Effects of neutrophil extracellular traps during human respiratory syncytial virus infection in vitro / Efeitos das redes extracelulares dos neutrófilos durante a infecção in vitro pelo vírus sincicial respiratório

The human respiratory syncytial virus (hRSV) is the most common cause of severe lower respiratory tract diseases in young children worldwide, leading to a high number of hospitalizations and significant expenditures for health systems. Neutrophils are massively recruited to the lung tissue of patients with acute respiratory diseases. At the infection site, they release neutrophil extracellular traps (NETs) that can capture and/or inactivate different types of microorganisms, including viruses. Evidence has shown that the accumulation of NETs results in direct cytotoxic effects on endothelial and epithelial cells. Neutrophils stimulated by the hRSV-F protein generate NETs that are able to capture hRSV particles, thus reducing their transmission. However, the massive production of NETs obstructs the airways and increases disease severity. Therefore, further knowledge about the effects of NETs during hRSV infections is essential for the development of new specific and effective treatments. This study evaluated the effects of NETs on the previous or posterior contact with hRSV-infected Hep-2 cells. Hep-2 cells were infected with different hRSV multiplicity of infection (MOI 0.5 or 1.0), either before or after incubation with NETs (0.5–16 μg/mL). Infected and untreated cells showed decreased cellular viability and intense staining with trypan blue, which was accompanied by the formation of many large syncytia. Previous contact between NETs and cells did not result in a protective effect. Cells in monolayers showed a reduced number and area of syncytia, but cell death was similar in infected and non-treated cells. The addition of NETs to infected tissues maintained a similar virus-induced cell death rate and an increased syncytial area, indicating cytotoxic and deleterious damages. Our results corroborate previously reported findings that NETs contribute to the immunopathology developed by patients infected with hRSV.

O vírus sincicial respiratório humano (hRSV) é a causa mais comum de doenças graves do trato respiratório inferior em crianças pequenas em todo o mundo, resultando em grande número de hospitalizações e gastos significativos para os sistemas de saúde. Neutrófilos são recrutados em massa para o tecido pulmonar de pacientes com doenças respiratórias agudas. No local da infecção, eles liberam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) que podem capturar e/ou inativar diferentes tipos de microrganismos, incluindo vírus. Evidências demonstraram que o acúmulo de NETs resulta em efeitos citotóxicos diretos nas células endoteliais e epiteliais. Os neutrófilos estimulados pela proteína F do vírus sincicial respiratório (hRSV-F) geram NETs que são capazes de capturar partículas virais, reduzindo assim sua transmissão. No entanto, a produção maciça de NETs obstrui as vias aéreas e aumenta a gravidade da doença. Assim, um maior conhecimento sobre os efeitos das NETs durante as infecções por hRSV é essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos específicos e eficazes. Este estudo avaliou os efeitos das NETs no contato prévio ou posterior à infecção de células Hep-2 com hRSV. As células Hep-2 foram infectadas com diferentes quantidades de hRSV (multiplicidade de infecção ou MOI 0,5 ou 1,0), antes ou após a incubação com NETs (0,5–16 μg/mL). Células infectadas e não tratadas mostraram redução da viabilidade celular e intensa coloração com azul de tripano, que foi acompanhada pela formação de sincícios numerosos e grandes. O contato prévio entre as NETs e as células não resultou em efeito protetor. As células em monocamadas mostraram um número e área de sincícios reduzidos, mas a morte celular foi semelhante àquela apresentada por células infectadas e não tratadas. A adição de NETs aos tecidos infectados manteve taxa de morte celular e formação de sincícios [...].

Effects of neutrophil extracellular traps during human respiratory syncytial virus infection in vitro

Abstract The human respiratory syncytial virus (hRSV) is the most common cause of severe lower respiratory tract diseases in young children worldwide, leading to a high number of hospitalizations and significant expenditures for health systems. Neutrophils are massively recruited to the lung tissue of patients with acute respiratory diseases. At the infection site, they release neutrophil extracellular traps (NETs) that can capture and/or inactivate different types of microorganisms, including viruses. Evidence has shown that the accumulation of NETs results in direct cytotoxic effects on endothelial and epithelial cells. Neutrophils stimulated by the hRSV-F protein generate NETs that are able to capture hRSV particles, thus reducing their transmission. However, the massive production of NETs obstructs the airways and increases disease severity. Therefore, further knowledge about the effects of NETs during hRSV infections is essential for the development of new specific and effective treatments. This study evaluated the effects of NETs on the previous or posterior contact with hRSV-infected Hep-2 cells. Hep-2 cells were infected with different hRSV multiplicity of infection (MOI 0.5 or 1.0), either before or after incubation with NETs (0.516 g/mL). Infected and untreated cells showed decreased cellular viability and intense staining with trypan blue, which was accompanied by the formation of many large syncytia. Previous contact between NETs and cells did not result in a protective effect. Cells in monolayers showed a reduced number and area of syncytia, but cell death was similar in infected and non-treated cells. The addition of NETs to infected tissues maintained a similar virus-induced cell death rate and an increased syncytial area, indicating cytotoxic and deleterious damages. Our results corroborate previously reported findings that NETs contribute to the immunopathology developed by patients infected with hRSV.

Resumo O vírus sincicial respiratório humano (hRSV) é a causa mais comum de doenças graves do trato respiratório inferior em crianças pequenas em todo o mundo, resultando em grande número de hospitalizações e gastos significativos para os sistemas de saúde. Neutrófilos são recrutados em massa para o tecido pulmonar de pacientes com doenças respiratórias agudas. No local da infecção, eles liberam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) que podem capturar e/ou inativar diferentes tipos de microrganismos, incluindo vírus. Evidências demonstraram que o acúmulo de NETs resulta em efeitos citotóxicos diretos nas células endoteliais e epiteliais. Os neutrófilos estimulados pela proteína F do vírus sincicial respiratório (hRSV-F) geram NETs que são capazes de capturar partículas virais, reduzindo assim sua transmissão. No entanto, a produção maciça de NETs obstrui as vias aéreas e aumenta a gravidade da doença. Assim, um maior conhecimento sobre os efeitos das NETs durante as infecções por hRSV é essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos específicos e eficazes. Este estudo avaliou os efeitos das NETs no contato prévio ou posterior à infecção de células Hep-2 com hRSV. As células Hep-2 foram infectadas com diferentes quantidades de hRSV (multiplicidade de infecção ou MOI 0,5 ou 1,0), antes ou após a incubação com NETs (0,516 g/mL). Células infectadas e não tratadas mostraram redução da viabilidade celular e intensa coloração com azul de tripano, que foi acompanhada pela formação de sincícios numerosos e grandes. O contato prévio entre as NETs e as células não resultou em efeito protetor. As células em monocamadas mostraram um número e área de sincícios reduzidos, mas a morte celular foi semelhante àquela apresentada por células infectadas e não tratadas. A adição de NETs aos tecidos infectados manteve taxa de morte celular e formação de sincícios semelhantes àqueles induzidos pelo vírus em células não tratadas, indicando danos citotóxicos e deletérios. Nossos resultados corroboram achados relatados anteriormente de que as NETs contribuem para a imunopatologia desenvolvida por pacientes infectados com hRSV.

Effects of neutrophil extracellular traps during human respiratory syncytial virus infection in vitro / Efeitos das redes extracelulares dos neutrófilos durante a infecção in vitro pelo vírus sincicial respiratório

Abstract The human respiratory syncytial virus (hRSV) is the most common cause of severe lower respiratory tract diseases in young children worldwide, leading to a high number of hospitalizations and significant expenditures for health systems. Neutrophils are massively recruited to the lung tissue of patients with acute respiratory diseases. At the infection site, they release neutrophil extracellular traps (NETs) that can capture and/or inactivate different types of microorganisms, including viruses. Evidence has shown that the accumulation of NETs results in direct cytotoxic effects on endothelial and epithelial cells. Neutrophils stimulated by the hRSV-F protein generate NETs that are able to capture hRSV particles, thus reducing their transmission. However, the massive production of NETs obstructs the airways and increases disease severity. Therefore, further knowledge about the effects of NETs during hRSV infections is essential for the development of new specific and effective treatments. This study evaluated the effects of NETs on the previous or posterior contact with hRSV-infected Hep-2 cells. Hep-2 cells were infected with different hRSV multiplicity of infection (MOI 0.5 or 1.0), either before or after incubation with NETs (0.5-16 μg/mL). Infected and untreated cells showed decreased cellular viability and intense staining with trypan blue, which was accompanied by the formation of many large syncytia. Previous contact between NETs and cells did not result in a protective effect. Cells in monolayers showed a reduced number and area of syncytia, but cell death was similar in infected and non-treated cells. The addition of NETs to infected tissues maintained a similar virus-induced cell death rate and an increased syncytial area, indicating cytotoxic and deleterious damages. Our results corroborate previously reported findings that NETs contribute to the immunopathology developed by patients infected with hRSV.

