balb/c imunizados com o toxóide épsilon. Seis linhagens de híbridos secretores de anticorpos monoclonais das classes e IgM e IgG foram estabelecidas.(AU)

Clostridium perfringens type D is the aetiological agent of enterotoxemia in ruminants. The disease is caused by epsilon toxin characterized by cardiac, pulmonary, kidney and brain edema. Monoclonal antibodies were produced by using myeloma cell line P3-X63-Ag8 653 fused with spleen cells from Balb/c mice, immunized with epsilon toxoid of C. perfringens type D. Six hybrids were established secreting monoclonal antibodies of the IgM class and IgG3 subclass.(AU)

Antigenic characterization of canine parvovirus isolates from Brazil using specific monoclonal antibodies / Caracterização antigênica de isolados de parvovirus canino do Brasil utilizando monoclonais específicos

Canine parvovirus (CPV) is an emerged pathogen in dogs, first isolated in 1978 in the USA. The original 1978 strain was designated CPV type 2 (CPV-2). However, analysis of CPV isolates in the USA by restriction enzymes and monoclonal antibodies have shown that around the year 1979 a CPV variant strain, designated CPV type 2a (CPV-2a), became widespread. Subsequently, a new antigenic strain, designated CPV type 2b (CPV-2b), was also observed by analysis of CPV isolates from various parts of the world, although the proportion of each strains was different between countries. In this study, the Haemagglutination Inhibition (HI) test with a panel of monoclonal antibodies was used to type canine parvovirus strains in 29 fecal samples collected from symptomatic dogs from 1980 to 1986 and from 1990 to 1995. The results showed a strong predominance of the antigenic type 2a indicating that the CPV epizooty in Brazil followed the same pattern observed in European and Asian countries.(AU)

O Parvovírus Canino (CPV) é um patógeno emergente em cães, isolado pela primeira vez em 1978, nos Estados Unidos. A amostra original de 1978 foi designada CPV tipo 2 (CPV-2). Entretanto, análises de isolados de CPV dos Estados Unidos, por enzimas de restrição e anticorpos monoclonais demonstraram que cerca de 1979, uma amostra variante, designada CPV tipo 2a (CPV-2a) tornou-se prevalente. Subseqüentemente, uma nova amostra antigênica, designada CPV tipo 2b (CPV-2b) também foi observada por análises de isolados de CPV de várias partes do mundo, embora a proporção fosse diferente entre os países. Nesse estudo, foi utilizado o teste de Inibição da Hemaglutinação (HI) com um painel de anticorpos monoclonais para a tipagem de 29 amostras fecais de parvovirus canino, coletadas de cães sintomáticos de 1980 a 1986 e de 1990 a 1995. Os resultados indicaram uma forte predominância do tipo antigênico 2a indicando que a epizootia de CPV no Brasil seguiu o mesmo padrão observados na Europa e países Asiáticos.(AU)

Production of monoclonal antibodies for Avian Metapneumovirus (SHS-BR-121) isolated in Brazil

Avian Metapneumovirus (aMPV), also called Turkey Rhinotracheitis Virus (TRTV), is an upper respiratory tract infection of turkeys, chickens and other avian species. Five monoclonal antibodies (MAbs) were created against the Brazilian isolate (SHS-BR-121) of aMPV, MAbs 1A5B8; 1C1C4; 2C2E9 and 2A4C3 of IgG1 and MAb 1C1F8 of IgG2a. Four Mabs (1A5B8; 1C1C4; 2C2E9 and 2A4C3) showed neutralizing activity and three (1A5B8; 1C1C4 and 2A4C3) inhibited cellular fusion in vitro. These MAbs were used to investigate antigenic relationship among three strains (SHS-BR-121, STG 854/88 and TRT 1439/91) of aMPV subtypes A and B using cross-neutralization test. The results confirm that the monoclonal antibodies described can be used as a valuable tool in the epizootiological and serological studies, and also for the specific diagnosis of the subtypes in the infection for Avian Metapneumovirus.

