Specific detection of bovine coronavirus N protein with TaqMan probe qRT-PCR

Background: Bovine Coronavirus (BCoV) can cause acute diarrhea in newborn calves and adult cattle. BCoV infectionmay cause losses to production by reduced weight gain and milk yield of the infected animals. Several methods have beenapplied to detect and diagnose BCoV. However, each assay has its deficiency. Currently, real-time quantitative PCR (qRTPCR) has been utilized to identify and quantify many viral pathogens since it is a highly sensitive. However, the technicalassay varies due to normalization control of the signal with an internal standard, typically a housekeeping gene.Materials, Methods & Results: The present study was aimed to establish a novel TaqMan probe real-time PCR (qRT-PCR)for detecting bovine coronaviruses (BCoV), and also to develop a diagnostic protocol which simplifies sample collectionand processing. One pair of specific primers, one pair of universal primers and a TaqMan probe were designed from theknown sequences of conserved nucleocapsid (N) protein of BCoV. Reaction systems of TaqMan qRT-PCR were optimizedincluding concentrations of the primers and probe as well as annealing temperatures. Prior to optimizing the assay, therecombinant plasmids of pMD18-T-BCoV-N were successfully constructed to make standard curves. The sensitivity, specificity and reproducibility were evaluated on the TaqMan qRT-PCR, respectively. A total of 321 feces specimens collectedfrom diarrheic calves were detected with this assay. The results showed the optimized reaction conditions for qRT-PCRwere 14.5 μM/L primers, 19.5 μM/L probes and 45.0°C annealing temperatures. The established TaqMan qRT-PCR assaycould specially detect BCoV without detecting any other viruses. Its minimum detection limit was 4.72 × 101 copies/μL.However, universal PCR could detect only 4.72 × 103 copies/μL...

Specific detection of bovine coronavirus N protein with TaqMan probe qRT-PCR

Background: Bovine Coronavirus (BCoV) can cause acute diarrhea in newborn calves and adult cattle. BCoV infectionmay cause losses to production by reduced weight gain and milk yield of the infected animals. Several methods have beenapplied to detect and diagnose BCoV. However, each assay has its deficiency. Currently, real-time quantitative PCR (qRTPCR) has been utilized to identify and quantify many viral pathogens since it is a highly sensitive. However, the technicalassay varies due to normalization control of the signal with an internal standard, typically a housekeeping gene.Materials, Methods & Results: The present study was aimed to establish a novel TaqMan probe real-time PCR (qRT-PCR)for detecting bovine coronaviruses (BCoV), and also to develop a diagnostic protocol which simplifies sample collectionand processing. One pair of specific primers, one pair of universal primers and a TaqMan probe were designed from theknown sequences of conserved nucleocapsid (N) protein of BCoV. Reaction systems of TaqMan qRT-PCR were optimizedincluding concentrations of the primers and probe as well as annealing temperatures. Prior to optimizing the assay, therecombinant plasmids of pMD18-T-BCoV-N were successfully constructed to make standard curves. The sensitivity, specificity and reproducibility were evaluated on the TaqMan qRT-PCR, respectively. A total of 321 feces specimens collectedfrom diarrheic calves were detected with this assay. The results showed the optimized reaction conditions for qRT-PCRwere 14.5 μM/L primers, 19.5 μM/L probes and 45.0°C annealing temperatures. The established TaqMan qRT-PCR assaycould specially detect BCoV without detecting any other viruses. Its minimum detection limit was 4.72 × 101 copies/μL.However, universal PCR could detect only 4.72 × 103 copies/μL...(AU)

Construction and characterization of a recombinant vaccine encoding the nucleocapsid protein gene of avian infectious bronchitis virus / Construção e caracterização de uma vacina recombinante codificando o gene da proteina do nucleocapsideo do virus da bronquite infecciosa das galinhas

A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)

Construction and characterization of a recombinant vaccine encoding the nucleocapsid protein gene of avian infectious bronchitis virus / Construção e caracterização de uma vacina recombinante codificando o gene da proteina do nucleocapsideo do virus da bronquite infecciosa das galinhas

A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)

Antigenic and immunogenic properties of the canine distemper virus nucleocapsid protein expressed in Escherichia coli employing codon optimized synthetic gene / Propriedades antigênicas e imunogênicas da proteína do nucleocapsídeo do virus da cinomose canina expressa em Escherichia coli empregando gene sintético com codons otimizados