Resumo O vírus sincicial respiratório humano (hRSV) é a causa mais comum de doenças graves do trato respiratório inferior em crianças pequenas em todo o mundo, resultando em grande número de hospitalizações e gastos significativos para os sistemas de saúde. Neutrófilos são recrutados em massa para o tecido pulmonar de pacientes com doenças respiratórias agudas. No local da infecção, eles liberam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) que podem capturar e/ou inativar diferentes tipos de microrganismos, incluindo vírus. Evidências demonstraram que o acúmulo de NETs resulta em efeitos citotóxicos diretos nas células endoteliais e epiteliais. Os neutrófilos estimulados pela proteína F do vírus sincicial respiratório (hRSV-F) geram NETs que são capazes de capturar partículas virais, reduzindo assim sua transmissão. No entanto, a produção maciça de NETs obstrui as vias aéreas e aumenta a gravidade da doença. Assim, um maior conhecimento sobre os efeitos das NETs durante as infecções por hRSV é essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos específicos e eficazes. Este estudo avaliou os efeitos das NETs no contato prévio ou posterior à infecção de células Hep-2 com hRSV. As células Hep-2 foram infectadas com diferentes quantidades de hRSV (multiplicidade de infecção ou MOI 0,5 ou 1,0), antes ou após a incubação com NETs (0,5-16 μg/mL). Células infectadas e não tratadas mostraram redução da viabilidade celular e intensa coloração com azul de tripano, que foi acompanhada pela formação de sincícios numerosos e grandes. O contato prévio entre as NETs e as células não resultou em efeito protetor. As células em monocamadas mostraram um número e área de sincícios reduzidos, mas a morte celular foi semelhante àquela apresentada por células infectadas e não tratadas. A adição de NETs aos tecidos infectados manteve taxa de morte celular e formação de sincícios semelhantes àqueles induzidos pelo vírus em células não tratadas, indicando danos citotóxicos e deletérios. Nossos resultados corroboram achados relatados anteriormente de que as NETs contribuem para a imunopatologia desenvolvida por pacientes infectados com hRSV.

Effects of neutrophil extracellular traps during human respiratory syncytial virus infection in vitro / Efeitos das redes extracelulares dos neutrófilos durante a infecção in vitro pelo vírus sincicial respiratório

The human respiratory syncytial virus (hRSV) is the most common cause of severe lower respiratory tract diseases in young children worldwide, leading to a high number of hospitalizations and significant expenditures for health systems. Neutrophils are massively recruited to the lung tissue of patients with acute respiratory diseases. At the infection site, they release neutrophil extracellular traps (NETs) that can capture and/or inactivate different types of microorganisms, including viruses. Evidence has shown that the accumulation of NETs results in direct cytotoxic effects on endothelial and epithelial cells. Neutrophils stimulated by the hRSV-F protein generate NETs that are able to capture hRSV particles, thus reducing their transmission. However, the massive production of NETs obstructs the airways and increases disease severity. Therefore, further knowledge about the effects of NETs during hRSV infections is essential for the development of new specific and effective treatments. This study evaluated the effects of NETs on the previous or posterior contact with hRSV-infected Hep-2 cells. Hep-2 cells were infected with different hRSV multiplicity of infection (MOI 0.5 or 1.0), either before or after incubation with NETs (0.5–16 μg/mL). Infected and untreated cells showed decreased cellular viability and intense staining with trypan blue, which was accompanied by the formation of many large syncytia. Previous contact between NETs and cells did not result in a protective effect. Cells in monolayers showed a reduced number and area of syncytia, but cell death was similar in infected and non-treated cells. The addition of NETs to infected tissues maintained a similar virus-induced cell death rate and an increased syncytial area, indicating cytotoxic and deleterious damages. Our results corroborate previously reported findings that NETs contribute to the immunopathology developed by patients infected with hRSV.(AU)

O vírus sincicial respiratório humano (hRSV) é a causa mais comum de doenças graves do trato respiratório inferior em crianças pequenas em todo o mundo, resultando em grande número de hospitalizações e gastos significativos para os sistemas de saúde. Neutrófilos são recrutados em massa para o tecido pulmonar de pacientes com doenças respiratórias agudas. No local da infecção, eles liberam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) que podem capturar e/ou inativar diferentes tipos de microrganismos, incluindo vírus. Evidências demonstraram que o acúmulo de NETs resulta em efeitos citotóxicos diretos nas células endoteliais e epiteliais. Os neutrófilos estimulados pela proteína F do vírus sincicial respiratório (hRSV-F) geram NETs que são capazes de capturar partículas virais, reduzindo assim sua transmissão. No entanto, a produção maciça de NETs obstrui as vias aéreas e aumenta a gravidade da doença. Assim, um maior conhecimento sobre os efeitos das NETs durante as infecções por hRSV é essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos específicos e eficazes. Este estudo avaliou os efeitos das NETs no contato prévio ou posterior à infecção de células Hep-2 com hRSV. As células Hep-2 foram infectadas com diferentes quantidades de hRSV (multiplicidade de infecção ou MOI 0,5 ou 1,0), antes ou após a incubação com NETs (0,5–16 μg/mL). Células infectadas e não tratadas mostraram redução da viabilidade celular e intensa coloração com azul de tripano, que foi acompanhada pela formação de sincícios numerosos e grandes. O contato prévio entre as NETs e as células não resultou em efeito protetor. As células em monocamadas mostraram um número e área de sincícios reduzidos, mas a morte celular foi semelhante àquela apresentada por células infectadas e não tratadas. A adição de NETs aos tecidos infectados manteve taxa de morte celular e formação de sincícios [...].(AU)

Use of external nasal strip influences alveolar cell population of horses after exercise / Uso de fita nasal influencia a população de células alveolares em equinos após exercício

The nasal strip is widely used in horses during exercise, but effects of using a nasal strip are controversial and little is known about its effect on horses undergoing endurance events. The aim of this study was to determine whether the use of nasal strips influences alveolar cell population assessed by bronchoalveolar lavage (BAL), tidal volume, and nasal airflow rate. Six Arabian horses were subjected to two low intensity tests on a treadmill, with and without application of a commercial external nasal strip. Tidal volumes and airflow rates were measured during the test; two hours after the test, BAL was performed to assess cytology of pulmonary secretions. The lavage fluid showed increased neutrophil count after exercise in animals with the nasal strip (P<0.05). This suggests that turbulence of airflow through the nasal cavity may have diminished with nasal strip use, thus allowing larger particles to be deposited more distally in the respiratory system, inducing a more intense neutrophilic response. No differences in tidal volumes or airflow rates were observed between groups (with or without nasal strips) during the test (P>0.05). The use of nasal strips seems to influence alveolar cell population during and after exercise in horses after low intensity exercise tests. Further studies are needed to verify whether alveolar cell population is related to poor exercise performance in horses.(AU)

A fita nasal é amplamente utilizada em equinos durante o exercício, porém seus resultados são controversos e pouco conhecidos em animais que disputam provas de resistência. O objetivo deste trabalho foi verificar se o uso da fita nasal influencia a população de células alveolares por meio de lavado broncoalveolar, volume corrente e fluxo de ar nasal. Foram utilizados seis equinos da raça Árabe, que realizaram dois testes de longa duração em esteira, sendo um teste com a fita e outro sem a fita nasal. Fluxo e volume respiratório foram mensurados durante o teste; duas horas após o término do exercício, foi realizado lavado broncoalveolar para realização de citologia da secreção pulmonar. Foi verificada maior porcentagem de neutrófilos após o exercício nos animais que se exercitaram com a fita nasal (P<0,05), indicando que o turbilhonamento na passagem do ar através da cavidade nasal pode ter diminuído, permitindo que partículas maiores se depositassem em porções mais distais do sistema respiratório, induzindo uma resposta neutrofílica mais intensa. Não houve diferenças entre os parâmetros ventilatórios analisados entre os animais quando correram com ou sem a fita nasal (P>0,05). O uso da fita nasal parece influenciar alguns parâmetros, durante e após o exercício, em animais que realizam provas de longa duração. Outros estudos devem ser realizados para verificar se essa influência pode melhorar o desempenho desses animais em exercícios predominantemente aeróbicos.(AU)