Production of monoclonal antibodies for Avian Metapneumovirus (SHS-BR-121) isolated in Brazil

Avian Metapneumovirus (aMPV), also called Turkey Rhinotracheitis Virus (TRTV), is an upper respiratory tract infection of turkeys, chickens and other avian species. Five monoclonal antibodies (MAbs) were created against the Brazilian isolate (SHS-BR-121) of aMPV, MAbs 1A5B8; 1C1C4; 2C2E9 and 2A4C3 of IgG1 and MAb 1C1F8 of IgG2a. Four Mabs (1A5B8; 1C1C4; 2C2E9 and 2A4C3) showed neutralizing activity and three (1A5B8; 1C1C4 and 2A4C3) inhibited cellular fusion in vitro. These MAbs were used to investigate antigenic relationship among three strains (SHS-BR-121, STG 854/88 and TRT 1439/91) of aMPV subtypes A and B using cross-neutralization test. The results confirm that the monoclonal antibodies described can be used as a valuable tool in the epizootiological and serological studies, and also for the specific diagnosis of the subtypes in the infection for Avian Metapneumovirus.

Caracterização de anticorpos monoclonais contra rotavírus bovino e suas aplicações como ferramenta de diagnóstico / Characterization of monoclonal antibodies against bovine rotavirus and their diagnostic applications

Anticorpos monoclonais (AcM) para rotavírus bovino foram caracterizados para sua aplicação como ferramenta de diagnóstico, utilizando-se as técnicas de isotipificação, dot-blot, western-blot, imunofluorescência indireta (IFI) e ELISA de captura. A caracterização imunoquímica demonstrou que os cinco AcM 1G5, 4F7, 1E12, 4F3 e 3C12 foram do isótipo IgG2a. Pela técnica de dot-blot, os AcM 1G5, 4F7, 1E12, 4F3 detectaram antígenos do rotavírus, em diferentes concentrações, e dois AcM (1E12 e 4F3) reconheceram proteínas virais pela técnica de western-blot. Todos os AcM reagiram positivamente na técnica de IFI em cultivo celular e foram capazes de detectar antígeno viral em amostras fecais bovinas e humanas, pela técnica de ELISA de captura. Identificaram-se dois grupos de AcM, um deles formado pelos AcM 4F7, 1E12 e 1G5, para seu possível uso na detecção de antígeno viral em fezes por meio do ELISA de captura ou dot-blot e outro pelos 4F3 e 3C12, que podem ser usados para detectar antígeno viral em culturas de células por meio de IFI.(AU)

This work was carried out to characterize and evaluate five bovine rotavirus, monoclonal antibodies (MAbs), as a diagnosis tool, by isotyping, dot-blot, western-blot, indirect immunofluorescence (IFI) and ELISA techniques. The immunochemistry characterization showed that all five MAbs (4F7, 4F3, 1G5, 1E12 and 3C12) were IgG2a isotype. The dot-blot immunoassay showed that 1G5, 4F7, 1E12 and 4F3 detected viral antigen in different concentrations and two MAbs (1E12 and 4F3) recognized viral proteins by western-blot. All MAbs detected viral antigen in bovine and human fecal samples by capture ELISA technique and viral antigen in infected MA-104 cell culture by IFI. In conclusion, two groups of Mabs were indetified: one with Mabs 4F7, 1E12 and 1G5 showed the best results to detect rotavirus antigen in fecal samples by capture ELISA or dot-blot techniques assay and other with 4F3 and 3C12 which may be used to detect rotavirus antigens in cell culture by IFI. The results showed the potential use of these MAbs as diagnosis tools in diarrheas by rotavirus in bovines.(AU)

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra uma cepa do herpesvírus bovino tipo 1 defectiva na glicoproteína C (gC)

Most monoclonal antibodies (MAbs) already produced against bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) react with glycoprotein C (gC), an abundant and immunodominant antigen present on the viral envelope. In order to obtain MAbs with other protein specificities, antigens of a BoHV-1 gC-negative strain were used to immunize BALB/c mice. After fusion and selection of 54 HAT-resistant hybridomas, three clones have been obtained (1F1, 2H4 and 4D7) that secrete IgG2a antibodies reacting to BoHV-1 antigens. These MAbs reacted with viral antigens in immunofluorescence (IFA) and immunoperoxidase (IPX) in dilutions up to 1:640 (hybridoma supernatants) and 1:20.000 (ascitis fluid). The three MAbs showed a wide spectrum of reactivity, recognizing antigens of 14 herpesviruses isolated from respiratory or genital disease (supposedly BoHV-1) and with 17 isolates of neurological disease (likely BoHV-5) and displayed varied levels of neutralizing activity against all these viruses. The protein specificity could not be demonstrated directly as none of the MAbs bound to viral antigens in Western blot. On the other hand, the three MAbs reacted with cells infected with a BoHV-5 strain defective in glycoproteins gE and gI, demonstrating they are directed to other viral proteins. By exclusion (gC, gE and gI) and due to their neutralizing activity, these MAbs are probably directed to conserved epitopes on other envelope glycoproteins harboring neutralizing epitopes: gB or gD. In this sense, besides being useful for diagnosis purposes, these MAbs may be very useful for mapping neutralizing epitopes in these glycoproteins.

