Cryopreservation of lymphocytes for immunological studies in horses / Criopreservação de linfócitos para estudos imunológicos em equinos

The use of frozen cells allows studies on diseases and other immunological assays, since it facilitates the logistics of collecting and transporting, including laboratories located in different cities or other countries. The objectives of this study were to verify if the storage in the refrigerator after collection at different times changes the viability of total leukocytes after months of freezing and the ratio of CD4/CD8 is affected by the freezing process. Venous blood of 15 healthy horses was used and the experiment was divided into 2 stages. In the first, the viability of the leukocytes before and after freezing was verified, as well as different storage times in the refrigerator (fresh blood, stored for 24 and 48 hours) before the freezing process. In the second part, the immunophenotyping of the T lymphocytes was performed, in order to observe if after thawing the relationship between LT CD4 and LT CD8 undergoes change. There was no difference between the amounts of viable leucocytes from frozen fresh blood compared to fresh blood before freezing, nor difference between the viability of blood left in the refrigerator (4°C) for 24 hours and fresh blood and fresh frozen blood. There was a decrease in viability of frozen leukocytes after 48 hours left in the freezer for other samples; however, the recovery was 107x cells. Regarding the immunophenotyping of CD2CD4+ and CD2CD8+ double-labeled T lymphocytes in the blood stored in the refrigerator for 24 hours before freezing, no difference was observed between before and after 6 months of freezing. It is concluded that cryopreservation of equine total leukocytes is possible and, although there was a difference between freezing times, even in the less viable sample, sufficient numbers of cells were recovered for other immunological assays.(AU)

A utilização de células congeladas possibilita estudos sobre doenças e outros ensaios imunológicos, pois facilita a logística de coleta e transporte, inclusive para laboratórios localizados em cidades diferentes ou outros países. Os objetivos desse estudo foram verificar se o armazenamento sobre refrigeração em diferentes tempos e a criopreservação alteram a viabilidade de leucócitos totais e se a relação entre LT CD4/CD8 é afetada pelo processo de congelamento. Utilizou-se sangue venoso de 15 cavalos hígidos e o experimento foi dividido em 2 etapas. Na primeira foi analisado se houve alteração na viabilidade dos leucócitos provenientes de amostras de sangue armazenadas em diferentes tempos em geladeira antes e depois de 6 meses de congelamento a -80°C. Na segunda parte, realizou-se a imunofenotipagem dos linfócitos T, com a finalidade de observar se após o descongelamento a relação entre LT CD4 e LT CD8 sofre alteração. Não houve diferença entre a quantidade de leucócitos viáveis da amostra de sangue fresco descongelado em relação ao sangue fresco antes do congelamento, nem diferença entre a viabilidade do sangue deixado em congelador (4°C) por 24 horas e do sangue fresco. Houve uma diminuição da viabilidade dos leucócitos, após o descongelamento de 6 meses (-80°C), das amostras de sangue deixado em geladeira por 48 horas antes do congelamento em relação às outras amostras, porém, a recuperação foi de células x107. Quanto à imunofenotipagem de linfócitos T com dupla marcação CD2CD4+ e CD2CD8+, no sangue armazenado em geladeira por 24 horas antes do congelamento, e não foi observada diferença entre antes ou depois de 6 meses de congelamento. Conclui-se que a criopreservação de leucócitos totais de equinos é possível e, embora tenha havido diferença entre os tempos de congelamento, mesmo na amostra menos viável, houve recuperação de uma quantidade de células suficientes para outros ensaios imunológicos.(AU)

Cryopreservation of lymphocytes for immunological studies in horses / Criopreservação de linfócitos para estudos imunológicos em equinos

The use of frozen cells allows studies on diseases and other immunological assays, since it facilitates the logistics of collecting and transporting, including laboratories located in different cities or other countries. The objectives of this study were to verify if the storage in the refrigerator after collection at different times changes the viability of total leukocytes after months of freezing and the ratio of CD4/CD8 is affected by the freezing process. Venous blood of 15 healthy horses was used and the experiment was divided into 2 stages. In the first, the viability of the leukocytes before and after freezing was verified, as well as different storage times in the refrigerator (fresh blood, stored for 24 and 48 hours) before the freezing process. In the second part, the immunophenotyping of the T lymphocytes was performed, in order to observe if after thawing the relationship between LT CD4 and LT CD8 undergoes change. There was no difference between the amounts of viable leucocytes from frozen fresh blood compared to fresh blood before freezing, nor difference between the viability of blood left in the refrigerator (4°C) for 24 hours and fresh blood and fresh frozen blood. There was a decrease in viability of frozen leukocytes after 48 hours left in the freezer for other samples; however, the recovery was 107x cells. Regarding the immunophenotyping of CD2CD4+ and CD2CD8+ double-labeled T lymphocytes in the blood stored in the refrigerator for 24 hours before freezing, no difference was observed between before and after 6 months of freezing. It is concluded that cryopreservation of equine total leukocytes is possible and, although there was a difference between freezing times, even in the less viable sample, sufficient numbers of cells were recovered for other immunological assays.(AU)

A utilização de células congeladas possibilita estudos sobre doenças e outros ensaios imunológicos, pois facilita a logística de coleta e transporte, inclusive para laboratórios localizados em cidades diferentes ou outros países. Os objetivos desse estudo foram verificar se o armazenamento sobre refrigeração em diferentes tempos e a criopreservação alteram a viabilidade de leucócitos totais e se a relação entre LT CD4/CD8 é afetada pelo processo de congelamento. Utilizou-se sangue venoso de 15 cavalos hígidos e o experimento foi dividido em 2 etapas. Na primeira foi analisado se houve alteração na viabilidade dos leucócitos provenientes de amostras de sangue armazenadas em diferentes tempos em geladeira antes e depois de 6 meses de congelamento a -80°C. Na segunda parte, realizou-se a imunofenotipagem dos linfócitos T, com a finalidade de observar se após o descongelamento a relação entre LT CD4 e LT CD8 sofre alteração. Não houve diferença entre a quantidade de leucócitos viáveis da amostra de sangue fresco descongelado em relação ao sangue fresco antes do congelamento, nem diferença entre a viabilidade do sangue deixado em congelador (4°C) por 24 horas e do sangue fresco. Houve uma diminuição da viabilidade dos leucócitos, após o descongelamento de 6 meses (-80°C), das amostras de sangue deixado em geladeira por 48 horas antes do congelamento em relação às outras amostras, porém, a recuperação foi de células x107. Quanto à imunofenotipagem de linfócitos T com dupla marcação CD2CD4+ e CD2CD8+, no sangue armazenado em geladeira por 24 horas antes do congelamento, e não foi observada diferença entre antes ou depois de 6 meses de congelamento. Conclui-se que a criopreservação de leucócitos totais de equinos é possível e, embora tenha havido diferença entre os tempos de congelamento, mesmo na amostra menos viável, houve recuperação de uma quantidade de células suficientes para outros ensaios imunológicos.(AU)

Protocol for collection and separation of bone marrow mononuclear cells in Chlorocebus aethiops / Protocolo para colheita e isolamento de células mononucleares de medula óssea em Chlorocebus aethiops

Chlorocebus aethiops is a species of non-human primate frequently used in biomedical research. Some research involves this species as an experimental model for various diseases and possible treatment with stem cells. The bone marrow is one of the main sources of these cells and provides easy access. The aim of this study was to standardize the protocol of collection and separation of bone marrow in C. aethiops. Ten animals were submitted to puncture of bone marrow with access to the iliac crest and cell separation by density gradient. The bone marrow of C. aethiops had an average of 97% viability. From the results achieved, we can conclude that C. aethiops is an excellent model to obtain and isolate mononuclear cells from bone marrow, fostering several studies in the field of cell therapy.(AU)

