Molecular diagnosis of avian viruses in grassland passerines and captive yellow cardinals Gubernatrix cristata in Brazil

ABSTRACT: Avian influenza viruses (AIVs), Newcastle disease virus (NDV), West Nile virus (WNV), adenovirus (AV) and herpesvirus (HV) play an important role in the health of human and animal populations. However, knowledge of the prevalence of these viruses in wild birds is restricted to some groups (e.g. shorebirds) or regions worldwide. Information on grassland birds of South America, which is essential for their conservation, is scarce. The objectives of the present study were to evaluate occurrences of AIV, NDV, WNV, AV and HV for the first time in a bird community of a unique protected area in southern Brazil, which is home for the critically endangered yellow cardinal (Gubernatrix cristata), and captive yellow cardinals from fauna maintainers of the Brazilian Captive Program of the Yellow Cardinal. Passerine species of wild life were caught, identified and samples (swabs) were collected from the oropharynx and cloaca of 64 passerines of 26 species (including 3 yellow cardinals) and 30 yellow cardinals of captive, for molecular diagnosis. The samples were subjected to RNA and DNA extraction and the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) for AIV, NDV and WNV and nested PCR for AV and HV. One yellow cardinal of captive presented a positive result for AV, this result is important for planning, managing natural attributes and making decisions in relation to integrated conservation of threatened species. This is the first report of AV in yellow cardinal and epidemiological investigation of viruses in wild passerines of the Pampa biome, in Rio Grande do Sul, Brazil.

RESUMO: Os vírus da gripe aviária (VGA), vírus da doença de Newcastle (VDN), vírus do Nilo Ocidental (VNO), adenovírus (AV) e herpesvírus (HV) desempenham um papel importante na saúde das populações humana e animal. No entanto, o conhecimento da prevalência desses vírus em aves selvagens é restrito a alguns grupos (por exemplo, aves limícolas) ou regiões em todo o mundo. As informações sobre as aves campestres da América do Sul, essenciais para a sua conservação, são escassas. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a ocorrência de VGA, VDN, VNO, AV e HV pela primeira vez em uma comunidade de aves de uma área única protegida no Sul do Brasil, que abriga o cardeal-amarelo (Gubernatrix cristata) criticamente ameaçado de extinção e em cardeais-amarelos de cativeiro dos mantenedores de fauna do Programa Brasileiro de Cativeiro do Cardeal-amarelo. Espécies de passeriformes silvestres foram capturadas, identificadas e amostras (swabs) foram coletadas da orofaringe e cloaca de 64 passeriformes de 26 espécies (incluindo 3 cardeais-amarelos) e 30 cardeais-amarelos de cativeiro, para diagnóstico molecular. As amostras foram submetidas à extração de RNA e DNA e à reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para VGA, VDN e VNO e nested PCR para AV e HV. Um cardeal-amarelo de cativeiro apresentou resultado positivo para AV, este resultado é importante para o planejamento, manejo dos atributos naturais e tomada de decisões em relação à conservação integrada de espécies ameaçadas. Este é o primeiro relato de AV em cardeal-amarelo e de investigação epidemiológica de vírus em passeriformes silvestres do bioma Pampa, no Rio Grande do Sul, Brasil.

Molecular diagnosis of avian viruses in grassland passerines and captive yellow cardinals Gubernatrix cristata in Brazil / Diagnóstico molecular de vírus aviários em passeriformes campestres e cardeais-amarelos Gubernatrix cristata cativos no Brasil