A maioria dos anticorpos monoclonais (AcMs) já produzidos contra o herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) reage com a glicoproteína C (gC), um antígeno abundante e imunodominante presente no envelope viral. Com o objetivo de produzir AcMs com outras especificidades protéicas, antígenos de uma cepa do BoHV-1 defectiva no gene da gC foram utilizados para a imunização de camundongos BALB/c. Após fusão e seleção de 54 hibridomas resistentes ao meio seletivo HAT, foram obtidos três clones (1F1, 2H4 e 4D7) secretores de imunoglobulinas da classe IgG2a, que reagiram com antígenos da cepa homóloga. Os AcMs reagiram com antígenos virais nas técnicas de imunofluorescência (IFA) e imunoperoxidase (IPX) em diluições de até 1:640 (sobrenadante de cultivo) e 1:20.000 (fluído ascítico). Os três AcMs apresentaram um espectro amplo de reatividade, reagindo com antígenos de 14 herpesvírus isolados de doença respiratória ou genital (provavelmente BoHV-1) e com 17 isolados de doença neurológica (supostamente BoHV-5), e apresentaram atividade neutralizante em níveis variáveis contra todos esses isolados. A especificidade protéica dos AcMs não pode ser determinada diretamente, pois nenhum deles reagiu com proteínas virais na técnica de Western blot. Por outro lado, os três AcMs reagiram em IFA com células infectadas com uma cepa do BoHV-5 defectiva nas glicoproteínas E, I e proteína US9, o que exclui estes antígenos como possíveis alvos dos AcMs. Por exclusão (gC, gE, gI) e pela sua forte atividade neutralizante, os AcMs são provavelmente direcionados contra epitopos conservados de outras glicoproteínas do envelope viral que contêm epitopos neutralizantes: a gB e/ou gD. Pelo seu alto título de reação e pelo amplo espectro de reatividade, esses AcMs possuem potencial aplicação em técnicas diagnósticas. Além disso, podem ser úteis para o mapeamento de epitopos neutralizantes conservados nas glicoproteínas do envelope.

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra uma cepa do herpesvírus bovino tipo 1 defectiva na glicoproteína C (gC)

Most monoclonal antibodies (MAbs) already produced against bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) react with glycoprotein C (gC), an abundant and immunodominant antigen present on the viral envelope. In order to obtain MAbs with other protein specificities, antigens of a BoHV-1 gC-negative strain were used to immunize BALB/c mice. After fusion and selection of 54 HAT-resistant hybridomas, three clones have been obtained (1F1, 2H4 and 4D7) that secrete IgG2a antibodies reacting to BoHV-1 antigens. These MAbs reacted with viral antigens in immunofluorescence (IFA) and immunoperoxidase (IPX) in dilutions up to 1:640 (hybridoma supernatants) and 1:20.000 (ascitis fluid). The three MAbs showed a wide spectrum of reactivity, recognizing antigens of 14 herpesviruses isolated from respiratory or genital disease (supposedly BoHV-1) and with 17 isolates of neurological disease (likely BoHV-5) and displayed varied levels of neutralizing activity against all these viruses. The protein specificity could not be demonstrated directly as none of the MAbs bound to viral antigens in Western blot. On the other hand, the three MAbs reacted with cells infected with a BoHV-5 strain defective in glycoproteins gE and gI, demonstrating they are directed to other viral proteins. By exclusion (gC, gE and gI) and due to their neutralizing activity, these MAbs are probably directed to conserved epitopes on other envelope glycoproteins harboring neutralizing epitopes: gB or gD. In this sense, besides being useful for diagnosis purposes, these MAbs may be very useful for mapping neutralizing epitopes in these glycoproteins.