Chlorocebus aethiops é uma espécie de primata não humano frequentemente utilizados em pesquisa biomédica. Algumas pesquisas envolve esta espécie como modelo experimental para várias doenças e possível tratamento com células-tronco. A medula óssea é uma das principais fontes destas células e proporciona fácil acesso. O objetivo deste estudo foi o de padronizar o protocolo de coleta e separação de medula óssea em C. aethiops. Dez animais foram submetidos a punção de medula óssea com acesso à crista ilíaca e separação de células por gradiente de densidade. A medula óssea de C. aethiops tinha uma média de 97% de viabilidade. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que C. aethiops é um excelente modelo para obter e isolar células mononucleares da medula óssea, promovendo vários estudos no campo da terapia celular.(AU)

Comparação de dois métodos de colheita de medula óssea de equinos e de dois meios de diluição para o isolamento de células mononucleares / Comparison of two methods of equine bone marrow aspiration and two solutions for mononuclear cell isolation

O objetivo do presente estudo foi avaliar a concentração e viabilidade da fração de células mononucleares (FCM) a partir de diferentes técnicas de colheita e processamento de medula óssea (MO) em equinos. Foram avaliados cinco equinos adultos, hígidos e sem raça definida. Obtiveram-se frações de medula óssea (MO) do osso esterno, de acordo com dois protocolos: na colheita A, utilizou-se 10mL de solução de heparina dentro da seringa e em seguida, aspirou-se a MO; na colheita B, 10mL de solução de heparina foi injetada na MO e a aspiração foi realizada após 20 segundos. Todos os animais foram submetidos aos dois protocolos de colheitas, realizadas em sequência, sem intervalo entre os dois procedimentos. Após isolamento da fração de células mononucleares (FCM), das amostras de MO obtidas nas colheitas A e B, cada amostra foi dividida em dois tubos, um contendo solução de DMEM e outro contendo PBS. Assim, alternando-se o tipo de colheita e a solução diluidora, obteve-se quatro tubos de amostras por animal. Os tubos foram centrifugados e os sedimentos foram homogeneizados nos respectivos meios obtendo-se o volume final de 100μL. Realizou-se determinação da concentração e viabilidade celular, obtendo-se as concentrações médias de FCM. Para ambos os meios de diluição, a colheita B apresentou valor numérico maior em comparação à colheita A, porém não foi significativo (p>0,05). Atribui-se tal tendência à menor ocorrência de coagulação da MO no momento da colheita B, sugerindo-se melhor aproveitamento da FCM. Não houve diferença (p>0,05) entre os meios DMEM ou PBS, indicando que os mesmos não alteraram a viabilidade celular. Os protocolos utilizados para colheita de MO e separação da FCM se mostraram eficientes, para o uso em terapia celular em equinos.(AU)

The aim of this study was to evaluate mononuclear cells fraction (MCF) concentration and viability from different techniques of bone marrow (BM) aspiration and processing in horses. Five adult horses, healthy and of unknown breed were evaluated. BM was obtained from sternum bone, according two protocols: in aspiration A, 10mL of heparin solution was used inside the syringe and BM was aspirated; in aspiration B, 10mL of heparin solution was injected into the BM, and aspiration was done after 20 seconds. All the animals were submitted by both protocols realized in sequence, without a gap between the procedures. After MCF isolation, of BM samples obtained from A and B aspiration, each sample was divided into two tubes; one contained DMEM solution and the other with PBS solution. Therefore, interchanging the aspiration protocol and the dilution solution, four sample tubes were obtained for each horse. The tubes were centrifuged and the pellet was homogenized with the respectively solution to obtain the final volume of 100μL. Cellular concentration and viability were determined to obtain the FCM medium concentration. For both solutions, the aspiration B had higher numeric values comparing with aspiration A; however, it was not significant (p>0.05). This tendency is attribute for the less BM coagulation observed in the aspiration B, suggesting greater improvement of MCF. No difference (p>0.05) was found between DMEM and PBS solution, indicating that both do not alter the cell viability. The protocols used for BM aspiration and MCF isolation were efficient for application in equine cellular therapy.(AU)

RELAÇÃO ENTRE MACRÓFAGOS ESPUMOSOS E CÉLULAS ESTRELADAS NO DESENVOLVIMENTO DAS LESÕES HEPÁTICAS INDUZIDAS PELA INGESTÃO DE Brachiaria spp. EM BOVINOS

Brachiaria spp. é a forragem tropical mais cultivada em vários países; no entanto, muitos relatos de doenças foram descritos em animais devido à toxicidade das saponinas esteroidais presentes na planta. Essas toxinas causam danos principalmente no fígado, que pode apresentar várias lesões histopatológicas, incluindo infiltrados de células de citoplasma espumoso, conhecidas como macrófagos espumosos (ME) e fibrose. A fibrose hepática ocorre principalmente após ativação das células estreladas hepáticas (CEHs) em miofibroblastos fibrogênicos. O objetivo deste estudo foi investigar a ativação de CEHs para verificar a possível associação entre macrófagos espumosos e fibrose hepática em bovinos mantidos em pastagem de Brachiaria. Fragmentos de fígado de bovinos alimentados com Brachiaria spp. foram coletados em um abatedouro e destes, 48 foram selecionados na análise histológica considerando a presença de infiltrados de macrófagos espumosos. As amostras foram divididas em 4 escores/grupos (12 animais por grupo), de acordo com a quantidade e tamanho dos infiltrados de macrófagos espumosos no parênquima hepático: 0= ausência de ME e lesões histológicas; 1= discreto; 2= moderado; 3= acentuado. As amostras foram submetidas à análise histopatológica (Hematoxilina e Eosina - HE; Tricrômico de Masson TM para avaliar a deposição de colágeno) e imuno-histoquímica (-SMA; CD163). A análise histopatológica revelou infiltrados inflamatórios mononucleares nos tratos portais e fibrose capsular discreta como as lesões mais frequentes. O TM exibiu fibrose discreta a moderada, geralmente envolvendo grupos de macrófagos espumosos, em regiões subcapsulares ou periportais. Houve diferença estatística significante entre os grupos de infiltrados de macrófagos espumosos e a porcentagem de fibrose (p= 0,001) e imunomarcação de CEHs (p= 0,002). Fígados com escore 3 apresentaram maior porcentagem de fibrose e ativação de CEHs quando comparado ao grupo 0, e houve correlação entre estas variáveis e os grupos/escores de macrófagos espumosos. A avaliação de CD163 não revelou alteração de marcação de células de Kupffer entre os grupos, porém revelou grande variação da expressão deste receptor entre os macrófagos espumosos. Não houve correlação entre a expressão de CD163 em macrófagos espumosos e a fibrose hepática. Este estudo conclui que uma quantidade maior de macrófagos espumosos pode estimular a fibrose hepática através da ativação de CEHs, sendo este achado concordante com a literatura que sugere injúria hepática crônica e fibrose em fígados de bovinos alimentados com Brachiaria spp. Os macrófagos espumosos associados à ingestão desta pastagem, apresentam ainda, variação evidente da expressão de CD163, sendo esta expressão maior em grupos com maior quantidade destas células.

