Salmonella Enteritidis detection and immunological cellular response to experimental inoculation in day-old turkeys / Detecção e resposta imunológica celular à inoculação experimental de Salmonella Enteritidis em perus de um dia

The purpose of this research is to clarify aspects of the pathogenesis of Salmonella Enteritidis in experimentally inoculated day-old turkeys. Three treatments were conducted among a total of 120 turkeys; one control group and two treatment groups in which 6 x 102 CFU mL-1 and 7 x 105 CFU mL-1, respectively, of Salmonella Enteritidis was inoculated in the crops. Two birds from each treatment were sacrificed and necropsied at 1, 3, 4, 12, 18, and 24 hours, and 3, 4, 38, and 49 days post-inoculation. We re-isolated Salmonella, measured lymphocytes, and conducted immunohistochemical tests. Six hours post-inoculation, Salmonella was found in the investigated organs (yolk sac, cecum, fragments of spleen, and bursa of Fabricius) with conventional bacteriology and immunohistochemistry, and was continuously detected in almost all analyzed organs until turkeys were four-days old. Further, Salmonella was detected after 38 days in cecum, when the concentration 7 x 105 CFU mL-1 was given. At both inoculation concentrations, the number of lymphocytes was similar; larger quantities were found in the first hour post-inoculation, followed by a gradual reduction, reaching the lowest levels at 24 hours after inoculation. Afterwards, lymphocytes increased discreetly, remaining at the same level until 49 days after inoculation. In conclusion, inoculation concentration influences mitigation...

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo elucidar aspectos que envolvem a patogênese da Salmonella Enteritidis em perus de um dia experimentalmente inoculados. Foram conduzidos três tratamentos, constituídos de 120 perus, sendo um grupo controle e outros dois tratamentos onde se inoculou via inglúvio 6,0x102 UFC mL-1 e 7,0x105 UFC mL-1 de Salmonella Enteritidis, respectivamente. Após a inoculação, duas aves de cada tratamento foram submetidas à eutanásia e ao exame necroscópico para realizar a colheita amostras (saco vitelínico, ceco, fragmentos de baço e bursa de Fabricius) com uma, três, seis, 12, 18 e 24 horas e aos três, quatro, 38 e 49 dias. Foi realizado pesquisa da Salmonella, contagem de linfócitos e imuno-histoquímica. Após seis horas da inoculação, Salmonella foi identificada nos órgãos estudados, tanto pelo teste bacteriológico quanto pelo imunoistoquímico e permaneceu até quatro dias de idade em quase todos os órgãos analisados, e até 38 dias no ceco, quando se utilizou 7,0x105 UFC mL-1. Em ambas as concentrações do inóculo, os valores da contagem de linfócitos foram semelhantes, iniciando com maior número de linfócitos na primeira hora pós-inoculação, com redução lenta atingindo menor número às 24h pós-inoculação, e, a partir daí, o número de linfócitos aumentou discretamente, se mantendo até os 49 dias pós-inoculação. Conclui-se que a dose infectante...

Salmonella Enteritidis detection and immunological cellular response to experimental inoculation in day-old turkeys / Detecção e resposta imunológica celular à inoculação experimental de Salmonella Enteritidis em perus de um dia

The purpose of this research is to clarify aspects of the pathogenesis of Salmonella Enteritidis in experimentally inoculated day-old turkeys. Three treatments were conducted among a total of 120 turkeys; one control group and two treatment groups in which 6 x 102 CFU mL-1 and 7 x 105 CFU mL-1, respectively, of Salmonella Enteritidis was inoculated in the crops. Two birds from each treatment were sacrificed and necropsied at 1, 3, 4, 12, 18, and 24 hours, and 3, 4, 38, and 49 days post-inoculation. We re-isolated Salmonella, measured lymphocytes, and conducted immunohistochemical tests. Six hours post-inoculation, Salmonella was found in the investigated organs (yolk sac, cecum, fragments of spleen, and bursa of Fabricius) with conventional bacteriology and immunohistochemistry, and was continuously detected in almost all analyzed organs until turkeys were four-days old. Further, Salmonella was detected after 38 days in cecum, when the concentration 7 x 105 CFU mL-1 was given. At both inoculation concentrations, the number of lymphocytes was similar; larger quantities were found in the first hour post-inoculation, followed by a gradual reduction, reaching the lowest levels at 24 hours after inoculation. Afterwards, lymphocytes increased discreetly, remaining at the same level until 49 days after inoculation. In conclusion, inoculation concentration influences mitigation...(AU)