Effect of flunixin or ketoprofen in caudectomy by elastration in lambs: pain and neutrophil function

ABSTRACT: Painful procedures can affect the function of innate immune cells, such as neutrophils and macrophages, increasing the risk of infectious diseases. The present work aimed to verify if the analgesics flunixin meglumine or ketoprofen can attenuate the pain/discomfort of newborn lambs submitted by elastration tail docking and thereby avoid the impairment of blood granulocytes function. Twenty-one neonate lambs were divided into three treatments: the control group (n=7), not subjected to caudectomy; the flunixin group (n=7), subjected to caudectomy under local anesthesia and analgesia with two doses of flunixin meglumine; and the ketoprofen group (n=7), subjected to caudectomy under local anesthesia and two doses of ketoprofen. Pain indicators were observed by pain posture score (PS), the number of vocalizations (V), frequency of the movement of the ears (EF), and respiratory rates (RR), observed by a 10 minutes videos for each time points: -15min, 6h, 48h, and 144h. At the same time points, the reactive oxygen species (ROS) production and phagocytosis of blood granulocytes were measured by flow cytometry. At 6h after caudectomy, there was a pain indicator increase (RR, V, and PS), a blood granulocyte percentage increase, and a granulocytes phagocytosis reduction for both groups. At 48h, the ketoprofen group spend more time in pain posture and, at 144h, they exhibited a ROS production granulocyte reduction without signs of pain. We conclude the flunixin meglumine and ketoprofen did not prevent the acute pain/discomfort caused by caudectomy, because the groups showed a pain behavior and impaired of the innate immune response however, the flunixin meglumine was effective in controlling the chronic pain and their effects on blood granulocytes function in compare ketoprofen.

RESUMO: Procedimentos dolorosos podem afetar a função das células imunes inatas como neutrófilos e macrófagos, aumentando o risco de ocorrer doenças infeciosas. Desta maneira, o presente trabalho pretendeu verificar se os analgésicos flunixin meglumine ou cetoprofeno conseguem atenuar a dor/desconforto de cordeiros neonatos submetidos a caudectomia por elastração, evitando assim o comprometimento da função dos granulócitos sanguíneos. Para tanto 21 cordeiras foram aleatoriamente divididas em três tratamentos: grupo controle (n=7) não submetido a caudectomia, grupo flunixin (n=7) submetido a caudectomia precedida por anestesia local e duas doses de flunixin meglumine, e cetoprofeno (n=7) submetido a caudectomia precedida por anestesia local e duas doses de cetoprofeno. Mensurou-se os indicadores de dor/desconforto após caudectomia por observações de escore de postura de dor (EP), número de vocalizações (V), frequência de movimentar as orelhas (FO) e frequência respiratória (FR), observados em vídeos de 10 minutos nos momentos -15 min e 6, 48 e 144h. Nos mesmos momentos, avaliou-se a as funções de produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de fagocitose por granulócitos sanguineos em citometria de fluxo. Notou-se aumento dos indicadores de dor (FR, de V e de EP), da porcentagem dos granulócitos sanguíneos e redução da eficiência de fagocitose em ambos os grupos as 6h. As 48h, os animais do grupo cetoprofeno ainda apresentava mais tempo em postura de dor que os demais grupos e as 144h, apresentou redução da produção ERO por granulócitos. Tais achados permitem concluir que tanto o flunexin meglumine como o cetoprofeno não preveniram dor/desconforto agudo promovido pela elastração, pois os dois grupos manifestaram comportamento de dor e redução da resposta imune inata. Ainda, o analgésico flunixin meglumine foi efetivo em controlar a dor mais tardia e seus efeitos na função de granulócitos sanguíneos em comparação ao cetoprofeno.

Effect of flunixin or ketoprofen in caudectomy by elastration in lambs: pain and neutrophil function / Efeito de flunixin ou cetoprofeno em cordeiras submetidas a caudectomia por elastração: dor e função neutrofílica

Painful procedures can affect the function of innate immune cells, such as neutrophils and macrophages, increasing the risk of infectious diseases. The present work aimed to verify if the analgesics flunixin meglumine or ketoprofen can attenuate the pain/discomfort of newborn lambs submitted by elastration tail docking and thereby avoid the impairment of blood granulocytes function. Twenty-one neonate lambs were divided into three treatments: the control group (n=7), not subjected to caudectomy; the flunixin group (n=7), subjected to caudectomy under local anesthesia and analgesia with two doses of flunixin meglumine; and the ketoprofen group (n=7), subjected to caudectomy under local anesthesia and two doses of ketoprofen. Pain indicators were observed by pain posture score (PS), the number of vocalizations (V), frequency of the movement of the ears (EF), and respiratory rates (RR), observed by a 10 minutes videos for each time points: -15min, 6h, 48h, and 144h. At the same time points, the reactive oxygen species (ROS) production and phagocytosis of blood granulocytes were measured by flow cytometry. At 6h after caudectomy, there was a pain indicator increase (RR, V, and PS), a blood granulocyte percentage increase, and a granulocytes phagocytosis reduction for both groups. At 48h, the ketoprofen group spend more time in pain posture and, at 144h, they exhibited a ROS production granulocyte reduction without signs of pain. We conclude the flunixin meglumine and ketoprofen did not prevent the acute pain/discomfort caused by caudectomy, because the groups showed a pain behavior and impaired of the innate immune response however, the flunixin meglumine was effective in controlling the chronic pain and their effects on blood granulocytes function in compare ketoprofen.(AU)

Procedimentos dolorosos podem afetar a função das células imunes inatas como neutrófilos e macrófagos, aumentando o risco de ocorrer doenças infeciosas. Desta maneira, o presente trabalho pretendeu verificar se os analgésicos flunixin meglumine ou cetoprofeno conseguem atenuar a dor/desconforto de cordeiros neonatos submetidos a caudectomia por elastração, evitando assim o comprometimento da função dos granulócitos sanguíneos. Para tanto 21 cordeiras foram aleatoriamente divididas em três tratamentos: grupo controle (n=7) não submetido a caudectomia, grupo flunixin (n=7) submetido a caudectomia precedida por anestesia local e duas doses de flunixin meglumine, e cetoprofeno (n=7) submetido a caudectomia precedida por anestesia local e duas doses de cetoprofeno. Mensurou-se os indicadores de dor/desconforto após caudectomia por observações de escore de postura de dor (EP), número de vocalizações (V), frequência de movimentar as orelhas (FO) e frequência respiratória (FR), observados em vídeos de 10 minutos nos momentos -15 min e 6, 48 e 144h. Nos mesmos momentos, avaliou-se a as funções de produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de fagocitose por granulócitos sanguineos em citometria de fluxo. Notou-se aumento dos indicadores de dor (FR, de V e de EP), da porcentagem dos granulócitos sanguíneos e redução da eficiência de fagocitose em ambos os grupos as 6h. As 48h, os animais do grupo cetoprofeno ainda apresentava mais tempo em postura de dor que os demais grupos e as 144h, apresentou redução da produção ERO por granulócitos. Tais achados permitem concluir que tanto o flunexin meglumine como o cetoprofeno não preveniram dor/desconforto agudo promovido pela elastração, pois os dois grupos manifestaram comportamento de dor e redução da resposta imune inata. Ainda, o analgésico flunixin meglumine foi efetivo em controlar a dor mais tardia e seus efeitos na função de granulócitos sanguíneos em comparação ao cetoprofeno.(AU)

Effect of flunixin or ketoprofen in caudectomy by elastration in lambs: pain and neutrophil function / Efeito de flunixin ou cetoprofeno em cordeiras submetidas a caudectomia por elastração: dor e função neutrofílica

Painful procedures can affect the function of innate immune cells, such as neutrophils and macrophages, increasing the risk of infectious diseases. The present work aimed to verify if the analgesics flunixin meglumine or ketoprofen can attenuate the pain/discomfort of newborn lambs submitted by elastration tail docking and thereby avoid the impairment of blood granulocytes function. Twenty-one neonate lambs were divided into three treatments: the control group (n=7), not subjected to caudectomy; the flunixin group (n=7), subjected to caudectomy under local anesthesia and analgesia with two doses of flunixin meglumine; and the ketoprofen group (n=7), subjected to caudectomy under local anesthesia and two doses of ketoprofen. Pain indicators were observed by pain posture score (PS), the number of vocalizations (V), frequency of the movement of the ears (EF), and respiratory rates (RR), observed by a 10 minutes videos for each time points: -15min, 6h, 48h, and 144h. At the same time points, the reactive oxygen species (ROS) production and phagocytosis of blood granulocytes were measured by flow cytometry. At 6h after caudectomy, there was a pain indicator increase (RR, V, and PS), a blood granulocyte percentage increase, and a granulocytes phagocytosis reduction for both groups. At 48h, the ketoprofen group spend more time in pain posture and, at 144h, they exhibited a ROS production granulocyte reduction without signs of pain. We conclude the flunixin meglumine and ketoprofen did not prevent the acute pain/discomfort caused by caudectomy, because the groups showed a pain behavior and impaired of the innate immune response however, the flunixin meglumine was effective in controlling the chronic pain and their effects on blood granulocytes function in compare ketoprofen.(AU)