Avian influenza viruses (AIVs), Newcastle disease virus (NDV), West Nile virus (WNV), adenovirus (AV) and herpesvirus (HV) play an important role in the health of human and animal populations. However, knowledge of the prevalence of these viruses in wild birds is restricted to some groups (e.g. shorebirds) or regions worldwide. Information on grassland birds of South America, which is essential for their conservation, is scarce. The objectives of the present study were to evaluate occurrences of AIV, NDV, WNV, AV and HV for the first time in a bird community of a unique protected area in southern Brazil, which is home for the critically endangered yellow cardinal (Gubernatrix cristata), and captive yellow cardinals from fauna maintainers of the Brazilian Captive Program of the Yellow Cardinal. Passerine species of wild life were caught, identified and samples (swabs) were collected from the oropharynx and cloaca of 64 passerines of 26 species (including 3 yellow cardinals) and 30 yellow cardinals of captive, for molecular diagnosis. The samples were subjected to RNA and DNA extraction and the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) for AIV, NDV and WNV and nested PCR for AV and HV. One yellow cardinal of captive presented a positive result for AV, this result is important for planning, managing natural attributes and making decisions in relation to integrated conservation of threatened species. This is the first report of AV in yellow cardinal and epidemiological investigation of viruses in wild passerines of the Pampa biome, in Rio Grande do Sul, Brazil.(AU)

Os vírus da gripe aviária (VGA), vírus da doença de Newcastle (VDN), vírus do Nilo Ocidental (VNO), adenovírus (AV) e herpesvírus (HV) desempenham um papel importante na saúde das populações humana e animal. No entanto, o conhecimento da prevalência desses vírus em aves selvagens é restrito a alguns grupos (por exemplo, aves limícolas) ou regiões em todo o mundo. As informações sobre as aves campestres da América do Sul, essenciais para a sua conservação, são escassas. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a ocorrência de VGA, VDN, VNO, AV e HV pela primeira vez em uma comunidade de aves de uma área única protegida no Sul do Brasil, que abriga o cardeal-amarelo (Gubernatrix cristata) criticamente ameaçado de extinção e em cardeais-amarelos de cativeiro dos mantenedores de fauna do Programa Brasileiro de Cativeiro do Cardeal-amarelo. Espécies de passeriformes silvestres foram capturadas, identificadas e amostras (swabs) foram coletadas da orofaringe e cloaca de 64 passeriformes de 26 espécies (incluindo 3 cardeais-amarelos) e 30 cardeais-amarelos de cativeiro, para diagnóstico molecular. As amostras foram submetidas à extração de RNA e DNA e à reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para VGA, VDN e VNO e nested PCR para AV e HV. Um cardeal-amarelo de cativeiro apresentou resultado positivo para AV, este resultado é importante para o planejamento, manejo dos atributos naturais e tomada de decisões em relação à conservação integrada de espécies ameaçadas. Este é o primeiro relato de AV em cardeal-amarelo e de investigação epidemiológica de vírus em passeriformes silvestres do bioma Pampa, no Rio Grande do Sul, Brasil.(AU)

Molecular diagnosis of avian viruses in grassland passerines and captive yellow cardinals Gubernatrix cristata in Brazil / Diagnóstico molecular de vírus aviários em passeriformes campestres e cardeais-amarelos Gubernatrix cristata cativos no Brasil

Avian influenza viruses (AIVs), Newcastle disease virus (NDV), West Nile virus (WNV), adenovirus (AV) and herpesvirus (HV) play an important role in the health of human and animal populations. However, knowledge of the prevalence of these viruses in wild birds is restricted to some groups (e.g. shorebirds) or regions worldwide. Information on grassland birds of South America, which is essential for their conservation, is scarce. The objectives of the present study were to evaluate occurrences of AIV, NDV, WNV, AV and HV for the first time in a bird community of a unique protected area in southern Brazil, which is home for the critically endangered yellow cardinal (Gubernatrix cristata), and captive yellow cardinals from fauna maintainers of the Brazilian Captive Program of the Yellow Cardinal. Passerine species of wild life were caught, identified and samples (swabs) were collected from the oropharynx and cloaca of 64 passerines of 26 species (including 3 yellow cardinals) and 30 yellow cardinals of captive, for molecular diagnosis. The samples were subjected to RNA and DNA extraction and the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) for AIV, NDV and WNV and nested PCR for AV and HV. One yellow cardinal of captive presented a positive result for AV, this result is important for planning, managing natural attributes and making decisions in relation to integrated conservation of threatened species. This is the first report of AV in yellow cardinal and epidemiological investigation of viruses in wild passerines of the Pampa biome, in Rio Grande do Sul, Brazil.(AU)