Brachiaria spp. is the most cultivated tropical forage in several countries; however, many disease reports have been described in animals due to the toxicity of steroidal saponins present in the plant. These toxins cause damage mainly to the liver, which can present several histopathological lesions, including infiltrates of cells with foamy cytoplasm, known as foamy macrophages (FM), and fibrosis. Liver fibrosis occurs mainly after activation of hepatic stellate cells (HSCs) in fibrogenic myofibroblasts. The objective of this study was to investigate the activation of HSCs to verify the possible association between foamy macrophages and hepatic fibrosis in cattle kept in Brachiaria pasture. Liver fragments of cattle fed with Brachiaria spp. were collected in a slaughterhouse and from these, 48 were selected in histological analysis considering the presence/absence of foamy macrophage infiltrates. The samples were divided into 4 scores/groups (12 animals per group), according to the amount and size of foamy macrophage infiltrates in the liver parenchyma: 0 = absence of FM (and no histological lesions); 1= mild; 2= moderate; 3= intense. The samples were submitted to histopathological analysis (Hematoxylin and Eosin - HE; Masson's trichrome - MT to assess collagen deposition) and immunohistochemistry (-SMA; CD163). Histopathological analysis revealed mononuclear inflammatory infiltrates in the portal tracts and mild capsular fibrosis as the most frequent lesions. MT exhibited mild to moderate fibrosis, usually involving groups of foamy macrophages, in subcapsular or periportal regions. There was a significant statistical difference between the groups of foamy macrophage infiltrates and the percentage of fibrosis (p= 0.001) and immunostaining of HSCs (p= 0.002). Livers with score 3 showed a higher percentage of fibrosis and activation of HSCs when compared to group 0, and there was a correlation between these variables and the groups of foamy macrophages. The evaluation of CD163 did not reveal changes in the labeling of Kupffer cells between the groups, but it did reveal a great variation in the expression of this receptor between foamy macrophages. There was no correlation between CD163 expression in foamy macrophages and liver fibrosis. This study concludes that a larger amount of foamy macrophages can stimulate hepatic fibrosis through the activation of HSCs, which is consistent with the literature that suggests chronic liver injury and fibrosis in livers of cattle fed with Brachiaria spp. The foamy macrophages associated with the ingestion of this pasture, also presented an evident variation in the expression of CD163, being this expression superior in groups with a greater quantity of these cells.

Dinâmica das alterações do baço associadas ao estado clínico de cães com leishmaniose visceral / Dynamic of changes of the spleen associated with the clinical status ofdogs with visceral leishmaniasis

Foram avaliadas as alterações esplênicas de cães com leishmaniose visceral, sintomáticos e assintomáticos, em relação ao número de sinais clínicos observados nestes animais. Cães sintomáticos foram divididos em cinco grupos de acordo com o número de sinais clínicos presentes. Nos grupos com três ou mais sinais, houve hipertrofia e hiperplasia dos cordões esplênicos e depleção de células linfóides da bainha periarteriolar. No grupo de cães com apenas um sinal clínico houve depleção de folículos da polpa branca. Hiperplasia dos folículos foi observada em intensidade maior no grupo de cães mostrando mais de cinco sinais clínicos.Granulomas estavam presentes em maior intensidade no grupo de cães exibindo cinco sinais. Granulações eosinofílicas no citoplasma de células plasmáticas (corpúsculos de Russell) foram significativamente maiores no grupo de cães com cinco sinais clínicos em comparação com aqueles com apenas um, dois, três e quatro sinais clínicos e cães assintomáticos. Os resultados mostram que o baço apresenta profundas alterações morfológicas que podem influenciar a evolução da infecção.(AU)

Alterations in the spleen of dogs with symptomatic and asymptomatic leishmaniasis have been evaluated with respect to the number of clinical signs observed in such animals. Symptomatic dogs were divided into five groups according to the number of clinical signs presented. In groups with three or more signs, there was hypertrophy and hyperplasia of the splenic cords and depletion of periarteriolar lymphatic sheath cells. In the group of dog with only one clinical sign, a there was follicle depletion in the white pulp. Follicle hyperplasia was higher in the canine group showing more than five clinical signs. Granulomas were present in a greater quantity in the canine group exhibiting five signs. Eosinophil granulations in the cytoplasm of plasma cells (Russell bodies) were significantly greater in the canine group with five clinical manifestations compared to those with only one, two, three and four manifestations and to asymptomatic dogs. The results show that the spleen undergoes profound morphologic changes that can influence the outcome of infection.(AU)

Dinâmica das alterações do baço associadas ao estado clínico de cães com leishmaniose visceral / Dynamic of changes of the spleen associated with the clinical status ofdogs with visceral leishmaniasis

Foram avaliadas as alterações esplênicas de cães com leishmaniose visceral, sintomáticos e assintomáticos, em relação ao número de sinais clínicos observados nestes animais. Cães sintomáticos foram divididos em cinco grupos de acordo com o número de sinais clínicos presentes. Nos grupos com três ou mais sinais, houve hipertrofia e hiperplasia dos cordões esplênicos e depleção de células linfóides da bainha periarteriolar. No grupo de cães com apenas um sinal clínico houve depleção de folículos da polpa branca. Hiperplasia dos folículos foi observada em intensidade maior no grupo de cães mostrando mais de cinco sinais clínicos.Granulomas estavam presentes em maior intensidade no grupo de cães exibindo cinco sinais. Granulações eosinofílicas no citoplasma de células plasmáticas (corpúsculos de Russell) foram significativamente maiores no grupo de cães com cinco sinais clínicos em comparação com aqueles com apenas um, dois, três e quatro sinais clínicos e cães assintomáticos. Os resultados mostram que o baço apresenta profundas alterações morfológicas que podem influenciar a evolução da infecção.

Alterations in the spleen of dogs with symptomatic and asymptomatic leishmaniasis have been evaluated with respect to the number of clinical signs observed in such animals. Symptomatic dogs were divided into five groups according to the number of clinical signs presented. In groups with three or more signs, there was hypertrophy and hyperplasia of the splenic cords and depletion of periarteriolar lymphatic sheath cells. In the group of dog with only one clinical sign, a there was follicle depletion in the white pulp. Follicle hyperplasia was higher in the canine group showing more than five clinical signs. Granulomas were present in a greater quantity in the canine group exhibiting five signs. Eosinophil granulations in the cytoplasm of plasma cells (Russell bodies) were significantly greater in the canine group with five clinical manifestations compared to those with only one, two, three and four manifestations and to asymptomatic dogs. The results show that the spleen undergoes profound morphologic changes that can influence the outcome of infection.

Perfil da expressão de ISG15 no sangue periférico durante o período de reconhecimento materno da gestação em bovinos