Procedimentos dolorosos podem afetar a função das células imunes inatas como neutrófilos e macrófagos, aumentando o risco de ocorrer doenças infeciosas. Desta maneira, o presente trabalho pretendeu verificar se os analgésicos flunixin meglumine ou cetoprofeno conseguem atenuar a dor/desconforto de cordeiros neonatos submetidos a caudectomia por elastração, evitando assim o comprometimento da função dos granulócitos sanguíneos. Para tanto 21 cordeiras foram aleatoriamente divididas em três tratamentos: grupo controle (n=7) não submetido a caudectomia, grupo flunixin (n=7) submetido a caudectomia precedida por anestesia local e duas doses de flunixin meglumine, e cetoprofeno (n=7) submetido a caudectomia precedida por anestesia local e duas doses de cetoprofeno. Mensurou-se os indicadores de dor/desconforto após caudectomia por observações de escore de postura de dor (EP), número de vocalizações (V), frequência de movimentar as orelhas (FO) e frequência respiratória (FR), observados em vídeos de 10 minutos nos momentos -15 min e 6, 48 e 144h. Nos mesmos momentos, avaliou-se a as funções de produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de fagocitose por granulócitos sanguineos em citometria de fluxo. Notou-se aumento dos indicadores de dor (FR, de V e de EP), da porcentagem dos granulócitos sanguíneos e redução da eficiência de fagocitose em ambos os grupos as 6h. As 48h, os animais do grupo cetoprofeno ainda apresentava mais tempo em postura de dor que os demais grupos e as 144h, apresentou redução da produção ERO por granulócitos. Tais achados permitem concluir que tanto o flunexin meglumine como o cetoprofeno não preveniram dor/desconforto agudo promovido pela elastração, pois os dois grupos manifestaram comportamento de dor e redução da resposta imune inata. Ainda, o analgésico flunixin meglumine foi efetivo em controlar a dor mais tardia e seus efeitos na função de granulócitos sanguíneos em comparação ao cetoprofeno.(AU)

Evaluation of interferon-stimulated gene 15 (ISG15) expression in blood neutrophils in beef cattle poisoned by Senecio spp

ABSTRACT: This study aimed to assess liver damage and interferon-stimulated gene 15 (ISG15) blood expression as a consequence of embryonic signaling on maternal recognition of pregnancy in beef cattle presenting natural ingestion of Senecio spp. Epidemiological aspects, as the presence of the plant, associated to gamma glutamyl transferase (GGT) activity can be used as Senecio spp. poisoning diagnosis. Maternal recognition of pregnancy period occurs when the embryo secretes interferon tau (IFNT) to signal its presence to the mother and eventually extend corpus luteum (CL) lifespan. In our study, liver damage was determined by concentration serum GGT, cytological and histopathological examinations. Reproductive status was evaluated by concentration of progesterone, CL diameter and ISG15 mRNA expression on Day 19 following fixed-time artificial insemination (FTAI). Cows were categorized into two groups based on concentration of GGT: Group 1 (GGT 30U/L) and 2 (GGT>31U/L). No difference on body condition scores was observed. All the cows presented liver damage based on cytology and histopathological exams. Cows from the Group 1 had higher pregnancy rate, presenting larger CL diameter and greater concentration of progesterone. Interestingly, ISG15 mRNA expression had no difference between Groups 1 and 2, even presenting difference in pregnancy status. These findings suggest embryonic loss beyond Day 19. It suggests late embryonic mortality may be associated to liver insufficiency. In conclusion, liver injury and/or concentration of GGT does not alter ISG15 expression on blood neutrophils, however cows presenting lower concentration of GGT ( 30U/L) had increased pregnancy status. Therefore, the concentration of GGT allow us to screen liver status and foresee a successful pregnancy in beef cattle.

RESUMO: O objetivo deste estudo foi avaliar a lesão hepática e a expressão sanguínea do gene estimulado por interferon 15 (ISG15) durante a sinalização embrionária, no reconhecimento materno da gestação, em bovinos de corte apresentando ingestão natural de Senecio spp. Fatores epidemiológicos, como a presença da planta, associados à atividade da gama glutamil transferase (GGT) podem ser utilizados como diagnóstico da intoxicação por Senecio spp. O reconhecimento materno da gestação ocorre quando o embrião secreta interferon tau (IFNT) para sinalizar sua presença à mãe. Em nosso estudo, a lesão hepática foi determinada pela concentração sérica de GGT, pelos exames citológicos e histopatológicos. O estado reprodutivo foi avaliado pela concentração de progesterona, diâmetro de corpo lúteo (CL) e expressão de mRNA ISG15 no Dia 19 após a inseminação artificial em tempo fixo (IATF). As vacas foram separadas em dois grupos com base na concentração de GGT sanguíneo: Grupo 1 (GGT 30U/L) e Grupo 2 (GGT>31U/L). Não foi observada nenhuma diferença no escore de condição corporal entre os grupos. Na citologia e nos exames histopatológicos todas as vacas apresentaram lesão hepática. As vacas do Grupo 1 apresentaram maior taxa de prenhez, maior diâmetro do CL e maior concentração de progesterona. Diferente do esperado, a expressão do mRNA ISG15 não foi diferente entre os Grupos 1 e 2, mesmo apresentando diferença na taxa de prenhez. Esses achados sugerem perda embrionária após o Ddia 19. Isso demonstra que a mortalidade embrionária tardia pode estar associada à insuficiência hepática. Dessa forma, conclui-se que a lesão hepática e/ou concentração de GGT não altera a expressão de ISG15 nos neutrófilos sanguíneos, porém vacas com menor concentração de GGT ( 30U/L) apresentaram maiores taxas de prenhez. Assim, a concentração de GGT nos permite avaliar a saúde hepática e prever uma gestação bem-sucedida em bovinos de corte.

Evaluation of interferon-stimulated gene 15 (ISG15) expression in blood neutrophils in beef cattle poisoned by Senecio spp / Avaliação da expressão do gene estimulado por interferon 15 (ISG15) em neutrófilos sanguíneos em bovinos de corte intoxicados por Senecio spp