Os vírus da gripe aviária (VGA), vírus da doença de Newcastle (VDN), vírus do Nilo Ocidental (VNO), adenovírus (AV) e herpesvírus (HV) desempenham um papel importante na saúde das populações humana e animal. No entanto, o conhecimento da prevalência desses vírus em aves selvagens é restrito a alguns grupos (por exemplo, aves limícolas) ou regiões em todo o mundo. As informações sobre as aves campestres da América do Sul, essenciais para a sua conservação, são escassas. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a ocorrência de VGA, VDN, VNO, AV e HV pela primeira vez em uma comunidade de aves de uma área única protegida no Sul do Brasil, que abriga o cardeal-amarelo (Gubernatrix cristata) criticamente ameaçado de extinção e em cardeais-amarelos de cativeiro dos mantenedores de fauna do Programa Brasileiro de Cativeiro do Cardeal-amarelo. Espécies de passeriformes silvestres foram capturadas, identificadas e amostras (swabs) foram coletadas da orofaringe e cloaca de 64 passeriformes de 26 espécies (incluindo 3 cardeais-amarelos) e 30 cardeais-amarelos de cativeiro, para diagnóstico molecular. As amostras foram submetidas à extração de RNA e DNA e à reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para VGA, VDN e VNO e nested PCR para AV e HV. Um cardeal-amarelo de cativeiro apresentou resultado positivo para AV, este resultado é importante para o planejamento, manejo dos atributos naturais e tomada de decisões em relação à conservação integrada de espécies ameaçadas. Este é o primeiro relato de AV em cardeal-amarelo e de investigação epidemiológica de vírus em passeriformes silvestres do bioma Pampa, no Rio Grande do Sul, Brasil.(AU)

Infecção por pox vírus e Aspergillus fumigatus em Bubo virginianus (Coruja jacurutu) / Avipoxvirus infecction in Bubo virginianus (great horned owl)

Este trabalho descreve um caso de infecção mista por pox vírus e Aspergillus fumigatus em Bubo virginianus (coruja jacurutu). A ave, um macho adulto, foi encaminhada ao Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas (NURFS/CETAS/UFPEL). Apresentava bom estado corporal, estava ativa, porém com incapacidade de voo. Após três dias apresentou lesões crostosas e de aspecto verrucoso na superfície dorsal das patas. Havia, também, nódulos de mesmo aspecto na pálpebra esquerda e na cera. A ave morreu após 15 dias de sua chegada ao NURFS e foi necropsiada no Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (LRD/UFPel). Histologicamente, as lesões verrucosas caracterizavam-se por hiperplasia do epitélio e nas células das camadas basal, espinhosa, granular e córnea havia corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos do tipo Bollinger. Na microscopia eletrônica foram visualizadas partículas virais características de pox vírus, incluindo Bubo virginianus como um hospedeiro do vírus. Havia, ainda, infiltrado inflamatório de células mononucleares e focos de colônias bacterianas na derme. Nos pulmões havia congestão e presença de granulomas com hifas fúngicas, que pela técnica de Grocott, apresentaram ramificação dicotômica compatível com Aspergillus spp., identificado na cultura como A. fumigatus. O diagnóstico de infecção por avipoxvirus pode contribuir para estudos relacionados com a ocorrência desta doença nas populações de vida livre e como informação auxiliar para o manejo e conservação desta espécie. Sugere-se, ainda, a inclusão do uso de raios-X nos protocolos de centros de reabilitação como o diagnostico de aspergilose em aves rapinantes com bom estado corporal, porém incapazes de voar.(AU)