O período de reconhecimento materno da gestação (RMG) em ruminantes é um evento complexo, envolvendo diversos mecanismos celulares. O período de RMG é caracterizado pela secreção de interferon tau (IFNT) pelas células do trofloblasto do embrião, com maior intensidade aos 18 dias de gestação. A principal função dessa proteína é manter o corpo lúteo em plena atividade, evitando a luteólise. A ação direta do IFNT em tecidos extrauterinos eleva a expressão de genes estimulados por interferon (ISGs destacando-se o gene estimulado por interferon 15 (ISG15). As células polimorfonucleares do sangue periférico (PMN) são mais sensíveis ao estimulo do IFNT comparadas às células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Os objetivos deste estudo são: (1) determinar o tempo mais precoce possível para identificar a expressão de ISG15 em novilhas de corte gestantes; (2) estabelecer a fração celular sanguínea para determinar o diagnóstico precoce de gestação com alta acurácia em novilhas de corte; e, (3) demonstrar o perfil da expressão de ISG15 nos dias 16 e 18 após a inseminação artificial (IA). A sincronização do ciclo estral foi realizada em 28 novilhas. O diagnóstico de gestação foi realizado nos dias 29 e 60 após IA e resultou em 10 novilhas gestantes, 14 novilhas não gestantes, e 4 novilhas não inseminadas (grupo controle negativo). O sangue foi coletado da veia coccígea após a IA (dias 16 e 18). As frações celulares de PBMC e PMN foram coletadas e armazenadas a -80ºC até a posterior manipulação de RNA, cDNA e qPCR. A expressão relativa de ISG15 diferiu entre a fração celular de PMN e PBMC de novilhas gestantes (p < 0,0001). A expressão do ISG15em células PMN no dia 16 diferiu de novilhas gestantes e novilhas não inseminadas (p < 0,04), bem como no dia 18 após IA (p < 0,01). No entanto, a expressão do ISG15 em células PMN no dia 16 não diferiu entre novilhas gestantes e novilhas não gestantes. Em PBMC, a expressão do ISG15 no dia 16 não diferiu entre as novilhas gestantes, não gestantes e não inseminadas. No entanto, no dia 18 após AI, há uma diferença na expressão de ISG15 entre novilhas gestantes e não gestantes (p < 0,02). A expressão de ISG15 nas células PMN aos 16 e 18 de gestação é ao menos 30 vezes maior do que a expressão em PBMC. Além disso, a expressão de ISG15 em PMN pode ser usada para identificação da sinalização embrionária aos 16 e 18 dias após a inseminação em novilhas de corte. A expressão de ISG15 em PMN no dia 18 após a IA resultou em 93% de acurácia para o diagnóstico de gestação. Sugerimos que ambas as frações celulares (PMN e PBMC) podem ser utilizadas como ferramentas para identificar a sinalização embrionária aos 18 dias de gestação em novilhas de corte.

The maternal recognition of pregnancy (MRP) in ruminants is a complex event, involving several cellular mechanisms. It is at that moment that the highest embryonic mortality occurs in cattle. The MRP period is characterized by the secretion of interferon tau (IFNT) by the embryo. IFNT is produced and secreted by the trofloblast cells of the embryo, with greater intensity at 18 days of pregnancy. The main function of this protein is to keep the corpus luteum fully active, avoiding luteolysis. Direct action of IFNT on extrauterine tissues raises the expression of interferon-stimulated genes (ISGs). Among the ISGs stimulated by IFNT, the gene stimulated by interferon 15 (ISG15) stands out. Studies have demonstrated endocrine action of IFNT. An elevation in ISG expression levels in blood and luteal cells was observed shortly after signaling by IFNT at the start of gestation in ruminants. Peripheral blood polymorphonuclear cells (PMN) are more sensitive to the IFNT stimulus compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The objectives of this study are: (1) to determine the earliest possible time to identify ISG15 expression in pregnant heifers; (2) establish the cell fraction to determine the early diagnosis of pregnancy with high accuracy in cut heifers; (3) demonstrate the expression profile of ISG15 on days 16 and 18 after artificial insemination (AI). Synchronization of the estrous cycle was performed in 28 heifers. The pregnancy diagnosis was performed on days 29 and 60 after AI and resulted in 10 pregnant heifers, 14 non-pregnant heifers, and 4 non-inseminated heifers (negative control group). Blood was collected from the coccygeal vein after AI (Days 16 and 18). Cellular fractions of PBMC and PMN were collected and stored at -80 ° C until further extraction of RNA, cDNA and qPCR, respectively. The relative expression of ISG15 differed between the PMN and PBMC cell fraction of pregnant heifers (p <0.0001). ISG15 expression in PMN cells on Day 16 differed from heifers and non-inseminated heifers (p <0.04), as well as on Day 18 after AI (p <0.01). However, ISG15 expression in PMN cells on Day 16 did not differ from pregnant heifers and non-pregnant heifers. In PBMC cells, ISG15 expression on Day 16 did not differ from pregnant, non-pregnant and non-inseminated heifers. However, on Day 18 after AI, there is a difference in ISG15 expression of pregnant and non-pregnant heifers (p <0.02). Expression of ISG15 in PMN cells on Days 16 and 18 pregnancy is greater 30 times than expression in PBMC. In addition, the expression of ISG15 in PMN can be used to identify embryonic signaling on Day 16 after insemination in beef heifers. Expression of ISG15 in PMN on Day 18 after AI resulted in 93% accuracy for the diagnosis of pregnancy. We suggest that both cellular fractions (PMN and PBMC) can be used as a tool to identify embryonic signaling on Day 18 of pregnancy in beef heifers.

Fagocitose intensificada de Corynebacterium pseudotuberculosis por células da série monócito-macrófago de caprinos naturalmente infectados pelo vírus da artrite encefalite / Enhanced phagocytosis of Corynebacterium pseudotuberculosis by monocyte-macrophage cells from goats naturally infected with caprine arthritis encephalitis vírus

A Artrite Encefalite Caprina (AEC) e a Linfadenite Caseosa (LC) possuem alta incidência e transmissibilidade em pequenos ruminantes. Como ambas possuem tropismo por monócitos-macrófagos e afetam mecanismos da resposta inata do hospedeiro, acredita-se que a AEC predispõe o animal a infecções por Corynebacteruim pseudotuberculosis, agente etiológico da LC. Para confirmar esta hipótese, avaliou-se a fagocitose de células da série monócito-macrófago de cabras naturalmente infectadas pelo vírus da AEC (VAEC). Para tanto, foram utilizadas 30 cabras da raça Saanen, alocadas em dois grupos distintos, com 15 animais cada, conforme a sororreatividade de anticorpos séricos antivírus da AEC. Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas por gradiente de densidade e plaqueadas para isolamento de células da série monócito-macrófago. Posteriormente, o ensaio de fagocitose de C. pseudotuberculosis foi realizado, após incubação por duas horas a 37ºC a 5% de CO2, e a visualização da fagocitose foi identificada por microscopia óptica. O presente estudo não encontrou diferença na porcentagem de monócito-macrófagos que realizaram fagocitose entre os diferentes grupos (P = 0,41). Todavia, a análise quantitativa de bactérias fagocitadas, demonstrou maior capacidade fagocítica pelos macrófagos-monócitos do grupo sororreagente ao vírus da AEC. Correlação entre monócitos fagocitando e macrófagos que fagocitaram mais de 12 bactérias foi observado neste grupo (r = 0,488; P = 0,006), não sendo o mesmo encontrado no grupo de animais sorroreagentes negativos. Os dados demonstram aumento na intensidade da fagocitose de macrófagos de animais infectados com o vírus da AEC.(AU)

Caprine arthritis encephalitis (CAE) and caseous lymphadenitis (CL) have high incidence and transmissibility in small ruminants. Since both virus have tropism for macrophages and monocytes and affect the innate immune response, it is believed that CAE can predispose the animal to infection by Corynebacteruim pseudotuberculosis, the etiological agent of CL. To confirm this hypothesis, we evaluated phagocytosis from the monocyte-macrophage cells from 30 Saanen goats. Goats were uniformly divided in two groups according to results of agar gel immunodiffusion test for CAE virus (CAEV). Peripheral blood mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation and the monocyte-macrophage cells were isolated from the mononuclear cells by their adhesion properties in plaques. Afterwards, phagocytosis of C. psudotuberculosis was performed for two hours at 37ºC, 5% of CO2, and assessed by microscopic visualization. There was no difference in the percentage of monocyte-macrophage cells that phagocytozed C. bovis between groups (P=0.41). However, when phagocytosis rates were classified according to the number of C. pseudotuberculosis phagocyted, the percentage of monocyte-macrophage cells that internalized more than 12 bacteria were higher in serologically CAEV positive animals compared to the serologically negative ones (P<0.001). Furthermore, a positive and significant correlation (r = 0.488; P = 0.006) between the percentage of monocyte-macrophage cells that internalized more than 12 bacteria and the percentage of monocyte that were carrying out phagocytosis was also encountered in serologically CAEV positive goats, however the same were not observed in serologically negative ones. These results demonstrated an alteration in the intensity of C. pseudotuberculosis phagocytosis by monocytes-macrophages from goats infected by CAEV. Thus, these results indicated that goats infected with CAEV may be more susceptible to CL.(AU)

