Toxicity effect of Auxemma oncocalyx fraction and its active principle oncocalyxone A on in vitro culture of caprine secondary follicles and in vitro oocyte maturation / Efeito da toxicidade da fração da Auxemma oncocalyx e seu princípio ativo oncocalyxona A no cultivo in vitro de folículos secundários e na maturação in vitro de oócitos de caprinos

The extract of Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) and its main component, oncocalyxone A (onco A), possess anti-tumoral activity that may affect fertility. There is limited literature on the action of these substances regarding caprine folliculogenesis. In this study, we evaluated the effect of A. oncocaly and onco A on the in vitro culture of isolated secondary follicles (Experiment 1) and on the in vitro maturation (IVM) of oocytes from caprine antral follicles grown in vivo (Experiment 2). Isolated secondary follicles were distributed in six groups: the non-cultured control was immediately fixed in 4% paraformaldehyde. The remaining follicles were cultured for 7 days in α-minimal essential medium (α-MEM+ ) alone (control) or with dimethyl sulfoxide (DMSO), doxorubicin (DXR), A. oncocalyx, or onco A. After culture, the follicles were evaluated for antrum formation, growth rate, apoptosis (TUNEL), cellular proliferation (PCNA), as well as the expression of BCL2 and BAX. In addition, cumulus oocyte complexes (COCs) were aspirated and allocated into five treatments for IVM: control, cultured only in maturation base medium (TCM 199+ ); or supplemented with DMSO; DXR; A. oncocalyx or onco A. After IVM, oocyte chromatin configuration and viability were assessed. After 7 days of culture, a reduction was noted in the percent of morphologically intact follicles, antrum formation, growth rate, and numbers of PCNApositive granulosa cells (P < 0.05). After culture, the DXR treatment showed a higher percent of TUNELpositive follicles and relative BAX:BCL2 mRNA ratio’s (P < 0.05). After IVM of the COCs, DXR, A. oncocalyx, and onco A treatments showed a greater percent (P < 0.05) of abnormal oocytes and a lower percent of viable oocytes as compared with the control group (P < 0.05)...

O extrato da Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) e seu componente, Oncocalyxona A (onco A), possui atividade antitumoral, podendo afetar a fertilidade. Entretanto, estudos sobre a ação dessas substâncias em relação à foliculogênese caprina são desconhecidos. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da A. oncocalyx e onco A no cultivo in vitro de folículos secundários isolados (Experimento 1) e na maturação in vitro (MIV) de oócitos de folículos antrais caprinos crescidos in vivo (Experimento 2). Folículos secundários isolados foram distribuídos em seis grupos, em que o controle não-cultivado foi imediatamente fixado em paraformaldeído 4%. Os folículos restantes foram cultivados durante 7 dias em α-MEM+ sozinho (controle) ou suplementado com DMSO, doxorrubicina (DXR), A. oncocalyx ou onco A. Após o cultivo, os folículos foram avaliados quanto à formação de antro, taxa de crescimento, apoptose (TUNEL) e proliferação celular (PCNA), bem como a expressão dos genes BCL2 e BAX. Além disso, os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram aspirados e distribuídos em cinco tratamentos para MIV: o controle em meio de maturação (TCM 199+), e os demais tratamentos suplementados com DMSO, DXR, A. oncocalyx ou onco A. Depois da MIV, a configuração da cromatina e viabilidade oocitária foram avaliadas. Após 7 dias de cultivo, observou-se redução na percentagem de folículos morfologicamente intactos, na formação de antro, na taxa de crescimento e no número de células PCNA positivas (P < 0,05). Depois do cultivo, no tratamento DXR foi observada maior percentagem de folículos TUNEL positivos (P < 0,05) e também aumento na taxa de RNAm BAX: BCL2 (P < 0,05). Após MIV dos CCOs, nos tratamentos com DXR, A. oncocalyx e onco A, observou-se maior (P < 0,05) percentagem de oócitos anormais e menor de oócitos viáveis quando comparados ao grupo controle (P < 0,05)...

Toxicity effect of Auxemma oncocalyx fraction and its active principle oncocalyxone A on in vitro culture of caprine secondary follicles and in vitro oocyte maturation / Efeito da toxicidade da fração da Auxemma oncocalyx e seu princípio ativo oncocalyxona A no cultivo in vitro de folículos secundários e na maturação in vitro de oócitos de caprinos