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo elucidar aspectos que envolvem a patogênese da Salmonella Enteritidis em perus de um dia experimentalmente inoculados. Foram conduzidos três tratamentos, constituídos de 120 perus, sendo um grupo controle e outros dois tratamentos onde se inoculou via inglúvio 6,0x102 UFC mL-1 e 7,0x105 UFC mL-1 de Salmonella Enteritidis, respectivamente. Após a inoculação, duas aves de cada tratamento foram submetidas à eutanásia e ao exame necroscópico para realizar a colheita amostras (saco vitelínico, ceco, fragmentos de baço e bursa de Fabricius) com uma, três, seis, 12, 18 e 24 horas e aos três, quatro, 38 e 49 dias. Foi realizado pesquisa da Salmonella, contagem de linfócitos e imuno-histoquímica. Após seis horas da inoculação, Salmonella foi identificada nos órgãos estudados, tanto pelo teste bacteriológico quanto pelo imunoistoquímico e permaneceu até quatro dias de idade em quase todos os órgãos analisados, e até 38 dias no ceco, quando se utilizou 7,0x105 UFC mL-1. Em ambas as concentrações do inóculo, os valores da contagem de linfócitos foram semelhantes, iniciando com maior número de linfócitos na primeira hora pós-inoculação, com redução lenta atingindo menor número às 24h pós-inoculação, e, a partir daí, o número de linfócitos aumentou discretamente, se mantendo até os 49 dias pós-inoculação. Conclui-se que a dose infectante...(AU)

UTILIZAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL QUANTITATIVO PARA DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ENTRE Salmonellaenterica SUBESP. enterica SOROVARES ENTERITIDIS, TYPHIMURIUM E GALLINARUM (BIOVARES GALLINARUM E PULLORUM) EM AVES DOMÉSTICAS (Gallusgallus)

Produtos avícolas são frequentemente associados a surtos alimentares ocasionados por Salmonella spp. e atualmente, existem 2659 sorovares de Salmonella. Os programas existentes para prevenção e controle da infecção por essa bactéria, são complexos devido às várias fontes de contaminação presentes na indústria avícola. A obtenção de um teste diagnóstico rápido para a identificação de bactérias é crucial, para implementar rapidamente as medidas de controle, a fim de conter a propagação bacteriana, reduzir as perdas na produção animal e evitar riscos de infecções transmitidas por alimentos à saúde humana.O objetivo do presente estudo foi realizar a padronização e aplicação da técnica da PCR em tempo real para identificação e quantificação da carga bacteriana em órgãos e fezes de aves comerciais infectadas por Salmonellaentericasubesp. entericasorovaresEnteritidis, Typhimurium e Gallinarum (biovaresGallinarum e Pullorum), em diferentes momentos pós-infecção. O presente estudo realizou a padronização de duas reações multiplex qPCR utilizando SYBr Green, uma reação para quantificação e diagnóstico diferencial entre S. Gallinarum e S. Pullorum, e outra para quantificar e diferenciar S. Enteritidis e S. Typhimurium . Após a padronização da qPCR, quatro grupos experimentais foram inoculados com cada estirpe estudada, por via oral, na 13ª semana de vida das aves. Aos quatro e sete dias após o desafio, três aves de cada grupo foram submetidas à eutanásia, para obtenção de amostras de fígado e conteúdo cecal. Após a colheita das amostras, foram realizadas identificação e quantificação bacteriana pela PCR em tempo real e pela microbiologia convencional. De acordo com a padronização das reações multiplex qPCR, as temperaturas de Melting (Tm) foram avaliadas para obtenção do diagnóstico diferencial. Para a primeira reação, o iniciador pSGP (97pb) obteve Tm de 78°C, para ambos biovars. O iniciador pSG (273pb) obteve 86,2°C de Tm para identificação de S. Gallinarum e o iniciador pSP (260pb) com Tm de 84,8°C para S. Pullorum. Para a segunda reação, observou-se uma Tm de 85°C (206pb) para S. Enteritidis e uma Tm de 79°C (62pb) para S. Typhimurium. Com a obtenção da curva padrão, foi possível evidenciar a alta sensibilidade do teste proposto, uma vez que possibilitou a obtenção de oito pontos de quantificação, iniciando em 108 UFC/mL e finalizando em 101 UFC/mL. Quando as reações foram aplicadas em amostras provenientes de aves infectadas com as respectivas bactérias, foi possível comprovar a alta sensibilidade e especificidade de qPCR, especialmente quando as amostras foram provenientes de fezes, pois permitiu a obtenção de resultados positivos mesmo em amostras com grande quantidade de contaminantes e baixa carga bacteriana. Em decorrência do presente estudo, reações multiplex qPCR com alta sensibilidade, especificidade e com base na fluorescência de SYBr Green foram padronizadas. Além disso, esta metodologia alia baixo custo ao resultado diagnóstico rápido, tornando esse método atraente para aplicação em análises de rotina laboratorial.