Células mononucleares da medula óssea no tratamento da ruptura total dos tendões flexores e ligamento suspensor do boleto em equino / Bone marrow mononuclear cells in the treatment of complete tear of flexor tendons and suspensory ligament in the horse

This paper describes the case of a horse treated in a Teaching Veterinary Hospital. The sutures of the flexor apparatus associated with cell therapy, the stem cell, provided a rapid response of repair compared to other cases treated in routine of the Hospital. The association of conventional treatments with the mononuclear fraction of bone marrow significantly contributed to the reduction of the hyperextension of the metatarsophalangeal joint. Ultrasound images showed rapid fill cell and decrease in inflammation.(AU)

Uso de células mononucleares da medula óssea no tratamento de tendinites induzidas experimentalmente em equinos / The use of mononuclear cells from bone marrow on the treatment of experimentally induced tendinitis in horses

Foram induzidas lesões no tendão flexor digital superficial (TFDS) de ambos os membros anteriores de seis equinos, seguidas de implante autólogo de células da fração mononuclear de medula óssea em apenas um membro de cada animal. Os animais foram avaliados por parâmetros clínicos, ultrassonográficos, histopatológico e imunoistoquímico. Paralelamente, realizou-se o cultivo de novas amostras para a caracterização das células utilizando-se marcadores CD34 e CD45 por meio da citometria de fluxo, confirmando a presença de células mesenquimais na fração mononuclear. A caracterização das fibras colágenas tipo I e tipo III no tecido neoformado mostrou melhora na qualidade da cicatrização tendínea dos membros tratados. A terapia com implante autólogo das células da fração mononuclear melhorou a organização tecidual e a sua qualidade, apresentando maior expressão significativa para colágeno tipo I.(AU)

The present study was developed inducing a lesion in the SDFT of both thoracic limbs of six horses followed by autologous implantation of mononuclear cells from bone marrow in only one affected limb of each horse. The horses were evaluated through clinical and ultrasonography exams, and through histopathology and immunohistochemistry patterns. Concomitantly, new samples were cultivated and characterized using CD34 and CD45 markers, proving the presence of mesenchymal cells in the mononuclear fraction. The characterization of collagen fibers type I and type III in the new tissue has showed an improvement in tendon healing in treated limbs. The therapy with autologous implant of the mononuclear fraction has improved tissue organization and its quality, having a significanlyt higher expression of collagen type I.(AU)

Identification and biological activity of potential probiotic bacterium isolated from the stomach mucus of breast-fed lamb

The lactic acid bacterium E isolated from the stomach mucus of breast-fed lamb was identified by sequencing of 16S rDNA fragment and species-specific PCR as Lactobacillus reuteri. Its potential antimicrobial activity and ability to modulate immune system in vitro and in vivo was determined. The growth inhibition of potential pathogens decreased from Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica ser. Minnesota to Escherichia coli. The lowest inhibition activity was observed in the case of Candida albicans. The ability of L. reuteri E to modulate biological activities of human and mouse mononuclear cells was estimated in vitro and in vivo, respectively. The production of IL-1 by monocytes in vitro was significantly induced by L. reuteri E (relative activity 2.47). The ability to modulate biological activities of mononuclear cells by living L. reuteri E cells in vitro in comparison to disintegrated L. reuteri E cells in vivo differed. For example lysozyme activity in vitro was inhibited while in vivo was stimulated (relative activities 0.30 and 1.83, respectively). The peroxidase activity in vitro was stimulated while in vivo was inhibited (relative activities 1.53 and 0.17, respectively). Obtained results indicate that L. reuteri E is potential candidate to be used in probiotic preparations for animals and/or human.

Identification and biological activity of potential probiotic bacterium isolated from the stomach mucus of breast-fed lamb

The lactic acid bacterium E isolated from the stomach mucus of breast-fed lamb was identified by sequencing of 16S rDNA fragment and species-specific PCR as Lactobacillus reuteri. Its potential antimicrobial activity and ability to modulate immune system in vitro and in vivo was determined. The growth inhibition of potential pathogens decreased from Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica ser. Minnesota to Escherichia coli. The lowest inhibition activity was observed in the case of Candida albicans. The ability of L. reuteri E to modulate biological activities of human and mouse mononuclear cells was estimated in vitro and in vivo, respectively. The production of IL-1 by monocytes in vitro was significantly induced by L. reuteri E (relative activity 2.47). The ability to modulate biological activities of mononuclear cells by living L. reuteri E cells in vitro in comparison to disintegrated L. reuteri E cells in vivo differed. For example lysozyme activity in vitro was inhibited while in vivo was stimulated (relative activities 0.30 and 1.83, respectively). The peroxidase activity in vitro was stimulated while in vivo was inhibited (relative activities 1.53 and 0.17, respectively). Obtained results indicate that L. reuteri E is potential candidate to be used in probiotic preparations for animals and/or human.

ANATOMO-HISTOPATOLOGIA DE FÍGADOS BOVINOS: RELAÇÃO ENTRE AS LESÕES E OS SISTEMAS DE PRODUÇÃO

A inspeção da carcaça e órgãos nos abatedouros objetiva limitar o aproveitamento de produtos impróprios para consumo humano, protegendo a população contra doenças transmitidas pelos alimentos. O fígado é uma víscera nutritiva e bem aceita pelos consumidores, mas suas funções metabólicas o tornam susceptível a diversas lesões, fazendo com que seja condenado frequentemente na rotina de inspeção. Este estudo analisou fígados bovinos e relacionou as lesões macro e microscópicas com os sistemas de produção dos animais abatidos (sistemas intensivo, semi-intensivo e extensivo). Avaliou também a presença de lesão microscópica em fígados sem lesão macroscópica. Foram coletadas 450 amostras de fígado bovino dos diferentes sistemas de produção, as quais foram processadas para exame histológico. As alterações macroscópicas observadas nos fígados bovinos foram: fibrose capsular (32%), aderências/peri-hepatite (25,8%), teleangiectasia (24,4%), manchas pálidas ou amareladas (20,9%), hemorragia subcapsular (7,1%), abscessos (5,3%), granulomas (3,5%), congestão (1,8%) e cistos (0,9%). Os achados microscópicos foram: infiltrado inflamatório mononuclear (66,4%), macrófagos espumosos (40,9%), tumefação hepatocelular (30%), tumefação hepatocelularcentrolobular (22,7%), fibrose capsular (26,4%), degeneração gordurosa (15,1%), peri-hepatite (13,8%), necrose (13,5%), teleangiectasia (12,2%), abscessos (2,9%), granulomas (1,8%), congestão (16%), hemorragia subcapsular (4,6%), infiltrado inflamatório polimorfonuclear (2,5%), infiltrado inflamatório misto (8,7%), hiperplasia ductal (4,9%) e cistos (0,9%). As lesões que apresentaram relação com os sistemas de produção (P<0,05) foram: infiltrado inflamatório mononuclear, macrófagos espumosos e tumefação hepatocelular. Os fígados de bovinos criados em sistema intensivo apresentaram mais lesões macroscópicas e os fígados de bovinos criados em sistema extensivo apresentaram mais lesões microscópicas. Somente 19,5% dos fígados sem lesão macroscópica não apresentaram nenhum tipo de lesão microscópica. Conclui-se que o sistema de produção pode influenciar na ocorrência de algumas lesões hepáticas e que fígados sem lesão macroscópica, liberados para consumo humano, podem apresentar várias lesões microscópicas importantes.