Despite common occurrence and importance of canine distemper disease the majority of tests currently available for diagnosis are hampered by either low sensitivity or specificity. In this study it was evaluated antigenic and immunogenic characteristics of a conserved region of nucleocapsid protein of canine distemper virus (rCDV NP) expressed in Escherichia coli employing a codon optimized synthetic gene. The expression of rCDVNP in Star strain (mean 300μg/mL, purified) was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis by using His-Tag monoclonal antibodies. Western blot and ELISA, employing positive and negative control dog sera, demonstrated the rCDVNP antigenicity. The rCDVNP was inoculated in hens and immunoglobulin Y (IgY) was purified from the egg yolk. The mean yield of IgY was 28.55mg/mL. IgY reacted with the recombinant protein as demonstrated by Western blot and ELISA assays. In summary, our findings demonstrated that rCDVNP is antigenic since CDV positive dog sera recognized the protein in vitro. Additionally, the rCDVNP proved to be immunogenic in hens being possible to isolate a high concentration of specific IgY antibodies from the egg yolk. Taken together, these results indicate that the rCDVNP along with the specific IgY could be useful tools for development of the canine distemper immunodiagnostic assays.(AU)

Apesar da ocorrência comum e importância da cinomose canina, a maioria dos testes atualmente disponíveis para diagnóstico são prejudicados pela baixa sensibilidade ou especificidade. Neste estudo foram avaliadas características antigênicas e imunogênicas de uma região conservada da proteína do nucleocapsídeo do virus da cinomose canina (rCDV NP) expressa em Escherichia coli empregando um gene sintético e codons otimizados. A expressão na cepa Star (média de 300μg/mL, purificada) foi confirmada por SDS-PAGE e Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti-His-Tag. A antigenicidade da rCDVNP foi demonstrada por western blot e ELISA empregando soros de cães positivos e negativos. A rCDVNP foi inoculada em galinhas e imunoglobulina Y (gY) foi obtida e purificada a partir da gema. A produção média de IgY foi 28.55mg/mL. Anticorpos IgY reagiram com a proteína recombinante, quando analisados por Western blot e ELISA. Em resumo, nossos achados demonstram que a rCDVNP produzida é antigênica, uma vez que os anticorpos de soro de cães positivos para CDV reconheceram a proteína in vitro. Além disso, a rCDVNP foi imunogênica em galinhas, sendo possível isolar anticorpos IgY específicos a partir da gema do ovo em altas concentrações. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a rCDVNP juntamente com a IgY específica podem ser ferramentas úteis para elaborar ensaios de imunodiagnóstico de cinomose canina.(AU)

Antigenic and immunogenic properties of the canine distemper virus nucleocapsid protein expressed in Escherichia coli employing codon optimized synthetic gene / Propriedades antigênicas e imunogênicas da proteína do nucleocapsídeo do virus da cinomose canina expressa em Escherichia coli empregando gene sintético com codons otimizados

Despite common occurrence and importance of canine distemper disease the majority of tests currently available for diagnosis are hampered by either low sensitivity or specificity. In this study it was evaluated antigenic and immunogenic characteristics of a conserved region of nucleocapsid protein of canine distemper virus (rCDV NP) expressed in Escherichia coli employing a codon optimized synthetic gene. The expression of rCDVNP in Star strain (mean 300μg/mL, purified) was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis by using His-Tag monoclonal antibodies. Western blot and ELISA, employing positive and negative control dog sera, demonstrated the rCDVNP antigenicity. The rCDVNP was inoculated in hens and immunoglobulin Y (IgY) was purified from the egg yolk. The mean yield of IgY was 28.55mg/mL. IgY reacted with the recombinant protein as demonstrated by Western blot and ELISA assays. In summary, our findings demonstrated that rCDVNP is antigenic since CDV positive dog sera recognized the protein in vitro. Additionally, the rCDVNP proved to be immunogenic in hens being possible to isolate a high concentration of specific IgY antibodies from the egg yolk. Taken together, these results indicate that the rCDVNP along with the specific IgY could be useful tools for development of the canine distemper immunodiagnostic assays.(AU)