This study aimed to assess liver damage and interferon-stimulated gene 15 (ISG15) blood expression as a consequence of embryonic signaling on maternal recognition of pregnancy in beef cattle presenting natural ingestion of Senecio spp. Epidemiological aspects, as the presence of the plant, associated to gamma glutamyl transferase (GGT) activity can be used as Senecio spp. poisoning diagnosis. Maternal recognition of pregnancy period occurs when the embryo secretes interferon tau (IFNT) to signal its presence to the mother and eventually extend corpus luteum (CL) lifespan. In our study, liver damage was determined by concentration serum GGT, cytological and histopathological examinations. Reproductive status was evaluated by concentration of progesterone, CL diameter and ISG15 mRNA expression on Day 19 following fixed-time artificial insemination (FTAI). Cows were categorized into two groups based on concentration of GGT: Group 1 (GGT<30U/L) and 2 (GGT>31U/L). No difference on body condition scores was observed. All the cows presented liver damage based on cytology and histopathological exams. Cows from the Group 1 had higher pregnancy rate, presenting larger CL diameter and greater concentration of progesterone. Interestingly, ISG15 mRNA expression had no difference between Groups 1 and 2, even presenting difference in pregnancy status. These findings suggest embryonic loss beyond Day 19. It suggests late embryonic mortality may be associated to liver insufficiency. In conclusion, liver injury and/or concentration of GGT does not alter ISG15 expression on blood neutrophils, however cows presenting lower concentration of GGT (<30U/L) had increased pregnancy status. Therefore, the concentration of GGT allow us to screen liver status and foresee a successful pregnancy in beef cattle.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a lesão hepática e a expressão sanguínea do gene estimulado por interferon 15 (ISG15) durante a sinalização embrionária, no reconhecimento materno da gestação, em bovinos de corte apresentando ingestão natural de Senecio spp. Fatores epidemiológicos, como a presença da planta, associados à atividade da gama glutamil transferase (GGT) podem ser utilizados como diagnóstico da intoxicação por Senecio spp. O reconhecimento materno da gestação ocorre quando o embrião secreta interferon tau (IFNT) para sinalizar sua presença à mãe. Em nosso estudo, a lesão hepática foi determinada pela concentração sérica de GGT, pelos exames citológicos e histopatológicos. O estado reprodutivo foi avaliado pela concentração de progesterona, diâmetro de corpo lúteo (CL) e expressão de mRNA ISG15 no Dia 19 após a inseminação artificial em tempo fixo (IATF). As vacas foram separadas em dois grupos com base na concentração de GGT sanguíneo: Grupo 1 (GGT<30U/L) e Grupo 2 (GGT>31U/L). Não foi observada nenhuma diferença no escore de condição corporal entre os grupos. Na citologia e nos exames histopatológicos todas as vacas apresentaram lesão hepática. As vacas do Grupo 1 apresentaram maior taxa de prenhez, maior diâmetro do CL e maior concentração de progesterona. Diferente do esperado, a expressão do mRNA ISG15 não foi diferente entre os Grupos 1 e 2, mesmo apresentando diferença na taxa de prenhez. Esses achados sugerem perda embrionária após o Ddia 19. Isso demonstra que a mortalidade embrionária tardia pode estar associada à insuficiência hepática. Dessa forma, conclui-se que a lesão hepática e/ou concentração de GGT não altera a expressão de ISG15 nos neutrófilos sanguíneos, porém vacas com menor concentração de GGT (<30U/L) apresentaram maiores taxas de prenhez. Assim, a concentração de GGT nos permite avaliar a saúde hepática e prever uma gestação bem-sucedida em bovinos de corte.(AU)

Evaluation of interferon-stimulated gene 15 (ISG15) expression in blood neutrophils in beef cattle poisoned by Senecio spp / Avaliação da expressão do gene estimulado por interferon 15 (ISG15) em neutrófilos sanguíneos em bovinos de corte intoxicados por Senecio spp

This study aimed to assess liver damage and interferon-stimulated gene 15 (ISG15) blood expression as a consequence of embryonic signaling on maternal recognition of pregnancy in beef cattle presenting natural ingestion of Senecio spp. Epidemiological aspects, as the presence of the plant, associated to gamma glutamyl transferase (GGT) activity can be used as Senecio spp. poisoning diagnosis. Maternal recognition of pregnancy period occurs when the embryo secretes interferon tau (IFNT) to signal its presence to the mother and eventually extend corpus luteum (CL) lifespan. In our study, liver damage was determined by concentration serum GGT, cytological and histopathological examinations. Reproductive status was evaluated by concentration of progesterone, CL diameter and ISG15 mRNA expression on Day 19 following fixed-time artificial insemination (FTAI). Cows were categorized into two groups based on concentration of GGT: Group 1 (GGT<30U/L) and 2 (GGT>31U/L). No difference on body condition scores was observed. All the cows presented liver damage based on cytology and histopathological exams. Cows from the Group 1 had higher pregnancy rate, presenting larger CL diameter and greater concentration of progesterone. Interestingly, ISG15 mRNA expression had no difference between Groups 1 and 2, even presenting difference in pregnancy status. These findings suggest embryonic loss beyond Day 19. It suggests late embryonic mortality may be associated to liver insufficiency. In conclusion, liver injury and/or concentration of GGT does not alter ISG15 expression on blood neutrophils, however cows presenting lower concentration of GGT (<30U/L) had increased pregnancy status. Therefore, the concentration of GGT allow us to screen liver status and foresee a successful pregnancy in beef cattle.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a lesão hepática e a expressão sanguínea do gene estimulado por interferon 15 (ISG15) durante a sinalização embrionária, no reconhecimento materno da gestação, em bovinos de corte apresentando ingestão natural de Senecio spp. Fatores epidemiológicos, como a presença da planta, associados à atividade da gama glutamil transferase (GGT) podem ser utilizados como diagnóstico da intoxicação por Senecio spp. O reconhecimento materno da gestação ocorre quando o embrião secreta interferon tau (IFNT) para sinalizar sua presença à mãe. Em nosso estudo, a lesão hepática foi determinada pela concentração sérica de GGT, pelos exames citológicos e histopatológicos. O estado reprodutivo foi avaliado pela concentração de progesterona, diâmetro de corpo lúteo (CL) e expressão de mRNA ISG15 no Dia 19 após a inseminação artificial em tempo fixo (IATF). As vacas foram separadas em dois grupos com base na concentração de GGT sanguíneo: Grupo 1 (GGT<30U/L) e Grupo 2 (GGT>31U/L). Não foi observada nenhuma diferença no escore de condição corporal entre os grupos. Na citologia e nos exames histopatológicos todas as vacas apresentaram lesão hepática. As vacas do Grupo 1 apresentaram maior taxa de prenhez, maior diâmetro do CL e maior concentração de progesterona. Diferente do esperado, a expressão do mRNA ISG15 não foi diferente entre os Grupos 1 e 2, mesmo apresentando diferença na taxa de prenhez. Esses achados sugerem perda embrionária após o Ddia 19. Isso demonstra que a mortalidade embrionária tardia pode estar associada à insuficiência hepática. Dessa forma, conclui-se que a lesão hepática e/ou concentração de GGT não altera a expressão de ISG15 nos neutrófilos sanguíneos, porém vacas com menor concentração de GGT (<30U/L) apresentaram maiores taxas de prenhez. Assim, a concentração de GGT nos permite avaliar a saúde hepática e prever uma gestação bem-sucedida em bovinos de corte.(AU)

Efeito do parasitismo por Haemonchus contortus sobre o metabolismo oxidativo de leucócitos de ovinos / Parasitic effect by Haemonchus contortus on leukocyte oxidative metabolism

A resposta imune tardia direcionada para eliminação da hemoncose pode ser modulada pelo perfil Th2, sendo os eosinófilos as principais células efetoras responsáveis pela eficiente eliminação do parasita; ou modulada pelo perfil Th1, sendo os neutrófilos as principais células efetoras, que promovem eliminação parasitária mais deficiente, pois testes in vitro demonstraram que o parasita deprime o metabolismo oxidativo dos fagócitos. Desta maneira, este trabalho objetivou avaliar se o grau de infecção parasitária observado pela quantidade de ovos por grama de fezes (OPG) de Haemonchus contortus interfere no leucograma e se impacta no metabolismo oxidativo leucocitário em ovino naturalmente acometido por hemoncose. Para tanto, 39 ovinos machos adultos e sem alterações no exame físico, excetuando-se a coloração das mucosas, foram separados em 4 grupos conforme a infecção parasitária 0-350 (n=15), 400 a 1000 (n=10), 1100-2000 (n=7) e 2100-4700 (n=7). Notou-se correlação significativa positiva entre OPG e neutrófilos (r=0,56; P=0,0003) e significativa negativa entre OPG e eosinófilos (r=-0,50; P=0,0012) e OPG e metabolismo oxidativo leucocitário (P=0,0001), permitindo concluir que há relação entre as células efetoras e a severidade de infecção parasitária em ovinos naturalmente infectados por hemoncose. Também se verificou que a alta infecção parasitária promove diminuição do metabolismo oxidativo de leucócitos.

The immune response to hemoncosis can be modulated by the Th2 profile, and the main effector cells responsible are eosinophils responsible for a efficient elimination of the parasite, but when it is modulated by the Th1 profile, neutrophils are the main effector cells, responsible for a more deficient parasitic elimination, probabely, because in vitro tests have shown that the parasite depresses the oxidative metabolism of phagocytes. Thus, this study aimed to evaluate if the degree of parasitic infection observed by the amount of eggs per gram of feces (EPG) of Haemonchus contortus interferes in the leukogram, and if it impacts on leukocyte oxidative metabolism in sheep naturally affected by hemoncosis. 39 adult male sheep without alterations in the physical examination, except for mucosal collor, were separated into 4 groups according to parasitic infection 0-350 (n = 15), 400 to 1000 (n = 10), 1100. -2000 (n = 7) and 2100-4700 (n = 7). Significant positive correlation was observed between EPG and neutrophils (r=0.56P=0.0003) and significant negative correlation between EPG and eosinophils (r=-0,56,P = 0.0012) and EPG and leukocyte oxidative metabolism (P = 0.0001), allowing to conclude that there is a relationship between effector cells and the severity of parasitic infection in sheep naturally infected with hemoncose, and the high parasitic infection promotes decreased leukocyte oxidative metabolism.

