Low invasive estrous synchronization protocol for wild animals: an example with melengestrol acetate in brown brocket deer (Mazama gouazoubira)

Deer are sensitive to stressful stimuli by handling and their reproductive physiology could be altered by these procedures, making it necessary to develop less invasive protocols for ART. Melengestrol acetate (MGA), a synthetic progestin administered orally, appears as an alternative for estrous synchronization protocols (ESP), such as reported in cattle. Firstly, we compared two MGA doses (0.5 and 1.0 mg/day/animal), which would have suppression effect in estrous behavior (EB). Eight females were randomly and equally distributed in Group 1 (G1) and Group 2 (G2), which received 0.5 and 1.0 mg/day/animal respectively for 15 days (D1 to D15). Two cloprostenol (CP) applications were performed on D0 and D11. Estrus detection (ED) was performed every day. All females from G1 displayed estrus during treatment period, whereas all females from G2 displayed estrus after treatment, suggesting a suppressive effect of 1.0 mg in the EB. Once the suppressive MGA dose (1.0 mg) was defined, we used this dose for assessing ESP. The same eight females received 1.0 mg/animal for eight days (D-8 to D-1), followed by 0.25 mg of estradiol benzoate on D-8 and 265 g of CP on D0. Feces for fecal progesterone metabolites (FPM) measurement were collected from D0 until seven days after the last day of estrus. Seven females displayed estrus between 12 and 72 h after CP application, which was followed by a significant increase in FPM levels (except female MG6), suggesting the formation of corpus luteum. After ED, females were placed with a fertile male to assess the fertility of the protocol. Pregnancy was confirmed by ultrasound 30 days after mating in 3/6 individuals. Although the low effectiveness of MGA protocol, it should be considered as a promising alternative in deer ESP since this protocol has less stressful effect on the animal during reproductive management when compared to other ESP.

Low invasive estrous synchronization protocol for wild animals: an example with melengestrol acetate in brown brocket deer (Mazama gouazoubira)

Deer are sensitive to stressful stimuli by handling and their reproductive physiology could be altered by these procedures, making it necessary to develop less invasive protocols for ART. Melengestrol acetate (MGA), a synthetic progestin administered orally, appears as an alternative for estrous synchronization protocols (ESP), such as reported in cattle. Firstly, we compared two MGA doses (0.5 and 1.0 mg/day/animal), which would have suppression effect in estrous behavior (EB). Eight females were randomly and equally distributed in Group 1 (G1) and Group 2 (G2), which received 0.5 and 1.0 mg/day/animal respectively for 15 days (D1 to D15). Two cloprostenol (CP) applications were performed on D0 and D11. Estrus detection (ED) was performed every day. All females from G1 displayed estrus during treatment period, whereas all females from G2 displayed estrus after treatment, suggesting a suppressive effect of 1.0 mg in the EB. Once the suppressive MGA dose (1.0 mg) was defined, we used this dose for assessing ESP. The same eight females received 1.0 mg/animal for eight days (D-8 to D-1), followed by 0.25 mg of estradiol benzoate on D-8 and 265 g of CP on D0. Feces for fecal progesterone metabolites (FPM) measurement were collected from D0 until seven days after the last day of estrus. Seven females displayed estrus between 12 and 72 h after CP application, which was followed by a significant increase in FPM levels (except female MG6), suggesting the formation of corpus luteum. After ED, females were placed with a fertile male to assess the fertility of the protocol. Pregnancy was confirmed by ultrasound 30 days after mating in 3/6 individuals. Although the low effectiveness of MGA protocol, it should be considered as a promising alternative in deer ESP since this protocol has less stressful effect on the animal during reproductive management when compared to other ESP.(AU)

SEGREGAÇÃO GAMÉTICA DE CROMOSSOMOS ENVOLVIDOS EM TRANSLOCAÇÕES E SEU PAPEL NO ISOLAMENTO REPRODUTIVO DE ESPÉCIES DO GÊNERO Mazama (MAMMALIA; CERVIDAE)