The inspection of cattle carcasses and organs at slaughterhouses aims at limiting the use of products with abnormalities that makes them improper for human consumption, thereby protecting the public from food-borne diseases. The liver is a nutritious viscera and it is well accepted by consumers. However, its metabolic functions make it susceptible to various injuries, which often condemn it during inspections routine. This study evaluated bovine livers and linked the macro and microscopic lesions found to the beef cattle production systems (intensive, semi intensive and extensive). Also evaluated the presence of microscopic lesions on livers without macroscopic findings. Some 450 samples of beef liver were collected from various production systems and were processed for histological examination. Macroscopic changes observed on the samples were: capsular fibrosis (32%), adhesions/perihepatitis (25.8%), telangiectasia (24.4%), pale or yellowish spots (20.9%), subcapsular hemorrhage (7.1%), abscesses (5.3%), granulomas (3.5%), congestion (1.8%) and cysts (0.9%). Microscopic findings were mononuclear cell infiltration (66.4%), foamy macrophages (40.9%), hepatocellular swelling (30%), centrilobular swelling (22.7%), capsular fibrosis (26.4%), fatty degeneration (15.1%), perihepatitis (13.8%), necrosis (13.5%), telangiectasia (12.2%), abscesses (2.9%), granulomas (1.8%) congestion (16%), subcapsular hemorrhage (4.6%), polymorphonuclear inflammatory infiltrate (2.5%), mixed inflammatory infiltrate (8.7%), ductal hyperplasia (4.9%) and cysts (0.9%). Those injuries related to production systems (P<0.05) were: mononuclear cell infiltration, foamy macrophages and cellular swelling. The livers of bovines raised in extensive system present more macroscopic lesions and the livers of bovines raised in intensive system present more microscopic lesions. Only 19.5% of livers without macroscopic findings did not show histopathological lesions. This study concludes that beef cattle production systems can influence the occurrence of some liver lesions and that liver without macroscopic findings, released for human consumption may have several important microscopic lesions.

Decanoato de nandrolona no hemograma e nas células mononucleares da medula óssea de ratos Wistar hígidos

Nandrolone Decanoate (ND), a hematopoietic system stimulant, is characterized as an accessible medicament for low-income pet owners. The aim of this research is to study the effect of different ND doses in the blood cytological parameters and the quantification and viability of the bone marrow (BM) mononuclear cells (MC), together with the labeling of CD34+ hematopoietic stem cells of healthy Wistar rats. Forty eight animals were randomly separated into six different groups of treatment, each composed of eight animals. These groups were divided in: G1 - control group (physiologic solution); G2 - diluent control (only vegetal oily vehicle); G3 - ND 0.42mg kg-1; G4 - ND 1.8mg kg-1; G5 - ND 4.6mg kg-1 and G6 - ND 10.0mg kg-1. The drug was weekly applied for three weeks. The hematologic and medullar analyzed parameters showed no significant difference between the groups, which may have been influenced by the BM conditions or by the applications frequency. According to the results obtained and according to the conditions under which this research was developed, it can be concluded that ND did not affect the blood cytological parameters, quantification and viability of MC and CD34+ labeling in healthy Wistar rats.

O decanoato de nandrolona (DN), um estimulante do sistema hematopoético, caracteriza-se por ser um medicamento acessível aos proprietários de animais com escassos recursos econômicos. Assim, este estudo objetivou avaliar o efeito de diferentes doses do DN no hemograma e na quantificação e a viabilidade das células mononucleares (CM) da medula óssea (MO), juntamente com a marcação das células hematopoéticas CD34+ de ratos Wistar saudáveis. Para isso, 48 animais foram separados em seis tratamentos, de forma aleatória, com oito animais cada. Os grupos foram constituídos por: G1 - controle (solução fisiológica); G2 - controle diluente (somente veículo oleoso de origem vegetal); G3 - 0,42mg kg-1 de DN; G4 - 1,8mg kg-1 de DN; G5 - 4,6mg kg-1 de DN; e G6 - 10,0mg kg-1 de DN. O fármaco foi aplicado semanalmente por três semanas. Os parâmetros hematológicos e medulares avaliados não tiveram diferença significativa entre os grupos, o que pode ter sido influenciado pela condição da MO ou pelo intervalo entre as doses. De acordo com os resultados obtidos e nas condições em que esta pesquisa foi desenvolvida, pode-se concluir que o DN não altera o hemograma, a quantificação e a viabilidade das CM e a marcação de CD34+ em ratos wistar saudáveis.

Decanoato de nandrolona no hemograma e nas células mononucleares da medula óssea de ratos Wistar hígidos

Nandrolone Decanoate (ND), a hematopoietic system stimulant, is characterized as an accessible medicament for low-income pet owners. The aim of this research is to study the effect of different ND doses in the blood cytological parameters and the quantification and viability of the bone marrow (BM) mononuclear cells (MC), together with the labeling of CD34+ hematopoietic stem cells of healthy Wistar rats. Forty eight animals were randomly separated into six different groups of treatment, each composed of eight animals. These groups were divided in: G1 - control group (physiologic solution); G2 - diluent control (only vegetal oily vehicle); G3 - ND 0.42mg kg-1; G4 - ND 1.8mg kg-1; G5 - ND 4.6mg kg-1 and G6 - ND 10.0mg kg-1. The drug was weekly applied for three weeks. The hematologic and medullar analyzed parameters showed no significant difference between the groups, which may have been influenced by the BM conditions or by the applications frequency. According to the results obtained and according to the conditions under which this research was developed, it can be concluded that ND did not affect the blood cytological parameters, quantification and viability of MC and CD34+ labeling in healthy Wistar rats.

O decanoato de nandrolona (DN), um estimulante do sistema hematopoético, caracteriza-se por ser um medicamento acessível aos proprietários de animais com escassos recursos econômicos. Assim, este estudo objetivou avaliar o efeito de diferentes doses do DN no hemograma e na quantificação e a viabilidade das células mononucleares (CM) da medula óssea (MO), juntamente com a marcação das células hematopoéticas CD34+ de ratos Wistar saudáveis. Para isso, 48 animais foram separados em seis tratamentos, de forma aleatória, com oito animais cada. Os grupos foram constituídos por: G1 - controle (solução fisiológica); G2 - controle diluente (somente veículo oleoso de origem vegetal); G3 - 0,42mg kg-1 de DN; G4 - 1,8mg kg-1 de DN; G5 - 4,6mg kg-1 de DN; e G6 - 10,0mg kg-1 de DN. O fármaco foi aplicado semanalmente por três semanas. Os parâmetros hematológicos e medulares avaliados não tiveram diferença significativa entre os grupos, o que pode ter sido influenciado pela condição da MO ou pelo intervalo entre as doses. De acordo com os resultados obtidos e nas condições em que esta pesquisa foi desenvolvida, pode-se concluir que o DN não altera o hemograma, a quantificação e a viabilidade das CM e a marcação de CD34+ em ratos wistar saudáveis.

UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA PARA O TRATAMENTO DE SEQUELAS NEUROLÓGICAS DE CINOMOSE CANINA CURITIBA

A cinomose é uma doença infecciosa causada por um Morbillivirus pertencente a família Paramyxoviridae. Até 30% dos cães infectados com o vírus da cinomose apresentam complicações neurológicas e aproximadamente 10% morrem por leucoencefalite aguda. Os cães que recuperam podem apresentar sequelas permanentes. Até o momento, não existe nenhum tratamento específico para animais com sinais neurológicos da cinomose, assim, são necessárias novas intervenções terapêuticas. O transplante de células-tronco tem emergido como um novo e promissor modelo de terapia. Células mononucleares derivadas da medula óssea (CMNMO) podem ser isoladas e aplicadas como estratégia terapêutica em estudos clínicos e pré-clínicos. Porém, existem alguns desafios associados a essa abordagem terapêutica. Um deles é a falta de estudos sobre a caracterização das CMNMO dos cães. Heparina e citrato-fosfato-dextrose-adenina-1 (CPDA-1) são comumente utilizados para coletar medula óssea. Porém, o efeito destes anticoagulantes em termos de isolamento dessas células também não é conhecido. Outro ponto que precisa ser mais estudado é a via de administração para ação eficiente das células transplantadas. A via intravenosa (IV) tem sido utilizada porque é o método mais fácil e menos invasivo de transplante de células. A marc

Canine distemper is an infectious disease caused by a Morbillivirus belonging to Paramyxoviridae family. Up to 30% of dogs infected with canine distemper virus showed neurological complications and approximately 10% die from acute leukoencephalitis. In addition, dogs that recover may have permanent sequels. There is no specific therapy for animals showing distemper neurological signs, and new therapeutic interventions are necessary, and cell transplantation has emerged as a promising new therapy model. Bone marrow mononuclear cells (BMMNC) can be easily isolated and broadly applied as a therapeutic strategy in a large number of preclinical and clinical studies. However, there are some challenges associated with this therapeutic approach. One of them is the lack of studies on the characterization of canine BMMNC. Heparin and citrate-phosphate-dextrose-adenine-1 (CPDA-1) are commonly used to harvest bone marrow. However, the comparison of effect of anticoagulants at harvest on terms of stem cell yield has not been studied. Another point that needs to be further studied is the route of administration for efficient cell delivery. Intravenous (IV) delivery has been used because it is easier and less invasive method of cell transplantation. The labelling and tracking of cells allow to evaluate if IV transplanted cells are attracted to the site of injury. The PKH26 is a fluorescent labeling molecule, noncytotoxic and is stable for long time period. Because of these characteristics, this dye seems to be ideal for cells tracking. The characterization of subsets of BMMNC and a better understanding of the functions of these cells may contribute to the knowledge of their potential and thus increase the possibilities to their use for clinical trials in veterinary medicine. The BMMMC administered intravenously have a lung passage 30 times larger than the mesenchymal stem cells (MSC), facilitating the migration of these cells to the injured tissues. However, the migration of these cells to the central nervous system (CNS), after intravenous administration, in animals with canine distemper sequels has not been studied. The PKH is a fluorescent labelling molecule, which is incorporated in the lipid bilayer of the cytoplasmic membrane, which has been used for the identification of cell migration. After incorporated into the cells in vitro, the PKH is not transferred to the medium or to unmarked cells, and has no toxic or immunogenic effect. BMMNC can be labeled with PKH and used for transplant intravenously, so this dye appears to be ideal for monitoring the migration of these cells. The aims of this study were the comparison of the yield of bone marrow-derived mononuclear cells harvested from dogs with two different anticoagulants, evaluate cell migration after allogeneic BMMNC transplantation in 10 animals with neurological complications of canine distemper, characterize phenotypically canine BMMNC and, evaluate the safety and efficacy of allogeneic BMMNC transplantation for treatment of neurological sequels of canine distemper in others 23 dogs. For comparison of the anticoagulants, the bone marrow from five dogs was harvest in heparin or CPDA-1, isolated in a density gradient, and stained for CD9 and CD44 for characterization by flow cytometry. The means were compared using Students paired t-test. Samples harvested with CPDA-1 yielded an average of 5.16 x 106 (±1.76 x 106) to 20.20 x 106 (±1.55 x 106) mononuclear cells/mL, whereas the yield of samples harvested with heparin varied between 4.56 x 106 (±0.69 x 106) and 24.30 x 106 (±2.12 x 106) mononuclear cells/mL. By flow cytometry, the mean percentage of double-stained cells varied from 1.96% (±0.64%) to 5.01 % (±0.73%) for CPDA-1 and from 2.23% (±0.70%) to 7.27 % (±0.97%) for heparin. No significant statistical differences were observed on yield or CD9 and CD44 expression. Bone marrow was harvested from eight donors and BMMNC were isolated, labeled with PKH26 dye and IV transplanted into the patients, to assess the labelling and tracking of cells. The cell migration was assessed in the cerebrospinal fluid (CSF) of patients at different periods of time and the percentage of labeled cells with PKH 26 dye was evaluated quantitatively by flow cytometry and qualitatively by fluorescence microscope. In the quantitative analysis by flow cytometer, it was observed a wide variation in the percentage of labeled cells in different CSF collection times. Also, there was an increase on the percentage of PKH26-labeled cells in the CSF, with highest percentage between 4 and 5 ½ hours after infusion with subsequent decrease. In the qualitative analysis, it was showed the presence of labeled BMMNC recruited by central nervous system on CSF. In order to evaluate the safety and efficacy of allogeneic BMMNC transplantation for treatment of neurological sequels of canine distemper, it was used a single blind randomized controlled trial in 46 dogs divided into treatment group and control group with weekly follow-up for 35 days. Bone marrow was harvested from 23 healthy donors and BMMNC were isolated by density gradient centrifugation. BMMNC from four donors were labeled with anti-CD8a, CD9, CD14, CD29, CD34, CD44, CD45, and CD90 for phenotypic characterization. Dogs from the treatment group received 1 x 108 BMMNC intravenously. Regarding the safety of cell transplantation, no serious adverse events related to the procedure were recorded during the 35 days of the study. Functional recovery was evaluated according to the Olby scoring system with some modifications. For the treatment group, the median and interquartile range of the functional score, with 0, 7, 14, 21, 28 and 35 days after injection were 7 (4-13), 9 (5-14), 12 (6-15), 14 (6-15), 14 (6-16), and 14 (6-16) respectively, whereas for the placebo group they were 6 (4-12), 7 (4- 13), 7 (4-12), 7 (4-12), 6 (3-12), and 6 (3-12). The differences observed were statistically significant (p < 0.05), showing the effectiveness of BMMNC transplantation in dogs with distemper leukoencephalitis. In conclusion, this study demonstrates that BMMNC can be efficiently labeled with PKH26 dye and these cells can be monitored after IV transplantation in animals with neurological complications of canine distemper.

Transplante autólogo de células mononucleares da medula óssea em úlcera de córnea experimental em cães / Bone marrow mononuclear cells autotransplant in experimental corneal ulcer in dogs

As células mononucleares (CM) da medula óssea (MO) despertam grande interesse nas pesquisas sobre regeneração tecidual. O limbo é a fonte de células-tronco (CT) para repor ceratócitos lesados e uma disfunção destas é denominada deficiência límbica. Essa condição é desenvolvida por diversas afecções, sendo que a queimadura por base é a mais comum. A fim de confirmar a presença das CM da MO transplantadas, a ocorrência de quimiotaxia destas e comparar histopatologicamente os grupos tratado e controle, utilizou-se um modelo experimental de úlcera de córnea associado ao autotransplante de CM. Para tanto, 16 cães machos ou fêmeas, sem raça definida, foram submetidos à úlcera experimental de córnea com papel filtro embebido em hidróxido de sódio (NaOH). Após as lesões, os animais foram submetidos a transplante subconjuntival de CM da MO, previamente marcadas com nanocristais. A avaliação pós-operatória foi realizada por imunofluorescência no sexto dia após o transplante e por histopatologia passados 15 dias do procedimento, quando foi possível notar que as CM fixaram-se na região lesionada, não sofreram quimiotaxia e, apesar de diminuírem a inflamação, não auxiliaram o processo de cicatrização corneana a curto prazo. Assim, sugerem-se estudos adicionais no transplante de CM da MO na cicatrização da córnea.(AU)