This paper describes a case of mixed infection by pox virus and Aspergillus fumigatus in Bubo virginianus (Owl Jacurutu). An adult male Bubo virginianus was referred to the Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas (NURFS/CETAS/UFPEL). The owl was active and had a good body condition but with flight disability. After three days of their admission at NURFS the owl developed crusty and verrucous lesions at the dorsal surface of their feet. Also it had nodes on the left eyelid and cera with the same aspect. The owl died 15 days after its arrival. Necropsy and histopatological examination were carried out. The warty lesions had hyperplasia of the epithelium and intracytoplasmic Bollinger-like inclusion bodies in the basal, spinal, granulosa layer and cornea. Viral particles characteristic of pox viruses were shown by electron microscopy. This case includes Bubo virginianus as a host of the avipoxvirus. There were also a mononuclear inflammatory cell infiltrate and bacterial colonies in the dermis. In the lugs, there was congestion and presence of granulomas with intralesional fungal hyphae. With the Grocott stain those structures showed dichotomous branching which was later identified in mycological culture as characteristic for A. fumigates. The diagnosis of avipoxvirus infection can contribute to studies related to the occurrence of this disease in free-living populations and as auxiliary information for the management and conservation of this raptor species. It is also suggested to include the use of X-rays in rehabilitation center protocols as screening test to diagnose aspergillosis in birds of prey with good body condition but inability to fly.(AU)

Infecção por pox vírus e Aspergillus fumigatus em Bubo virginianus (Coruja jacurutu) / Avipoxvirus infecction in Bubo virginianus (great horned owl)

Este trabalho descreve um caso de infecção mista por pox vírus e Aspergillus fumigatus em Bubo virginianus (coruja jacurutu). A ave, um macho adulto, foi encaminhada ao Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas (NURFS/CETAS/UFPEL). Apresentava bom estado corporal, estava ativa, porém com incapacidade de voo. Após três dias apresentou lesões crostosas e de aspecto verrucoso na superfície dorsal das patas. Havia, também, nódulos de mesmo aspecto na pálpebra esquerda e na cera. A ave morreu após 15 dias de sua chegada ao NURFS e foi necropsiada no Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (LRD/UFPel). Histologicamente, as lesões verrucosas caracterizavam-se por hiperplasia do epitélio e nas células das camadas basal, espinhosa, granular e córnea havia corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos do tipo Bollinger. Na microscopia eletrônica foram visualizadas partículas virais características de pox vírus, incluindo Bubo virginianus como um hospedeiro do vírus. Havia, ainda, infiltrado inflamatório de células mononucleares e focos de colônias bacterianas na derme. Nos pulmões havia congestão e presença de granulomas com hifas fúngicas, que pela técnica de Grocott, apresentaram ramificação dicotômica compatível com Aspergillus spp., identificado na cultura como A. fumigatus. O diagnóstico de infecção por avipoxvirus pode contribuir para estudos relacionados com a ocorrência desta doença nas populações de vida livre e como informação auxiliar para o manejo e conservação desta espécie. Sugere-se, ainda, a inclusão do uso de raios-X nos protocolos de centros de reabilitação como o diagnostico de aspergilose em aves rapinantes com bom estado corporal, porém incapazes de voar.(AU)

This paper describes a case of mixed infection by pox virus and Aspergillus fumigatus in Bubo virginianus (Owl Jacurutu). An adult male Bubo virginianus was referred to the Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas (NURFS/CETAS/UFPEL). The owl was active and had a good body condition but with flight disability. After three days of their admission at NURFS the owl developed crusty and verrucous lesions at the dorsal surface of their feet. Also it had nodes on the left eyelid and cera with the same aspect. The owl died 15 days after its arrival. Necropsy and histopatological examination were carried out. The warty lesions had hyperplasia of the epithelium and intracytoplasmic Bollinger-like inclusion bodies in the basal, spinal, granulosa layer and cornea. Viral particles characteristic of pox viruses were shown by electron microscopy. This case includes Bubo virginianus as a host of the avipoxvirus. There were also a mononuclear inflammatory cell infiltrate and bacterial colonies in the dermis. In the lugs, there was congestion and presence of granulomas with intralesional fungal hyphae. With the Grocott stain those structures showed dichotomous branching which was later identified in mycological culture as characteristic for A. fumigates. The diagnosis of avipoxvirus infection can contribute to studies related to the occurrence of this disease in free-living populations and as auxiliary information for the management and conservation of this raptor species. It is also suggested to include the use of X-rays in rehabilitation center protocols as screening test to diagnose aspergillosis in birds of prey with good body condition but inability to fly.(AU)