Efeito do parasitismo por Haemonchus contortus sobre o metabolismo oxidativo de leucócitos de ovinos / Parasitic effect by Haemonchus contortus on leukocyte oxidative metabolism

A resposta imune tardia direcionada para eliminação da hemoncose pode ser modulada pelo perfil Th2, sendo os eosinófilos as principais células efetoras responsáveis pela eficiente eliminação do parasita; ou modulada pelo perfil Th1, sendo os neutrófilos as principais células efetoras, que promovem eliminação parasitária mais deficiente, pois testes in vitro demonstraram que o parasita deprime o metabolismo oxidativo dos fagócitos. Desta maneira, este trabalho objetivou avaliar se o grau de infecção parasitária observado pela quantidade de ovos por grama de fezes (OPG) de Haemonchus contortus interfere no leucograma e se impacta no metabolismo oxidativo leucocitário em ovino naturalmente acometido por hemoncose. Para tanto, 39 ovinos machos adultos e sem alterações no exame físico, excetuando-se a coloração das mucosas, foram separados em 4 grupos conforme a infecção parasitária 0-350 (n=15), 400 a 1000 (n=10), 1100-2000 (n=7) e 2100-4700 (n=7). Notou-se correlação significativa positiva entre OPG e neutrófilos (r=0,56; P=0,0003) e significativa negativa entre OPG e eosinófilos (r=-0,50; P=0,0012) e OPG e metabolismo oxidativo leucocitário (P=0,0001), permitindo concluir que há relação entre as células efetoras e a severidade de infecção parasitária em ovinos naturalmente infectados por hemoncose. Também se verificou que a alta infecção parasitária promove diminuição do metabolismo oxidativo de leucócitos.(AU)

The immune response to hemoncosis can be modulated by the Th2 profile, and the main effector cells responsible are eosinophils responsible for a efficient elimination of the parasite, but when it is modulated by the Th1 profile, neutrophils are the main effector cells, responsible for a more deficient parasitic elimination, probabely, because in vitro tests have shown that the parasite depresses the oxidative metabolism of phagocytes. Thus, this study aimed to evaluate if the degree of parasitic infection observed by the amount of eggs per gram of feces (EPG) of Haemonchus contortus interferes in the leukogram, and if it impacts on leukocyte oxidative metabolism in sheep naturally affected by hemoncosis. 39 adult male sheep without alterations in the physical examination, except for mucosal collor, were separated into 4 groups according to parasitic infection 0-350 (n = 15), 400 to 1000 (n = 10), 1100. -2000 (n = 7) and 2100-4700 (n = 7). Significant positive correlation was observed between EPG and neutrophils (r=0.56P=0.0003) and significant negative correlation between EPG and eosinophils (r=-0,56,P = 0.0012) and EPG and leukocyte oxidative metabolism (P = 0.0001), allowing to conclude that there is a relationship between effector cells and the severity of parasitic infection in sheep naturally infected with hemoncose, and the high parasitic infection promotes decreased leukocyte oxidative metabolism.(AU)

Intracellular reactive oxygen species production and phagocytosis of Staphylococcus aureus by milk neutrophils as tool to diagnose mastitis and identify susceptible dairy cows / Produção intracelular de espécies reativas de oxigênio e fagocitose de Staphylococcus aureus por neutrófilos lácteos como ferramentas para o diagnóstico da mastite e identificação de vacas leiteiras susceptíveis à mastite

The immune response capacity of the mammary gland plays a major role to determine if mastitis will or not be established. Thus, we hypothesize that a better understanding of polymorphonuclear neutrophil leukocyte (PMN) function will elucidate mechanisms that will improve our knowledge of how we could avoid an inflammatory process by increasing the immune capacity of the cow, and even further, to search for a tool to diagnose mastitis or a possible way to select and identify non-susceptible animals. The present study utilized 112 quarters from 28 Holstein dairy cows that were divided into quarters milk samples with somatic cell count (SCC) <2×105 cells mL-1 (n=72) and SCC >2×105 cells mL-1 (n=40). The percentages of milk PMNs and the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) and the phagocytosis of Staphylococcus aureus by milk neutrophils were evaluated by flow cytometry. Our results showed a higher percentage of neutrophils in quarter milk samples with high SCC (P=0.0003), and this group also had a significantly higher percentage of neutrophils that produced ROS (P=0.008). On the other hand, the phagocytosis intensity of S. aureus by milk neutrophils was higher in quarters with low SCC (P=0.003), suggesting a better mammary gland immunity against invading pathogens. Analyzing the results of the predictive values of the measured PMN functions, they cannot be used isolated as a good diagnosis test since none of them had a satisfactory sensitivity and specificity values, which was also confirmed by the Youden index values being far from one. In conclusion, the assessment of milk bovine neutrophil functions could improve our understanding of the cellular basis of mastitis. Although, the intracellular ROS production and S. aureus phagocytosis by milk neutrophil did not have high predictive values to detect intramammary infections, our results strengthen the idea that that poor bovine mammary gland neutrophil phagocytic ability may be associated with high SCC, and might be considered to identify susceptible dairy cows to mastitis.(AU)

A resposta imune da glândula mamária desempenha um papel importante ao determinar o estabelecimento da infecção. Desta forma, a melhor compreensão da função dos neutrófilos irá nos subsidiar conhecimentos, pelo qual podemos evitar o processo inflamatório pela otimização da resposta imune de bovinos leiteiros, e fornece ferramentas para diagnosticar a mastite ou um possível instrumento para identificar e selecionar animais resistentes à infecção intramamária, aumentando a produtividade do rebanho. O presente estudo utilizou 112 amostras provenientes de quartos mamários de 28 vacas Holandesas que foram divididos em amostras de leite com baixa (n=72; <2×105 células mL-1) ou alta (n=40; 2×105 células mL-1) contagem de células somáticas (CCS). A porcentagem de neutrófilos no leite, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a fagocitose de Staphylococcus aureus pelos neutrófilos do leite foram avaliadas por citometria de fluxo. Os resultados do presente estudo demonstraram maior percentagem de neutrófilos (CH138+; P=0,0003) e percentagem de neutrófilos que produziram ERO (P=0,008) em amostras de leite com alta CCS. Por outro lado, a intensidade de fagocitose de S. aureus por neutrófilos em amostras de leite com baixa CCS (P=0,003), que demonstra maior atividade funcional destas células neste grupo. As funções neutrofílicas para o diagnóstico da mastite não apresentaram valores de sensibilidade e especificidade altos, que foram confirmados pelo índice Youden. Desta forma, conclui-se que a produção intracelular de ERO e fagocitose de S. aureus pelos neutrófilos do leite não apresentaram valores preditivos altos para detecção de mastite. Além disto, os resultados do presente estudo reforçam a ideia de neutrófilos do leite com menor capacidade fagocítica podem ser associados à alta CCS, e pode ser considerado como uma ferramenta para identificar animais mais susceptíveis à infecções intramamárias.(AU)

Intracellular reactive oxygen species production and phagocytosis of Staphylococcus aureus by milk neutrophils as tool to diagnose mastitis and identify susceptible dairy cows / Produção intracelular de espécies reativas de oxigênio e fagocitose de Staphylococcus aureus por neutrófilos lácteos como ferramentas para o diagnóstico da mastite e identificação de vacas leiteiras susceptíveis à mastite

The immune response capacity of the mammary gland plays a major role to determine if mastitis will or not be established. Thus, we hypothesize that a better understanding of polymorphonuclear neutrophil leukocyte (PMN) function will elucidate mechanisms that will improve our knowledge of how we could avoid an inflammatory process by increasing the immune capacity of the cow, and even further, to search for a tool to diagnose mastitis or a possible way to select and identify non-susceptible animals. The present study utilized 112 quarters from 28 Holstein dairy cows that were divided into quarters milk samples with somatic cell count (SCC) <2×105 cells mL-1 (n=72) and SCC >2×105 cells mL-1 (n=40). The percentages of milk PMNs and the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) and the phagocytosis of Staphylococcus aureus by milk neutrophils were evaluated by flow cytometry. Our results showed a higher percentage of neutrophils in quarter milk samples with high SCC (P=0.0003), and this group also had a significantly higher percentage of neutrophils that produced ROS (P=0.008). On the other hand, the phagocytosis intensity of S. aureus by milk neutrophils was higher in quarters with low SCC (P=0.003), suggesting a better mammary gland immunity against invading pathogens. Analyzing the results of the predictive values of the measured PMN functions, they cannot be used isolated as a good diagnosis test since none of them had a satisfactory sensitivity and specificity values, which was also confirmed by the Youden index values being far from one. In conclusion, the assessment of milk bovine neutrophil functions could improve our understanding of the cellular basis of mastitis...(AU)