Bone marrow (BM) mononuclear cells (MC) are a great subject in tissual regeneration. The main stem cell source to the eye is the limbus. Theses cells replace injured corneal cells, however, if the limbal stem cells are not functional, a limbal deficiency with concomitant conjunctivalization takes place. This pathological condition can be caused for several reasons, in which alkali burns are the most common. To conduct a research about transplanted BM MC presence, the cells homing and to histopathologically compare the treated and sham group, an experimental corneal ulcer model associated with MC autotransplant was used. Sixteen, male or female, stray dogs suffered experimental corneal ulceration with sodium hydroxide soaked filter discs. After the lesions, animals were submitted to subconjunctival autotransplant of previously marked BM MC. The evaluation was made by immunofluorescence on the sixth day after lesions creation and histopathology was conducted 15 days after the same procedure, when it was possible to observe that the MC grafted in the injured area, the cells did not execute the homing process and, despite the inflammatory decrease, they did not help the corneal epithelial healing process in a short term evaluation. Thus, future studies about MC transplantations in corneal ulcers are indicated.(AU)

Colheita de medula óssea em cães: modelo para obtenção da fração total de células mononucleares / Bone marrow harvest in dogs: model for acquisition of the total fraction of mononuclears cells

No presente trabalho foi elaborada uma técnica para protocolo de colheita de medula óssea (MO) (10ml. kg-1), do osso femoral, para isolamento, quantificação e viabilidade da fração total de células mononucleares (CM). Para tanto, 40 cães machos ou fêmeas, sem raça definida, com idade aproximada de dois anos, pesando em torno de 10kg, foram submetidos a procedimento asséptico em ambiente cirúrgico para colheita de MO. Para a obtenção de uma quantidade suficiente de CM, durante o procedimento foi utilizada a agulha tipo Steis anatômica, que favoreceu a colheita de volume sangüíneo em menor espaço de tempo e não danificou a viabilidade celular. Também foi utilizado o Kit Bone Marrow collection, que teve a finalidade de filtrar as espículas ósseas, mantendo a integridade das CM colhidas durante o período decorrido para o acondiconamento do sangue. Durante o período da colheita de MO, os animais foram submetidos à collheita de sangue periférico (pré, trans e pós-operatório) para avaliações hematológicas e sofreram autotransfusão sangüínea para suprir a queda acentuada de hemoglobina ocorrida nos primeiros momentos da coletaheita. O total de MO colhida e filtrada foi colocado lentamente sob gradiente de densidade Histopaque (1.077g ml-1). O material foi centrifugado a 440 x g por 30 minutos e o anel de células foi colhido, lavado e centrifugado três vezes em meio contendo solução salina 0,9 por cento, DMEM e soro sangüíneo autólogo estéril. Foi realizada a contagem do anel celular em câmara de Neubauer e foi verificada sua viabilidade utilizando corante vital. Neste estudo foi verificado que no volume de MO colhido foi possível obter a média de 2,57 x 10(6) (± 1,56) CM kg-1 e a viabilidade celular foi superior a 90 por cento (96,72 ± 2,9 por cento). Conclui-se que a técnica de colheita de MO com agulha Steis com lavagem celular no meio contendo soro autólogo e Kit Bone Marrow e agulha Steis com lavagem celular no meio contendo...(AU)

In the present research a new protocol to harvest 10ml kg-1 femoral bone marrow (BM) was developed to allow isolation, quantification and to test the mononuclear cell (MC) fraction viability. Forty male or female stray dogs, aging and weighting around two years old and 10kg respectively, were submitted to aseptic bone marrow harvest in a surgical environment. To achieve an ideal cell count of MC, an anatomical Steis needle was used during the procedure, which favored the indicated volume harvest in a shorter period of time without interfering cellular viability. A bone marrow collection kit was also used to filter bone fragments while maintaining harvested MC integrity during blood packaging. Meanwhile BM harvesting was conducted, animals peripheral blood collection was performed (pre, trans and post-operatory) to hematological evaluations and autologous blood transfusion was made to overcome the increased hemoglobin fall that takes place in the initial harvesting moments. The harvested and filtered BM was slowly placed over a Histopaque density gradient (1.077g ml-1). The material was centrifuged at 440g x for 30 minutes. The cellular ring was harvested, washed and three times centrifuged in saline 0.9 percent, DMEM and autologous sterile serum. Cellular ring count was conducted in neubauer chamber and its viability was performed with vital dye. In this study was possible to notice that with the harvested BM volume an average of 2.57 x 10(6) (± 1.56) MC kg-1 was obtained and the cell viability was over 90 percent (96.72 ± 2.9 percent). It was concluded that the bone marrow kit and Steis needle with autologous serum cellular wash BM harvesting technique allow an ideal MC number isolation which can be administered in tissue lesions to enhance the regeneration process.(AU)

Effect of L-Arginine and L-NAME treatments on polymorphonuclear leukocytes and mononuclear cells influx during tumor growth / Efeito dos tratamentos com L-Arginina e L-NAME sobre o influxo de leucócitos polimorfonucleares e células mononucleares durante o desenvolvimento tumoral

PURPOSE: Evaluate polymorphonuclear leukocytes (PMN's) and mononuclear cells (MN's) involvement in the Ehrlichïs solid tumor (ET) growth. METHODS: 90 Swiss mice were inoculated with 10(7) tumor cells (sc), distributed in three groups and treated once a day, via intraperitoneal (ip), with 0.1ml of diluent, L-Arginine (20mg/Kg) or L-NAME (20mg/Kg). After 7, 15 and 30 days of treatment, ten animals of each group were euthanized, the tumor mass was removed, processed and fixed for HE. Later, a morphometric analysis of the total area, parenchyma, necrosis, tumor stroma and PMN's leukocytes and MN's cells influx was performed. RESULTS: The L-Arginine treatment increased PMN's influx in the initial stage, whereas L-NAME reduced it. Our data suggests that NO effect on PMN's migration is dose-dependent. On the other hand, the MNïs cells influx was reduced by L-NAME treatment at all evaluated periods and at the same periods an increase in tumor growth was observed. CONCLUSION: At initial stages of tumor implantation, both PMN's leukocytes and MN's cells act together to control ET development.(AU)

OBJETIVO: Avaliar o envolvimento de leucócitos polimorfonucleares (PMN's) e células mononucleares (MN's) no crescimento do Tumor Sólido de Ehrlich (TE). MÉTODOS: 90 camundongos Suíços foram inoculados com 10(7) células tumorais (sc), distribuídos em três grupos e tratados uma vez ao dia, via intraperitoneal (ip), com 0.1ml de diluente, L-Arginina (20mg/Kg) ou L-NAME (20mg/Kg). Após 7, 15 e 30 dias, dez animais de cada grupo foram eutanasiados, a massa tumoral foi removida, processada e corada pela HE. Posteriormente, foi realizada análise morfométrica das áreas total, parênquima, necrose, estroma e influxo de leucócitos PMN's e células MN's. RESULTADOS: O tratamento com L-Arginina favoreceu o influxo de PMN's em períodos iniciais, enquanto o tratamento com L-NAME o reduziu. Nosso estudo sugere que o efeito do ON sobre a migração de PMN's é dose-dependente. Por outro lado, o influxo de células MNïs foi contido pelo tratamento com L-NAME em todos os períodos avaliados, mesmos períodos em que se observou um aumento no crescimento tumoral. CONCLUSÃO: Em fases iniciais do implante tumoral, ambos, leucócitos PMN's e células MN's, atuam juntos no controle do desenvolvimento do TE.(AU)