The extract of Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) and its main component, oncocalyxone A (onco A), possess anti-tumoral activity that may affect fertility. There is limited literature on the action of these substances regarding caprine folliculogenesis. In this study, we evaluated the effect of A. oncocaly and onco A on the in vitro culture of isolated secondary follicles (Experiment 1) and on the in vitro maturation (IVM) of oocytes from caprine antral follicles grown in vivo (Experiment 2). Isolated secondary follicles were distributed in six groups: the non-cultured control was immediately fixed in 4% paraformaldehyde. The remaining follicles were cultured for 7 days in α-minimal essential medium (α-MEM+ ) alone (control) or with dimethyl sulfoxide (DMSO), doxorubicin (DXR), A. oncocalyx, or onco A. After culture, the follicles were evaluated for antrum formation, growth rate, apoptosis (TUNEL), cellular proliferation (PCNA), as well as the expression of BCL2 and BAX. In addition, cumulus oocyte complexes (COCs) were aspirated and allocated into five treatments for IVM: control, cultured only in maturation base medium (TCM 199+ ); or supplemented with DMSO; DXR; A. oncocalyx or onco A. After IVM, oocyte chromatin configuration and viability were assessed. After 7 days of culture, a reduction was noted in the percent of morphologically intact follicles, antrum formation, growth rate, and numbers of PCNApositive granulosa cells (P < 0.05). After culture, the DXR treatment showed a higher percent of TUNELpositive follicles and relative BAX:BCL2 mRNA ratios (P < 0.05). After IVM of the COCs, DXR, A. oncocalyx, and onco A treatments showed a greater percent (P < 0.05) of abnormal oocytes and a lower percent of viable oocytes as compared with the control group (P < 0.05)...(AU)

O extrato da Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) e seu componente, Oncocalyxona A (onco A), possui atividade antitumoral, podendo afetar a fertilidade. Entretanto, estudos sobre a ação dessas substâncias em relação à foliculogênese caprina são desconhecidos. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da A. oncocalyx e onco A no cultivo in vitro de folículos secundários isolados (Experimento 1) e na maturação in vitro (MIV) de oócitos de folículos antrais caprinos crescidos in vivo (Experimento 2). Folículos secundários isolados foram distribuídos em seis grupos, em que o controle não-cultivado foi imediatamente fixado em paraformaldeído 4%. Os folículos restantes foram cultivados durante 7 dias em α-MEM+ sozinho (controle) ou suplementado com DMSO, doxorrubicina (DXR), A. oncocalyx ou onco A. Após o cultivo, os folículos foram avaliados quanto à formação de antro, taxa de crescimento, apoptose (TUNEL) e proliferação celular (PCNA), bem como a expressão dos genes BCL2 e BAX. Além disso, os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram aspirados e distribuídos em cinco tratamentos para MIV: o controle em meio de maturação (TCM 199+), e os demais tratamentos suplementados com DMSO, DXR, A. oncocalyx ou onco A. Depois da MIV, a configuração da cromatina e viabilidade oocitária foram avaliadas. Após 7 dias de cultivo, observou-se redução na percentagem de folículos morfologicamente intactos, na formação de antro, na taxa de crescimento e no número de células PCNA positivas (P < 0,05). Depois do cultivo, no tratamento DXR foi observada maior percentagem de folículos TUNEL positivos (P < 0,05) e também aumento na taxa de RNAm BAX: BCL2 (P < 0,05). Após MIV dos CCOs, nos tratamentos com DXR, A. oncocalyx e onco A, observou-se maior (P < 0,05) percentagem de oócitos anormais e menor de oócitos viáveis quando comparados ao grupo controle (P < 0,05)...(AU)

TESTE DE TOXICIDADE DA FRAÇÃO DA AUXEMMA ONCOCALYX E ONCONCALYXONA A SOBRE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR E EMBRIONÁRIO IN VITRO