Poultry products are often associated with food outbreaks from Salmonella spp. and currently there are 2659 Salmonella serovars. Existing programs for disease prevention and control are complex due to the various sources of contamination within the poultry industry. Obtaining a rapid diagnostic test for identification of bacteria is crucial in order to rapidly implement control measures to contain bacterial spread, to reduce losses in animal production and to avoid risks from food-borne infections to human health. The objective of the present study was to perform a standardization and application of the real-time PCR for indirect diagnosis and quantification of bacterial load in organs and feces of commercial birds infected by Salmonella entericasubesp. entericasorovaresEnteritidis, Typhimurium and Gallinarum (biovaresGallinarum and Pullorum), at different post-infection moments. The present work describes the development of two multiplex qPCR using a low-cost DNA dye (SYBr Green), one for quantification and differential diagnosis between S.Gallinarum and S. Pullorum, and another to quantify and differentiate S. Enteritidis andS. Typhimurium. After qPCR standardization, four experimental groups were inoculated with each strains, orally at the 13th week of life of the birds. At four and seven days post challenge, three birds from each group were euthanasia for liver and cecal content samples collection. After the sampling, was carried out bacterial identification and quantification by real-time PCR and conventional microbiology. According to the multiplex qPCR standardization, the melting temperatures (Tm) was evaluated to obtain the differential diagnosis. For the first reaction, the pSGP amplicon (97 bp) showed Tm of 78°C for both biovars. The pSG amplicon (273 bp) showed a Tm of 86.2°C for S. Gallinarum and pSP amplicon (260 bp) dissociated at 84.8°C for S. Pullorum identification. For the second reaction, a Tm of 85°C (206bp) amplified product for S. Enteritidis and Tm of 79°C (62bp) amplified product for S. Typhimurium. The standard curve showed the high sensitivity of the proposed test, since it was possible to obtain eight quantification points, starting at 108 CFU/mL and ending at 101 CFU/mL. When the reactions were applied in samples from birds infected with each respective bacteria, it was possible to evidence the high sensitivity and specificity of qPCR, especially when the samples came from feces, because obtained positive results even from samples with a large number of contaminants and low bacterial load. As a result of the present study, multiplex qPCR reactions with high sensitivity, specificity and based on the fluorescence of SYBr Green was standardized. In addition, this methodology aligns low cost to the faster diagnostic result, making it attractive for application in routine laboratory analyzes.