A resposta imune da glândula mamária desempenha um papel importante ao determinar o estabelecimento da infecção. Desta forma, a melhor compreensão da função dos neutrófilos irá nos subsidiar conhecimentos, pelo qual podemos evitar o processo inflamatório pela otimização da resposta imune de bovinos leiteiros, e fornece ferramentas para diagnosticar a mastite ou um possível instrumento para identificar e selecionar animais resistentes à infecção intramamária, aumentando a produtividade do rebanho. O presente estudo utilizou 112 amostras provenientes de quartos mamários de 28 vacas Holandesas que foram divididos em amostras de leite com baixa (n=72; <2×105 células mL-1) ou alta (n=40; 2×105 células mL-1) contagem de células somáticas (CCS). A porcentagem de neutrófilos no leite, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a fagocitose de Staphylococcus aureus pelos neutrófilos do leite foram avaliadas por citometria de fluxo. Os resultados do presente estudo demonstraram maior percentagem de neutrófilos (CH138+; P=0,0003) e percentagem de neutrófilos que produziram ERO (P=0,008) em amostras de leite com alta CCS. Por outro lado, a intensidade de fagocitose de S. aureus por neutrófilos em amostras de leite com baixa CCS (P=0,003), que demonstra maior atividade funcional destas células neste grupo. As funções neutrofílicas para o diagnóstico da mastite não apresentaram valores de sensibilidade e especificidade altos, que foram confirmados pelo índice Youden. Desta forma, conclui-se que a produção intracelular de ERO e fagocitose de S. aureus pelos neutrófilos do leite não apresentaram valores preditivos altos para detecção de mastite. Além disto, os resultados do presente estudo reforçam a ideia de neutrófilos do leite com menor capacidade fagocítica podem ser associados à alta CCS, e pode ser considerado como uma ferramenta para identificar animais mais susceptíveis à infecções intramamárias.(AU)

Intracellular reactive oxygen species production and phagocytosis of Staphylococcus aureus by milk neutrophils as tool to diagnose mastitis and identify susceptible dairy cows

ABSTRACT: The immune response capacity of the mammary gland plays a major role to determine if mastitis will or not be established. Thus, we hypothesize that a better understanding of polymorphonuclear neutrophil leukocyte (PMN) function will elucidate mechanisms that will improve our knowledge of how we could avoid an inflammatory process by increasing the immune capacity of the cow, and even further, to search for a tool to diagnose mastitis or a possible way to select and identify non-susceptible animals. The present study utilized 112 quarters from 28 Holstein dairy cows that were divided into quarters milk samples with somatic cell count (SCC) 2×105 cells mL-1 (n=72) and SCC >2×105 cells mL-1 (n=40). The percentages of milk PMNs and the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) and the phagocytosis of Staphylococcus aureus by milk neutrophils were evaluated by flow cytometry. Our results showed a higher percentage of neutrophils in quarter milk samples with high SCC (P=0.0003), and this group also had a significantly higher percentage of neutrophils that produced ROS (P=0.008). On the other hand, the phagocytosis intensity of S. aureus by milk neutrophils was higher in quarters with low SCC (P=0.003), suggesting a better mammary gland immunity against invading pathogens. Analyzing the results of the predictive values of the measured PMN functions, they cannot be used isolated as a good diagnosis test since none of them had a satisfactory sensitivity and specificity values, which was also confirmed by the Youden index values being far from one. In conclusion, the assessment of milk bovine neutrophil functions could improve our understanding of the cellular basis of mastitis. Although, the intracellular ROS production and S. aureus phagocytosis by milk neutrophil did not have high predictive values to detect intramammary infections, our results strengthen the idea that that poor bovine mammary gland neutrophil phagocytic ability may be associated with high SCC, and might be considered to identify susceptible dairy cows to mastitis.

RESUMO: A resposta imune da glândula mamária desempenha um papel importante ao determinar o estabelecimento da infecção. Desta forma, a melhor compreensão da função dos neutrófilos irá nos subsidiar conhecimentos, pelo qual podemos evitar o processo inflamatório pela otimização da resposta imune de bovinos leiteiros, e fornece ferramentas para diagnosticar a mastite ou um possível instrumento para identificar e selecionar animais resistentes à infecção intramamária, aumentando a produtividade do rebanho. O presente estudo utilizou 112 amostras provenientes de quartos mamários de 28 vacas Holandesas que foram divididos em amostras de leite com baixa (n=72; 2×105 células mL-1) ou alta (n=40; 2×105 células mL-1) contagem de células somáticas (CCS). A porcentagem de neutrófilos no leite, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a fagocitose de Staphylococcus aureus pelos neutrófilos do leite foram avaliadas por citometria de fluxo. Os resultados do presente estudo demonstraram maior percentagem de neutrófilos (CH138+; P=0,0003) e percentagem de neutrófilos que produziram ERO (P=0,008) em amostras de leite com alta CCS. Por outro lado, a intensidade de fagocitose de S. aureus por neutrófilos em amostras de leite com baixa CCS (P=0,003), que demonstra maior atividade funcional destas células neste grupo. As funções neutrofílicas para o diagnóstico da mastite não apresentaram valores de sensibilidade e especificidade altos, que foram confirmados pelo índice Youden. Desta forma, conclui-se que a produção intracelular de ERO e fagocitose de S. aureus pelos neutrófilos do leite não apresentaram valores preditivos altos para detecção de mastite. Além disto, os resultados do presente estudo reforçam a ideia de neutrófilos do leite com menor capacidade fagocítica podem ser associados à alta CCS, e pode ser considerado como uma ferramenta para identificar animais mais susceptíveis à infecções intramamárias.

Citocentrifugação e métodos convencionais na citologia uterina de éguas em estro e diestro / Cytocentrifugation and conventional methods in endometrial cytology of estrus and diestrus mares

A citologia uterina consiste em método prático e eficiente para o diagnóstico de afecções uterinas na égua, contribuindo para a conduta terapêutica e o prognóstico quanto à fertilidade das fêmeas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar diferentes técnicas de coleta de material para citologia uterina em éguas, a fim de se verificarem possíveis diferenças qualitativas e quantitativas e a praticidade na execução das metodologias. Para tanto, 12 éguas multíparas foram submetidas ao exame citológico uterino, durante o estro e o diestro, por meio de escova ginecológica e lavado uterino de baixo volume. Com esse ensaio, observou-se que não houve diferença significativa (P>0,05) no resultado da citologia uterina entre as diferentes técnicas avaliadas. No entanto, quando comparadas as fases do ciclo estral, houve uma diferença significativa (P<0,05) quanto ao percentual médio de polimorfonucleares neutrófilos, sendo de 8,07±2,80 no estro e de 1,55±0,28 no diestro. Conclui-se, desse modo, que as técnicas estudadas apresentaram resultados igualmente eficazes para detecção de neutrófilos ao exame citológico do útero em ambas as fases avaliadas do ciclo estral, apesar de, na fase de estro, a detecção de maior percentual de neutrófilos possibilitar um diagnóstico e um prognóstico mais precoces de endometrite e, portanto, uma conduta terapêutica mais adequada.(AU)

The endometrial cytology consists in an efficient and practical method for the diagnosis of uterine disorders in mares, contributing for therapeutic conduct and prognostic evaluation regarding the females' fertility. Therefore, the aim of this study was to compare different techniques of material sampling for endometrial cytology in mares, in order to verify possible qualitative and quantitative differences in the practicality of implementation of this methodology. Twelve multiparous mares underwent an endometrial cytological exam, during estrus and diestrus, by means of a cytobrush and a low-volume uterine flush. With this test, no statistical difference was observed (P>0.05) regarding the result of endometrial cytology between the evaluated techniques. However, in comparison to the estrous cycle's phases, a significant difference was verified (P<0.05) on the average percentage of polymorphonuclear neutrophils: 8.07±2.80 in estrus and 1.55±0.28 in diestrus. Thus, we conclude that the studied techniques presented equally effective results for the detection of neutrophils in the cytological exam for both evaluated stages of the estrous cycle, whereas in estrus phase, the detection of a higher percentage of neutrophils allows a more precocious diagnostic and prognostic of endometritis and, therefore, a more adequate therapeutic approach.(AU)