O objetivo foi avaliar o efeito da Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) e seu composto ativo oncocalyxona A (onco A) sobre os folículos pré-antrais, a maturação oocitária e a qualidade embrionária in vitro. Para a Fase I, fragmentos ovarianos caprinos foram cultivados por 1-7 dias nos tratamentos: controle cultivado sozinho ou suplementado com DMSO, BMP-15, doxorubicina (DXR), A. oncocalyx (1.2, 12 ou 34 g/mL) ou onco A (1, 10 ou 30 g/mL). Foram avaliados: sobrevivência, crescimento, apoptose e proliferação. Na fase II, folículos secundários isolados caprinos foram cultivados nos grupos; controle não-cultivado, controle cultivado, DMSO, DXR, A. oncocalyx ou onco A. Além disso, complexo culmulus oócito (CCOs) caprinos foram maturados in vitro (MIV) nos grupos: controle-cultivados sozinho; ou suplementado com DMSO; DXR; A. oncocalyx ou onco A, e foram avaliados a morfologia, sobrevivência, apoptose e configuração da cromatina. Finalmente, para a fase III, CCOs porcinos foram MIV na presença de DXR; A. oncocalyx ou onco A e a competência oocitária foi avaliada (experimento 1). Também, embriões porcinos foram cultivados in vitro nos mesmos tratamentos e o desenvolvimento embrionário foi avaliado (experimento 2). Na fase I, a DXR reduziu o percentual de viabilidade folicular sendo que para a A. oncocalyx e onco A esta redução ocorreu de forma concentração-dependente (P <0,05). DXR, A. oncocalyx 1.2 e onco A 1 aumentaram (P <0,05) a apoptose. A DXR diminuiu (P<0,05) a proliferação celular. Porém, na fase II, houve uma redução no percentual de folículos intactos, formação antro, taxa de crescimento e proliferação celular (P <0,05) comparado ao controle. A DXR apresentou indicadores de apoptose maiores (P <0,05). Após a MIV de CCOs caprinos, DXR, A. oncocalyx e onco A aumentaram (P <0,05) os oócitos anormais e diminuíram a viabilidade em comparação com o controle (P <0,05). Finalmente, na fase III, no experimento 1, a DXR, A. oncocalyx e onco A reduziram (P <0,05) a viabilidade oocitária e a eficiência da MIV (P <0,05). Após a FIV, todas as drogas reduziram (P <0,05) a eficiência da FIV e o percentual de embriões clivados, no entanto, apenas a DXR diminuiu o percentual de blastocistos. No experimento 2, a DXR e A. oncocalyx diminuíram (P <0,05) o percentual de embriões clivados, mas não teve nenhum efeito sobre a formação de blastocisto. Em conclusão, A. oncocalyx e onco A afetam a foliculogênese in vitro em caprinos de forma concentração-dependente. A Onco A tem um efeito menos prejudicial do que a DXR na sobrevivência de folículos pré- antrais. Também, A. oncocalyx e onco A não apresentam um efeito tóxico sobre folículos secundários isolados caprinos nas taxas de maturação de CCOs. Porém, estas substâncias afetam negativamente a viabilidade oocitária. Além disso, em suínos, a adição de DXR durante MIV ou cultivo embrionário in vitro afeta negativamente a eficiência da FIV e a taxa de clivagem. Além disso, a exposição de CCOs suínos à DXR, apenas durante a MIV, foi mais prejudicial à manutenção da viabilidade oocitária e à formação de blastocistos, quando comparado à A. oncocalyx e onco A.

The goal was to evaluate the effect of Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) and its active compound oncocalyxone A (onco A) on the in vitro culture of preantral follicles, oocyte maturation and embryo quality. For phase I, caprine ovarian fragments were cultured for 1 and 7 days in different conditions: cultured control alone or supplemented with DMSO, BMP-15, doxorubicin (DXR), A. oncocalyx (1.2, 12 or 34 g/ml) or onco A (1, 10 or 30 g/ml). The following endpoints were evaluated: survival, growth, apoptosis and proliferation. For phase II, isolated secondary caprine follicles were cultured in groups; non-cultured control, control group, DMSO, DXR, A. oncocalyx or onco A. Additionally, caprine cumulus-oocyte-complex (COCs) were in vitro maturated (IVM) in the groups: control alone or supplemented with DMSO; DXR; A. oncocalyx or onco A. Morphology, survival, apoptosis and chromatin configuration were assessed. Finally, for phase III, porcine COCs were IVM in the presence of DXR; A. oncocalyx or onco A and oocyte competence was analyzed (experiment 1). Also, porcine embryos were in vitro cultured in the same treatments and embryo development was evaluated (experiment 2). In phase I, A. oncocalyx and onco A, in a concentration-dependent manner, and DXR decreased (P<0.05) the percentage of morphologically normal follicles. DXR, A. oncocalyx 1.2 and onco A 1 increased (P<0.05) the percentage of apoptosis. DXR decreased (P<0.05) the cellular proliferation. On the other hand, in phase II, DXR showed a reduction in the percentage of intact follicles, antrum formation, growth rate and proliferation (P < 0.05) compared to control. DXR showed higher apoptosis indicators (P < 0.05). After IVM of caprine COCs, DXR, A. oncocalyx and onco A treatments had a greater percentage (P < 0.05) of abnormal oocytes and a lower percentage of viable oocytes as compared with the control (P < 0.05). Finally, in the phase III, in experiment 1; DXR, A. oncocalyx and onco A reduced (P<0.05) oocyte viability and IVM efficiency. After IVF, all the drugs reduced (P<0.05) the IVF efficiency and percentage of cleaved embryos, nevertheless, only DXR decreased the percentage of blastocyst. In experiment 2; DXR and A. oncocalyx decreased (P<0.05) the percentage of cleaved embryo, but had no effect on blastocyst formation. In conclusion, A. oncocalyx and onco A affected in vitro caprine folliculogenesis in a concentration-dependent manner. Onco A has a less harmful effect than DXR on goat preantral follicle survival. Furthermore, A. oncocalyx and onco A do not exhibit a toxic effect on caprine isolated secondary follicles and on maturation rates of COCs recovered from caprine antral follicles. However, these substances negatively affected the oocyte viability. Moreover, in the porcine model, the addition of DXR during IVM or IVC negatively affected the IVF efficiency and cleavage rate. Additionally, the exposure of porcine COCs to DXR only during IVM was more detrimental to oocyte viability and blastocyst formation than A. oncocalyx and onco A.