Infecção por pox vírus aviário em coruja de igreja (Tyto alba) no sul do Brasil / Avian pox virus infection in a common barn owl (Tyto alba) in southern Brazil

A young common barn owl (Tyto alba) was referred to the Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre (Nurfs), Federal University of Pelotas (UFPel), after been found in a barn of a brick factory in the urban area of Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil. The bird was apathic, weak and with crusty lesions in the featherless areas (eyes, beak, legs), and died soon after arrival at Nurfs. Necropsy and histopathological examination of the lesions were carried out. The hyperplasia and hypertrophy of the cutaneous lesions, several eosinophilic intracyto-plasmic inclusion bodies in epithelial cells (Bollinger bodies), as well as particles characteristic of poxvirus, observed by electronic microscopy, confirmed the infection by avian poxvirus, what highlights the importance of Tyto alba as carrier of the virus in the wild.(AU)

Uma coruja-de-igreja (Tyto alba) em idade juvenil foi encaminha ao Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre (Nurfs), Universidade Federal de Pelotas (UFPel), após ter sido encontrada num galpão de uma olaria na região urbana da cidade de Pelotas, RS. A ave apresentava-se apática, debilitada e com lesões crostosas nas áreas sem penas do corpo (olhos, patas e bico), e morreu logo após a chegada ao Nurfs. Foram realizados necropsia e exame histopatológico. A presença de hiperplasia e hipertrofia epidérmica nas lesões cutâneas, várias inclusões intracitoplasmáticas eosinofílicas nas células epiteliais (Corpúsculos de Bollinger), assim como partículas características de poxvirus, demonstradas por microscopia eletrônica, confirmaram a infecção por poxvirus aviário, o que ressalta a importância da espécie Tyto alba como portadora do vírus na natureza.(AU)

PERFIL SANITÁRIO DE FILHOTES DE Amazona brasiliensis DE VIDA LIVRE NO PARANÁ: PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E PESQUISA DE AGENTES INFECCIOSOS

Atualmente, há maior necessidade de pesquisas de doenças e estabelecimento de perfis hematológicos e bioquímicos em populações de aves ameaçadas de extinção. O acompanhamento da saúde desses animais deve ser encorajado pela crescente evidência de que certas enfermidades podem causar impactos adversos nessas populações, e estudos são escassos. O papagaio-de-cara-roxa (Amazona brasiliensis) é considerado uma espécie vulnerável, habitando a floresta atlântica do litoral sul de São Paulo, litoral do Paraná e litoral norte de Santa Catarina. Desde 1997, a Sociedade de Pesquisa em Vida Selvagem e Educação Ambiental desenvolve o Projeto de Conservação do Papagaio-de-cara-roxa, numa tentativa de minimizar o declínio da população. Informações sobre valores hematológicos, bioquímicos e pesquisa de patógenos nesta espécie são raros. O presente trabalho foi dividido em três capítulos. O capítulo 1 objetivou estabelecer intervalos de referência para parâmetros hematológicos e bioquímicos em 37 filhotes saudáveis de A. brasiliensis de vida livre no estado do Paraná, sul do Brasil e comparar os resultados entre sexos. O capítulo 2 objetivou determinar os mesmos parâmetros em filhotes saudáveis e doentes e comparar os resultados entre grupos que apresentaram diferentes sinais clínicos com um grupo saudável clinicamente. O capítulo 3 objetivou determinar a microbiota de 38 filhotes, comparando-a entre aves provenientes de dois tipos de ninhos (madeira e PVC) e pesquisar patógenos por reação em cadeira da polimerase (Chlamydophila psittaci, vírus da influenza aviária, da doença de Newscastle e da Febre do oeste do Nilo) e anticorpos para C. psittaci pelo teste de ELISA modificado, em 50 e 64 indivíduos, respectivamente. As coletas de sangue foram realizadas por meio de seringas e agulhas de insulina estéreis, e amostras de cloaca e orofaringe foram obtidas por swabs estéreis. Médias significativamente superiores para colesterol foram encontradas em fêmeas. O exame físico indicou 37 aves clinicamente sadias, 26 com anormalidades discretas e 5 com alterações graves, e os papagaios foram divididos em 7 grupos de acordo com os achados clínicos. Médias significativamente diferentes entre os grupos foram observadas para os parâmetros hemoglobina, volume globular médio, heterófilo absoluto, relação heterófilo:linfócito, proteína plasmática total, proteína total, glicose, lactato desidrogenase, creatina quinase, globulinas, cálcio e fósforo. Foram isoladas 125 colônias bacterianas com identificação de 19 espécies e três gêneros. As espécies com maior prevalência de isolamento foram Escherichia coli (70,73%), Klebsiella oxytoca (39,13%), Klebsiella pneumoniae (30,43%) e Enterobacter aerogenes (30,43%). Samonella enteritidis foi detectada em três amostras. A microbiota dos papagaios não diferiu em relação ao tipo de ninho. Todas as amostras para pesquisa de patógenos e anticorpos foram negativas. Os resultados possibilitaram a obtenção de dados ainda não descritos para a espécie no estado do Paraná e o fornecimento de um ponto de referência para futuras avaliações e interpretações de resultados laboratoriais, contribuindo com planos de conservação.