Citocentrifugação e métodos convencionais na citologia uterina de éguas em estro e diestro / Cytocentrifugation and conventional methods in endometrial cytology of estrus and diestrus mares

A citologia uterina consiste em método prático e eficiente para o diagnóstico de afecções uterinas na égua, contribuindo para a conduta terapêutica e o prognóstico quanto à fertilidade das fêmeas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar diferentes técnicas de coleta de material para citologia uterina em éguas, a fim de se verificarem possíveis diferenças qualitativas e quantitativas e a praticidade na execução das metodologias. Para tanto, 12 éguas multíparas foram submetidas ao exame citológico uterino, durante o estro e o diestro, por meio de escova ginecológica e lavado uterino de baixo volume. Com esse ensaio, observou-se que não houve diferença significativa (P>0,05) no resultado da citologia uterina entre as diferentes técnicas avaliadas. No entanto, quando comparadas as fases do ciclo estral, houve uma diferença significativa (P<0,05) quanto ao percentual médio de polimorfonucleares neutrófilos, sendo de 8,07±2,80 no estro e de 1,55±0,28 no diestro. Conclui-se, desse modo, que as técnicas estudadas apresentaram resultados igualmente eficazes para detecção de neutrófilos ao exame citológico do útero em ambas as fases avaliadas do ciclo estral, apesar de, na fase de estro, a detecção de maior percentual de neutrófilos possibilitar um diagnóstico e um prognóstico mais precoces de endometrite e, portanto, uma conduta terapêutica mais adequada.(AU)

The endometrial cytology consists in an efficient and practical method for the diagnosis of uterine disorders in mares, contributing for therapeutic conduct and prognostic evaluation regarding the females' fertility. Therefore, the aim of this study was to compare different techniques of material sampling for endometrial cytology in mares, in order to verify possible qualitative and quantitative differences in the practicality of implementation of this methodology. Twelve multiparous mares underwent an endometrial cytological exam, during estrus and diestrus, by means of a cytobrush and a low-volume uterine flush. With this test, no statistical difference was observed (P>0.05) regarding the result of endometrial cytology between the evaluated techniques. However, in comparison to the estrous cycle's phases, a significant difference was verified (P<0.05) on the average percentage of polymorphonuclear neutrophils: 8.07±2.80 in estrus and 1.55±0.28 in diestrus. Thus, we conclude that the studied techniques presented equally effective results for the detection of neutrophils in the cytological exam for both evaluated stages of the estrous cycle, whereas in estrus phase, the detection of a higher percentage of neutrophils allows a more precocious diagnostic and prognostic of endometritis and, therefore, a more adequate therapeutic approach.(AU)

Distinct strains of Staphylococcus aureus lead to different inflammatory response patterns in a murine model of intradermal infection / Diferentes cepas de Staphylococcus aureus levam a diferentes padrões de resposta inflamatória em um modelo murino de infecção intradérmica

Staphylococcus aureus infection may lead to the development of soft tissue damage. It has been evaluated in other researches using different animal models. In addition, the inflammatory response developed by the host organism facing an infection by this pathogen has been analyzed and neutrophils have been linked to the immune response developed. In this study, we aimed to compare the inflammatory response developed by the host induced by an intradermal infection with a methicillin-resistant strain of Staphylococcus aureus (MRSA) or a methicillin-susceptible strain of Staphylococcus aureus (MSSA). Mice euthanasia occurred in the following times: 6, 24, 48 and 96 hours of infection; the cell number and the cytokine release were evaluated. Our results showed that infections by different strains of Staphylococcus aureus lead to different immune response degrees. Although MRSA infection induces higher neutrophil recruitment to the infection site and higher inflammatory response in the draining lymph node, the increased production of TNF-, IFN-, IL-6 and IL-1 in the lymph node 6 hours after the infection was observed only in MSSA infected animals. Considering the data, MSSA may have mechanisms to prevent neutrophil recruitment to the infection site.(AU)

Infecções causadas por Staphylococcus aureus podem causar o desenvolvimento de lesões no tecido frouxo. Isto tem sido avaliado em estudos que avaliam a resposta imune em diferentes modelos animais. Além disso, a resposta inflamatória desenvolvida pelo hospedeiro frente à infecção por este patógeno tem sido analisada e neutrófilos têm sido associados com a resposta imune desenvolvida. Neste estudo, nosso objetivo foi comparar a resposta inflamatória desenvolvida pelo organismo hospedeiro induzida por uma infecção intradérmica com uma cepa de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) ou uma cepa Staphylococcus aureus susceptível à meticilina (MSSA). A eutanásia dos camundongos ocorreu nos seguintes tempos: 6, 24, 48 e 96 horas de infecção; o número de células e a quantidade de citocinas foram avaliados. Nossos resultados mostraram que infecções por diferentes cepas de Staphylococcus aureus causam resposta imunológica com diferentes intensidades. Enquanto infecções por MRSA induzem maior recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção e maior resposta inflamatória no linfonodo, o aumento na produção de TNF-, IFN-, IL-6 e IL-1 no linfonodo 6 horas após a infecção foi observado somente nos animais infectados com MSSA. Considerando as análises, MSSA pode possuir mecanismos para prevenir o recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção.(AU)

Histologic and inflammatory lamellar changes in horses with oligofructose-induced laminitis treated with a CXCR1/2 antagonist / Alterações histológicas e inflamatórias no tecido laminar de equinos submetidos ao modelo de laminite por oligofrutose e tratados com um antagonista para CXCR1/2

With the hypothesis that blocking chemokine signaling can ameliorate acute laminitis, the aim was to evaluate the therapeutic effect of intravenous DF1681B, a selective antagonist for CXCR1 and CXCR2 (chemokine receptors), in an oligofructose equine laminitis model. To twelve mixed breed clinically healthy hoses with no previous history of hoof-related lameness was administered oligofructose (10g/kg given by nasogastric tube) and divided into two groups: treated (intravenous DF1681B at 30mg/kg 6, 12, 18, and 24h after oligofructose) and non-treated groups. Laminar biopsies were performed before and 12, 36, and 72h after administering oligofructose. Samples were stained with periodic acid-Schiff (PAS) and scored from 0 to 6 according to epidermal cell and basal membrane changes. The IL-1β, IL-6, and CXCL1 RNA expressions were determined by RT-PCR. Parametric and non-parametric tests were used to compare times within each group (P<0.05). The PAS grades and IL-1β and IL-6 RNA expression increased in the non-treated group, but remained constant in the treated horses. In conclusion, DF1681B therapy reduced laminar inflammation and epidermal deterioration in treated horses. CXCR1/2 blockage should be considered therapeutically for equine acute laminitis(AU)

A expressão de quimiocinas e a infiltração de leucócitos no tecido laminar são característicos de laminite aguda de equinos. O presente estudo avaliou o efeito terapêutico da administração intravenosa de DF1681B , um antagonista seletivo para CXCR1 e CXCR2 (receptores de quimiocinas), em um modelo de laminite equina por oligofrutose. Utilizaram-se doze cavalos sem raça definida, compreendendo quatro machos e oito fêmeas não gestantes, com idade (média ±SD) 7±3,5 anos, pesando 305±35kg e com uma pontuação média de condição corporal de 5±1/9. Os indivíduos elegíveis eram clinicamente saudáveis, sem história prévia de claudicação relacionados ao casco. Após administração de oligofrutose (10g/kg por sonda nasogástrica), os animais foram divididos em dois grupos: tratado (30mg/kg de DF1681B intravenosa, 6, 12, 18 e 24h após a oligofrutose) e não tratado, que recebeu placebo. Biópsias laminares foram realizadas antes e 12, 36 e 72h após a administração de oligofrutose. As amostras foram coradas com ácido periódico de Schiff (PAS) e classificadas de 0-6 de acordo com alterações nas células epidérmicas e na membrana basal. Também determinaram-se as expressões gênicas de IL-1β, CXCL1 e IL-6 por RT-PCR. Testes paramétricos e não paramétricos foram utilizados para comparar os momentos em cada grupo (P<0,05). Estatisticamente, os graus PAS e as expressões de IL-1β e IL-6 se elevaram após a indução no grupo não tratado, mas se mantiveram constantes nos cavalos tratados. Em conclusão, a terapia por DF1681B reduziu a inflamação laminar e a deterioração epidérmica em equinos submetidos ao modelo de intoxicação por oligofructose. O bloqueio de receptores CXCR1/2 deve ser considerado como uma opção terapêutica para prevenção da laminite aguda de equinos(AU)