Apesar da ocorrência comum e importância da cinomose canina, a maioria dos testes atualmente disponíveis para diagnóstico são prejudicados pela baixa sensibilidade ou especificidade. Neste estudo foram avaliadas características antigênicas e imunogênicas de uma região conservada da proteína do nucleocapsídeo do virus da cinomose canina (rCDV NP) expressa em Escherichia coli empregando um gene sintético e codons otimizados. A expressão na cepa Star (média de 300μg/mL, purificada) foi confirmada por SDS-PAGE e Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti-His-Tag. A antigenicidade da rCDVNP foi demonstrada por western blot e ELISA empregando soros de cães positivos e negativos. A rCDVNP foi inoculada em galinhas e imunoglobulina Y (gY) foi obtida e purificada a partir da gema. A produção média de IgY foi 28.55mg/mL. Anticorpos IgY reagiram com a proteína recombinante, quando analisados por Western blot e ELISA. Em resumo, nossos achados demonstram que a rCDVNP produzida é antigênica, uma vez que os anticorpos de soro de cães positivos para CDV reconheceram a proteína in vitro. Além disso, a rCDVNP foi imunogênica em galinhas, sendo possível isolar anticorpos IgY específicos a partir da gema do ovo em altas concentrações. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a rCDVNP juntamente com a IgY específica podem ser ferramentas úteis para elaborar ensaios de imunodiagnóstico de cinomose canina.(AU)

Propriedades antigênicas e imunogênicas da região conservada da proteína do nucleocapsídeo do vírus da cinomose canina expressa em Escherichia coli

O objetivo deste trabalho foi a expressão da região conservada da proteína do nucleocapsídeo do vírus da cinomose (aa 222-316) em Escherichia coli e posterior avaliação de suas propriedades antigênicas e imunogênicas. Para tal, a região conservada do gene da proteína do nucleocapsídeo do vírus da cinomose canina (NP CDV) foi selecionada e codón otimizada para expressão em E. coli. O gene sintético foi inserido em um vetor pAE e clonado em cepas E. coli TOP10F. A proteína recombinante foi expressa em E. coli cepa Star e purificada por cromatografia de afinidade. A concentração de proteína obtida após purificação foi aproximadamente 300 mg/mL. A expressão da proteína recombinante NP do CDV (rCDVNP) foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti His tag. A antigenicidade da rCDVNP foi demonstrada por Western blot e ELISA indireto, empregando soros de cães positivos e negativos para cinomose canina. A rCDVNP foi inoculada em galinhas e imunoglobulina Y (IgY) foi purificada a partir da gema de ovo, utilizando o método de delipidação com água destilada acidificada e precipitação com sulfato de amônia. A purificação de IgY foi confirmada por SDS-PAGE e a concentração média de IgY que se obteve foi 28,55 mg/mL. A produção de IgY anti-rCDVNP foi analisada por Western blot e ELISA indireto. Os resultados demonstraram que o gene sintético codificante da região conservada da NP do CDV foi clonado com sucesso utilizando o vetor pAE em E. coli, resultando posteriormente na expressão de porção da NP na forma recombinante. A rCDVNP demonstrou ser antigênica, uma vez que os soros de cães positivos para cinomose canina reconheceram a proteína. A rCDVNP foi imunogênica após inoculação em galinhas, sendo possível o isolamento e purificação de alta concentração de IgY específica a partir de gema de ovo. Estes resultados sugerem que tanto a rCDVNP quanto a IgY anti-rCDVNP produzida podem ser utilizadas como ferramentas úteis em ensaios de imunodiagnóstico da cinomose canina.

The purpose of this study was the expression of the conserved region of Canine distemper virus nucleocapsid protein (aa 222-316) in Escherichia coli and subsequent evaluation of its antigenic and immunogenic properties. The conserved region of Canine distemper virus nucleocapsid (CDV NP) gene was selected and codon optimized for E. coli expression. The synthetic gene was inserted in a pAE vector and cloned into E. coli TOP10F strain. The recombinant protein was expressed in E. coli Star strain and purified by affinity chromatography. The protein yield after purification was approximately 300 mg/mL. Recombinant CDV NP (rCDVNP) expression was confirmed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) and Western blot analysis by using His-Tag monoclonal antibodies. The rCDVNP antigenicity was demonstrated by Western blot and ELISA, employing positive and negative CDV dog sera. The rCDVNP was inoculated in hens and immunoglobulin Y (IgY) was isolated and purified from egg yolk, according the delipidation method with acidified distilled water and the precipitation method with ammonium sulfate. The purification of IgY was confirmed by SDS-PAGE and the mean yield of IgY was 28.55 mg/mL. The production of IgY anti-rCDVNP was analyzed by Western blot and ELISA assays. The results showed that the synthetic gene coding the conserved region of the NP CDV was successfully cloned using pAE vector in E. coli, resulting in the expression of a recombinant NP. The rCDVNP proved to be antigenic, since distemper positive dog sera recognized the protein. The rCDVNP proved to be immunogenic after inoculation in hens and it was possible to isolate and purify high concentration of specific IgY from egg yolk. These results suggest that both rCDVNP as IgY anti-rCDVNP produced can be used as useful tools in immunodiagnostic assays of canine distemper.