A maioria dos anticorpos monoclonais (AcMs) já produzidos contra o herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) reage com a glicoproteína C (gC), um antígeno abundante e imunodominante presente no envelope viral. Com o objetivo de produzir AcMs com outras especificidades protéicas, antígenos de uma cepa do BoHV-1 defectiva no gene da gC foram utilizados para a imunização de camundongos BALB/c. Após fusão e seleção de 54 hibridomas resistentes ao meio seletivo HAT, foram obtidos três clones (1F1, 2H4 e 4D7) secretores de imunoglobulinas da classe IgG2a, que reagiram com antígenos da cepa homóloga. Os AcMs reagiram com antígenos virais nas técnicas de imunofluorescência (IFA) e imunoperoxidase (IPX) em diluições de até 1:640 (sobrenadante de cultivo) e 1:20.000 (fluído ascítico). Os três AcMs apresentaram um espectro amplo de reatividade, reagindo com antígenos de 14 herpesvírus isolados de doença respiratória ou genital (provavelmente BoHV-1) e com 17 isolados de doença neurológica (supostamente BoHV-5), e apresentaram atividade neutralizante em níveis variáveis contra todos esses isolados. A especificidade protéica dos AcMs não pode ser determinada diretamente, pois nenhum deles reagiu com proteínas virais na técnica de Western blot. Por outro lado, os três AcMs reagiram em IFA com células infectadas com uma cepa do BoHV-5 defectiva nas glicoproteínas E, I e proteína US9, o que exclui estes antígenos como possíveis alvos dos AcMs. Por exclusão (gC, gE, gI) e pela sua forte atividade neutralizante, os AcMs são provavelmente direcionados contra epitopos conservados de outras glicoproteínas do envelope viral que contêm epitopos neutralizantes: a gB e/ou gD. Pelo seu alto título de reação e pelo amplo espectro de reatividade, esses AcMs possuem potencial aplicação em técnicas diagnósticas. Além disso, podem ser úteis para o mapeamento de epitopos neutralizantes conservados nas glicoproteínas do envelope.

Production and caracterization of monoclonal antibodies for the detection of Salmonella enterica in chicken meat

A panel of 13 monoclonal antibodies (MAbs) that react against outer membrane proteins of Salmonella Enteritidis was obtained. Two MAbs were classified as IgM, six were IgG2a, three were IgG3 and one was of the IgG2b isotype. The reactivity of the MAbs against different serovars of Salmonella enterica and other bacteria was investigated using an indirect ELISA. Five MAbs reacted only against Salmonella Enteritidis. Two MAbs presented crossed reactions with thermo-extracted antigens of Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii and Enterobacter aerogenes. MAb 424H presented wide spectrum of reactivity, detecting antigens of Salmonella belonging to serogroups B, C, D, E and G. The detection limit of different serovars of Salmonella in a indirect ELISA with MAb 424H varied from 1.0 x 10(4) CFU/mL for Salmonella London to 1.4 x 10(6) CFU/mL for Salmonella Gallinarum and Salmonella Typhimurium. Evaluation of the performance of the ELISA with MAb 424H in the detection of Salmonella in samples of chicken meat artificially contaminated revealed that the ELISA was able to detect all serovars after sample enrichment using two levels of contamination. Samples of chicken meat not artificially contaminated analysed in parallel were negative for Salmonella in both the conventional and the ELISA methods.

Foi obtido um painel de 13 anticorpos monoclonais que reagem com proteínas de membrana externa de Salmonella Enteritidis. Dois MAbs foram classificados como IgM, 6 foram do isotipo IgG2a, três foram do isotipo IgG3 e um do isotipo IgG2b. A reatividade dos anticorpos monoclonais (MAbs) com diferentes sorovares de Salmonella e outras bactérias foi investigada através de um ELISA indireto. Cinco MAbs reagiram apenas com Salmonella Enteritidis. Dois MAbs apresentaram reação cruzada com antígenos termoextraídos de Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii e Enterobacter aerogenes. O MAb 424H apresentou amplo espectro de reatividade, detectando antígenos de Salmonella pertencentes aos sorogrupos B, C, D, E, e G. O limite de detecção de diferentes sorovares de Salmonella em um ELISA indireto com o MAb 424H variou de 1,0 x 10(4) UFC/mL para Salmonella London a 1,4 x 10(6) UFC/mL para Salmonella Gallinarum e Salmonella Typhimurium. A avaliação do desempenho do ELISA indireto com o MAb 424H na detecção de diferentes sorovares de Salmonella em amostras de carne de frango, mostrou ser possível detectar todos os sorovares após o enriquecimento das amostras, nos três níveis de contaminação utilizados. A análise de alíquotas de amostras de carne de frango não contaminadas artificialmente, feita em paralelo, foi negativa para Salmonella tanto no método convencional quanto no ELISA.