There is a greater need for an increase effort in research on disease and determination of hematologic and biochemical profiles in endangered avian populations. Health monitoring of these animals should be encouraged in light of increasing evidence that disease has an adverse impact on avian populations. The red-tailed Amazon parrot (Amazona brasiliensis) is a vulnerable species and is endemic in the Atlantic Forest, inhabiting coastal regions in the south-east Brazilian states of São Paulo, Parana and Santa Catarina. A conservation project for A. brasiliensis has been developed by the non-profitable organization Society for Wildlife Research and Environmental Education since 1997, to minimize the population decline. Information about hematology, biochemical and diseases in this species are rare. This study was split into three chapters. Chapter 1 aimed to determine reference intervals for hematologic and biochemical parameters of 37 free-living A. brasiliensis healthy nestlings in Parana state, southern Brazil, and compare the results between sexes. Chapter 2 aimed to determine the same parameters in healthy and sick nestlings and compare the results between groups with different clinical findings. Chapter 3 aimed to determine the microbiota of 38 nestlings, comparing the results between birds from two types of nests (wood and PVC); also aimed to detect pathogens by polymerase chain reaction (Chlamydophila psittaci, avian influenza virus, Newcastle disease virus and west Nile virus) and to detect antibodies to C. psittaci by modified ELISA test, in 50 and 64 parrots, respectively. Blood samples were collected in sterile syringes using insulin needles, and cloacal and oropharyngeal samples were collected using sterile swabs. Significantly higher values of cholesterol were observed in females. Physical examinations indicated that 37 birds were clinically healthy, 26 had mild abnormalities and 5 had severe disorders, and the parrots were split into 7 groups according to clinical findings. Significantly different means were observed for hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, absolute heterophil, heterophil:lymphocyte ratio, total plasma protein, total protein, glucose, lactate dehydrogenase, creatine kinase, globulin, calcium and phosphorus. 125 bacterial colonies were isolated and 19 species and 3 genera were identified. The species with the highest prevalence were Escherichia coli (70.73%), Klebsiella oxytoca (39.13%), Klebsiella pneumoniae (30.43%) and Enterobacter aerogenes (30.43%). Salmonella enteritidis was detected in three samples. The microbiota of parrots did not differ between the types of nest. All samples tested by ELISA and PCR were negative. The results allowed obtaining data not yet described for this species in Parana state, providing a reference point for future assessments and interpretations of laboratory results, contributing to the conservation plans.