Desenvolvimento e avaliação de uma vacina recombinante contra o vírus da Bronquite Infecciosa das galinhas carreada por adenovírus defectivo

O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI) é o agente etiológico da Bronquite Infecciosa (BI), uma enfermidade altamente contagiosa que causa grandes perdas econômicas na avicultura. O VBI é um vírus envelopado, que possui genoma constituído de RNA fita simples, que codifica 4 proteínas estruturais, dentre elas a Nucleoproteína (N), que é produzida em grande quantidade na infecção viral e é reconhecidamente imunogênica. O controle da BI se faz com a imunização das aves através da aplicação de vacinas vivas atenuadas, seguidas de vacinação utilizando antígeno inativado, sendo o sorotipo Massachusetts o único liberado para uso no Brasil. Um dos objetivos do presente trabalho foi realizar um estudo exploratório, afim de conhecer a opinião de diferentes segmentos da avicultura sobre a situação atual da ocorrência de BI nos planteis brasileiros e os custos que ela representa. Diante disso, surge então a necessidade do desenvolvimento de vacinas alternativas e seguras para controle da BI, entre elas a utilização de vacinas vetoriais. Dessa forma, com o objetivo de desenvolver uma vacina efetiva no controle da BI, amostras variantes de VBI foram clonadas em adenovírus humano recombinante e utilizadas para transfectar células HEK293, originando adenovírus recombinantes carreadores do gene N do VBI. Estes vírus foram purificados e utilizados como vacinas recombinantes para imunização de aves SPF. Com base nos dados obtidos, observou-se que apesar das diferentes estratégias de vacinação, a BI ainda é considerada uma doença de alta prevalência que continua causando significativas perdas econômicas na produção avícola de corte e postura no Brasil. Os resultados obtidos demonstraram que a vacina recombinante não induziu uma resposta sorológica detectável pelo teste de Elisa comercial utilizado, bem como não reduziu os escores de lesões nos tecidos das aves vacinadas e desafiadas. Assim, a vacina recombinante carreada por adenovírus defectivo expressando o gene N do VBI foi construída e caracterizada, porém se mostrou ineficaz e não induziu suficiente proteção às aves experimentalmente imunizadas frente ao desafio com VBI.

The infectious bronchitis virus (IBV) is the etiologic agent of Infectious bronchitis (IB), a highly contagious disease that causes great economic losses in the poultry industry. The IBV is an enveloped virus that has RNA single strand genome, encoding four structural proteins, among them Nucleoprotein (N), which is produced abundantly in viral infection and is known immunogenic. The IB control is done by immunization of birds by applying live attenuated vaccine, followed by vaccination using inactivated antigen, wherein the Massachusetts serotype is the only released for use in Brazil. One of the goals of the present work was to conduct an exploratory study in order to know the opinion of different segments of the poultry industry on the current situation of the occurrence of BI in Brazilian squads and the costs that it represents. Therefore, the development of alternative and safe vaccines to BI control is necessary, including the use of vectors. In order to develop an effective vaccine to IB control, samples from IBV field variants were cloned into recombinant human adenovirus and used to transfect HEK293 cells, resulting in recombinant adenovirus carriers of the N gene of the IBV. These recombinant viruses were purified and used as vaccines to immunization of SPF chickens. Based on the obtained data, it was observed that despite the different vaccination strategies, IB is still considered highly prevalent disease that causes significant economic losses in Brazilian poultry industry. The results here obtained showed that the recombinant vaccine does not causes detectable positive serological responses by commercial Elisa test in vaccinated chickens and does not reduce the tissues damage in vaccinated and challenged chickens. Thus, the recombinant vaccine carried by defective adenovirus expressing N gene of IBV was constructed and characterized, but seemed to be ineffective and did not induce sufficient protection to experimentally immunized chickens against IBV challenge.