A família Cervidae destaca-se por possuir uma das maiores taxas de evolução cariotípica dentre os mamíferos, reflexo de uma fragilidade cromossômica acentuada, que facilita a ocorrência de quebras e rearranjos cromossômicos. Estas, quando vinculadas ao isolamento geográfico em um curto período, poderiam levar as populações a um processo de especiação. Isso é evidenciado na ampla diversificação cariotípica da família, apresentando exemplos extremos de baixo e alto número diploide, como Muntiacus muntjak (2n = 6/7) e Capreolus pygargus (2n = 70 + 1 14 Bs), respectivamente. Muitas espécies crípticas estão escondidas pela grande similaridade morfológica, acompanhada de ampla variação cariotípica, intra e interespecífica. Animais portadores de rearranjos cromossômicos podem apresentar diferentes padrões na segregação meiótica durante a espermiogênese, dando passo à formação de gametas desbalanceados. Isso pode estar relacionado com desordens reprodutivas, como evidenciado em animais domésticos, onde é observada a queda da capacidade reprodutiva. A técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) permite a marcação, identificação e localização dos cromossomos envolvidos nas translocações a partir de sondas de DNA com marcadores fluorescentes. Dada a falta de sondas específicas para espécies de cervídeos, diversos estudos apontam para o uso de sondas bovinas devido ao conhecido mapa genético bovino e à proximidade filogenética entre as famílias Cervidae e Bovidae. Dessa forma, a aplicação da FISH em células espermáticas (também chamada de sperm-FISH) permite estimar a proporção de gametas normais/balanceados e desbalanceados (portadores de aneuploidias). Assim, o presente estudo teve como objetivo: a) Estimar a proporção dos produtos da segregação meiótica em indivíduos portadores de translocações cromossômicas dentro do gênero Mazama, b) Avaliar os potenciais efeitos dos rearranjos cromossômicos na aptidão reprodutiva dos portadores, e c) Avaliar o papel dos rearranjos cromossômicos nos processos de especiação dentro do gênero Mazama. Na espécie M. gouazoubira foi possível avaliar uma translocação Robertsoniana (TR) em quatro animais, sendo que dois incluíam a presença de uma inversão paracêntrica (IPA). O valor médio dos espermatozoides desbalanceados nos portadores da TR/IPA (6,68%) quase dobrou em relação àquele dos portadores de TR (3,76%), mas não houve diferença significativa. Na espécie M. americana, foram avaliadas TRs em diferentes citótipos e fusões em tandem (FT) heterozigotas em híbridos entre citótipos da mesma linhagem cromossômica. Os portadores de TR apresentaram valor médio para a taxa de segregação adjacente de 1,80% e os portadores da FT apresentaram valor médio de 29,07% para os produtos equivalentes a aqueles da segregação adjacente na TR. Nossos resultados indicam um impacto de baixo a moderado do rearranjo cromossômico na aptidão reprodutiva dos machos de M. gouazoubira heterozigotos para TR e TR/IPA e um impacto baixo no caso das TRs em M. americana. No caso dos híbridos de M. americana portadores de FT em heterozigose, os resultados sugerem a formação de uma barreira pós-zigótica eficiente representada pela redução severa da fertilidade dos indivíduos.

The family Cervidae stands out for showing one of the highest rates of karyotype evolution among mammals, reflecting a marked chromosomal fragility. Thus, the occurrence of chromosomal breaks and rearrangements is facilitated and lead populations to process of speciation when linked to geographic isolation in a short period. Besides, a wide karyotype diversification of the family has been observed in their extreme examples of low and high diploid numbers, such as Muntiacus muntjak (2n = 6/7) and Capreolus pygargus (2n = 70 + 1 14 Bs), respectively. Many cryptic species are hidden due to the great morphological similarity, accompanied by wide intra and interspecific karyotypic variation. Thus, animals with chromosomal rearrangements may present different patterns of meiotic segregation during spermiogenesis, giving way to the formation of unbalanced gametes. This can be related to reproductive disorders, as observed in domestic animals with reproductive fitness reduction. The fluorescent in situ hybridization (FISH) technique allows the marking, identification, and location of the chromosomes involved in translocations using DNA probes with fluorescent markers. Given the lack of specific probes for deer species, several studies point to the use of bovine probes due to the well-known bovine genetic map and the phylogenetic proximity between families Cervidae and Bovidae. Thus, the application of FISH in sperm cells (also called sperm-FISH) allows estimating the proportion of normal/balanced and unbalanced gametes (carriers of aneuploidies). The present study aimed to a) Estimate the mean rate of meiotic segregation products in carriers of chromosomal translocations within the genus Mazama, b) Assess the potential effects of chromosomal translocations on the reproductive fitness of carriers, and c) Assess the role of chromosomal polymorphisms in speciation processes within the genus Mazama. In the M. gouazoubira species, it was possible to evaluate a Robertsonian translocation (RT) in four animals, two of which included the presence of a paracentric inversion (PAI). The mean value of unbalanced gametes in carriers of the RT/PAI (6.68%) almost doubled in relation to that of carriers with the RT (3.76%); however, no significant difference was observed. Regarding M. americana, RTs were evaluated in different cytotypes and heterozygous tandem fusion (TF) was evaluated in hybrids from the same chromosomal lineage cytotypes. Carriers of RT showed a mean value for the adjacent segregation rate of 1.80% and carriers of TF showed a mean value of 29.07% for products equivalent to those of the adjacent segregation in RT. Our results indicate low to moderate impacts of chromosomal rearrangement on the reproductive fitness of M. gouazoubira heterozygotes for RT and RT/PAI and a low impact in the case of RTs in M. americana. In the case of M. americana hybrids with heterozygous TF, our results suggest an efficient postzygotic barrier represented by the severe reduction in the individuals' fertility.

AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS DE SUPEROVULAÇÃO EM CERVOS-DO-PANTANAL (Blastocerus dichotomus)

O cervo-do-pantanal (Blastocerus dichotomus) é uma espécie emblemática dentro dos cervídeos neotropicais. Nas últimas décadas, suas populações têm sofrido declínio notório devido, principalmente, à destruição do seu habitat. Isto causa a perda da diversidade genética, que junto à depressão endogâmica (pelo isolamento de pequenas populações) pode levar à espécie a extinções locais. Nesse contexto, as técnicas de reprodução assistida podem auxiliar no processo de manutenção da diversidade genética nestas populações isoladas. Desta forma, o objetivo deste estudo foi elaborar um protocolo de superovulação para cervo-do-pantanal em cativeiro. Assim, foram testados protocolos sucessivamente (A, B, C) até que fossem obtidos resultados satisfatórios. Para que se pudesse chegar a um protocolo viável, foram testadas três combinações farmacológicas. Tratamento A: CIDR® durante sete dias, seguido de 0,5 mg de BE e 0,11 mg de GnRH no dia 0, 800UI de eCG no dia 5 após inserção do CIDR®, 530 µg de PGF2 no dia 7 e 0,11 mg de GnRH logo após a detecção do estro, para a indução da ovulação. Tratamento B: CIDR® durante oito dias, seguido de 0,5 mg de BE e 0,11 mg de GnRH no dia 0, 1200UI de eCG no dia 5 após inserção do CIDR®, 530 µg de PGF2 no dia 8 e 0,11 mg de GnRH logo após a detecção do estro, para a indução da ovulação. Tratamento C: CIDR® durante oito dias, seguido de 0,5 mg de BE e 0,11 mg de GnRH no dia 0, 1200UI de eCG no dia 5 após inserção do CIDR®, 530 µg de PGF2 no dia 8 e 2,5 mg de LH, entre 12-18 horas após a detecção do estro para a indução da ovulação. A detecção de estro foi realizada com o auxílio de um macho, sendo permitida a cópula. Oito dias após a cópula foi realizada a contagem dos CL e folículos anovulatórios mediante laparotomia mediana ventral, assim como a colheita de embriões. O Tratamento A resultou em 2 CL. O Tratamento B resultou em 1 CL e 8 folículos anovulatórios. O Tratamento C resultou em 10, 3 e 11 CL, e 0, 1 e 5 folículos anovulatórios para as fêmeas 3, 4 e 5, respectivamente. Além disso foi realizada a colheita de 2, 2 e 5 embriões das fêmeas FBD3, FBD4 e FBD5, respectivamente. Obtendo uma taxa de recuperação de 37,5% (9/24), dos quais dois eram embriões viáveis para transferência. Todos os tratamentos foram efetivos na sincronização do estro. O Tratamento C, com a aplicação i.m. de 1200UI de eCG e de LH, como indutor da ovulação, teve a melhor resposta em termos de superovulação, assim como de colheita de embriões.

The marsh deer (Blastocerus dichotomus) is an emblematic species within the neotropical deer. In the last decades, their populations have suffered a notable decline due, mainly, to the destruction of their habitat. This causes loss of genetic diversity, which together with inbreeding depression (by the isolation of many small populations) can lead this species to local extinctions. In this context, assisted reproduction techniques can help in the process of maintaining genetic diversity in these isolated populations. Thus, the aim of this study was to elaborate a superovulation protocol for captive marsh deer. Therefore, protocols were successively tested (A, B, C) until satisfactory results were obtained. To be able to achieve a viable protocol, three pharmacological combination were tested. Treatment A: CIDR® for 7 days, followed by 0.5 mg of EB and 0.11 mg of GnRH on D0, 800IU of eCG on day 5 after CIDR® insertion, 530 µg PGF2 on day 7, and 0.11 mg of GnRH soon after estrus detection, for ovulation induction. Treatment B: CIDR® for 8 days, followed by 0.5 mg of EB and 0.11 mg of GnRH on D0, 1200IU of eCG on day 5 after CIDR® insertion, 530 µg PGF2 on day 8, and 0.11 mg of GnRH soon after estrus detection, for ovulation induction. Treatment C: CIDR® for 8 days, followed by 0.5 mg of EB and 0.11 mg of GnRH on D0, 1200IU of eCG on day 5 after CIDR® insertion, 530 µg PGF2 on day 8, and 0.25 mg of LH, between 12-18 hours post estrus detection, for ovulation induction. Estrus detection was performed with the aid of a male, and copulation was allowed. Eight days after copulation, CL and anovulatory follicles were counted through median ventral laparotomy, as well as the collection of embryos. Treatment A resulted in 2 CL. Treatment B resulted in 1 CL and 8 anovulatory follicles. Treatment C resulted in 10, 3 and 11 CL, and 0, 1 and 5 anovulatory follicles for hinds FBD3, FBD4, and FBD5, respectively. In addition, 2, 2 and 5 embryos were harvested from hinds FBD3, FBD4 and FBD5, respectively. Obtaining a recovery rate of 37.5% (9/24), of which two were viable embryos for transfer. All treatments were effective in synchronizing estrus. Treatment C, with an i.m. application of 1200IU of eCG and LH, as ovulation inducer, had the best response in terms of superovulation, as well as embryo collection.