Detection of icaA, icaD, and bap genes and biofilm production in Staphylococcus aureus and non-aureus staphylococci isolated from subclinical and clinical bovine mastitis / Detecção dos genes icaA, icaD e bap e produção de biofilme por Staphylococcus aureus e estafilococos não-aureus isolados de mastite clínica e subclínica bovina

Algumas espécies de Staphylococcus causam infecções crônicas intramamárias e podem levar à formação de biofilme. No presente estudo, levantou-se a hipótese de que as espécies de Staphylococcus isolados da mastite bovina são capazes de formar biofilme in vitro associado à presença dos genes icaA, icaD ou bap. Um total de 200 isolados de Staphylococcus, sendo 100 Staphylococcus aureus de casos de mastite subclínica e 100 estafilococos não aureus (ENA) de casos de mastite subclínica e clínica, obtidos em duas fazendas leiteiras, no estado de São Paulo, foram avaliados quanto à capacidade de produzir biofilmes in vitro. A presença de icaA, icaD e bap foi confirmada por PCR, e a produção de biofilme em ágar vermelho congo (Congo Red Agar - CRA) e em teste de microplaca (Microtiter Plate - MtP) foi avaliada nos isolados de S. aureus e ENA. Os resultados mostraram a presença dos genes icaA, icaD e bap em S. aureus, mas não em ENA. A produção de biofilme pode estar associada à presença de outros fatores ou genes que estimulam a produção de biofilme in vitro. O ensaio de MtP serve como um modelo quantitativo para o estudo da aderência de espécies de estafilococos associados à mastite bovina.(AU)

Detection of icaA, icaD, and bap genes and biofilm production in Staphylococcus aureus and non-aureus staphylococci isolated from subclinical and clinical bovine mastitis / Detecção dos genes icaA, icaD e bap e produção de biofilme por Staphylococcus aureus e estafilococos não-aureus isolados de mastite clínica e subclínica bovina

Algumas espécies de Staphylococcus causam infecções crônicas intramamárias e podem levar à formação de biofilme. No presente estudo, levantou-se a hipótese de que as espécies de Staphylococcus isolados da mastite bovina são capazes de formar biofilme in vitro associado à presença dos genes icaA, icaD ou bap. Um total de 200 isolados de Staphylococcus, sendo 100 Staphylococcus aureus de casos de mastite subclínica e 100 estafilococos não aureus (ENA) de casos de mastite subclínica e clínica, obtidos em duas fazendas leiteiras, no estado de São Paulo, foram avaliados quanto à capacidade de produzir biofilmes in vitro. A presença de icaA, icaD e bap foi confirmada por PCR, e a produção de biofilme em ágar vermelho congo (Congo Red Agar - CRA) e em teste de microplaca (Microtiter Plate - MtP) foi avaliada nos isolados de S. aureus e ENA. Os resultados mostraram a presença dos genes icaA, icaD e bap em S. aureus, mas não em ENA. A produção de biofilme pode estar associada à presença de outros fatores ou genes que estimulam a produção de biofilme in vitro. O ensaio de MtP serve como um modelo quantitativo para o estudo da aderência de espécies de estafilococos associados à mastite bovina.(AU)

Estudo genotípico e fenotípico de Staphylococcus spp. formadores de biofilme isolados em linhas de produção de queijo Minas Frescal e de leite de vacas com mastite no Estado de São Paulo, Brasil

A formação de biofilmes em superfícies que entram em contato com alimentos pode resultar em contaminação em qualquer parte do processo produtivo, podendo assim ser causa de doenças transmitidas por alimentos. A formação de biofilmes por Staphylococcus ssp. é uma das grandes preocupações na indústria de lácteos, e também na área da medicina veterinária. A presente pesquisa teve como objetivo avaliar a capacidade de formação de biofilmes de Staphylococcus spp. isolados de laticínios produtores de queijo Minas Frescal e de leite de vacas com mastite subclínica. O estudo foi realizado em 3 fases, sendo a primeira uma caracterização fenotípica de 150 isolados de Staphylococcus spp. pelo teste do Ágar Vermelho Congo (AVC). Na segunda fase foi realizada uma caracterização genotípica dos isolados de Staphylococcus spp., pesquisando os genes icaA, icaD, bap, bbp, cna, ebpS, eno, fib, fnbA, fnbB, clfA e clfB. Na terceira fase foram selecionadas 10 cepas com diferentes perfis genotípicos e três cepas padrão de Staphylococcus spp., para avaliação da capacidade de formação de biofilmes. Foi avaliada a capacidade de formação de biofilmes das 13 cepas em três tempos (12h, 48h e 96h), duas temperaturas (5°C e 25°C) e duas superfícies de contato (aço inoxidável 304 e polipropileno) tendo como primeira variável resposta a densidade óptica a 600 nm obtida utilizando metodologia do cristal violeta e a segunda variável resposta foi a contagem microbiológica de células viáveis (log10UFC cm-2) aderidas nas superfícies testadas. Foi utilizado um Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC) com fatorial de 13x3x2x2. No AVC 38,7% (n=58) dos 150 isolados foram positivos para formação de biofilme. Observou-se que 93,3% (n=140) dos 150 isolados possuíam o gene clfA, 87,3% (n=131) o eno, 62,7% (n=94) o ebpS, 54,7% (n=82) o fib, 54% (n=81) o fnbA, 53,3% (n=80) o icaD, 47,3% (n=71) os genes icaA e clfB, 43,3% (n=65) o fnbB, 17,3% (n=26) o bap, 8% (n=8) o cna e 4% (n=40) o gene bbp. Pelo Teste de Friedman (=0,05) os fatores cepa, temperatura e superfície foram significativos (p<0,0001) para as duas variáveis resposta na formação de biofilmes, enquanto que, entre os tempos de avaliação não houve diferença significativa (p>0,05). A maior produção de biofilme (avaliada por densidade óptica) foi observada a 25°C no aço inoxidável, sendo que as cepas S. epidermidis ATCC 35984 e S. aureus 119 foram as cepas que apresentaram maior formação de biofilme. Nas superfícies testadas foram observadas contagens microbiológicas na faixa entre 6,5 e 7,6 log10 UFC m-2 que sugerem formação de biofilme. A formação de biofilmes nas 6 cepas avaliadas foi confirmada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).

The biofilm formation on surfaces, which are contact with food, can result in contamination in any part of the food processing, causing foodborne illness. The biofilm formation by Staphylococcus ssp. is one of the main concern in the dairy industry, and in the veterinary medicine field. This research aimed to evaluate the biofilm formation capacity of Staphylococcus spp., isolated from dairy producers of Minas Frescal cheese and cows with subclinical mastitis. The study was conducted in three stages, being the first a phenotypic characterization of 150 Staphylococcus spp. strains using the Congo Red Agar (AVC) test. In the second stage, the genotypic characterization with the screening of the gens icaA, icaD, bap, bbp, cna, ebpS, eno, fib, fnbA, fnbB, cIfA and clfB was performed. In the third stage, 10 strains with different genotypic profiles and 3 standard strains of Staphylococcus spp. were selected to evaluate the biofilm formation capacity. The biofilm formation capacity of 13 strains at three times (12h, 48h and 96h), two temperatures (5 °C and 25 °C) and two contact surfaces (stainless steel 304 and polypropylene) was evaluated. As a result, the optical density at 600 nm obtained by the methodology of crystal violet and the microbiological count of viable cells (log10UFC cm-2) (adhered to the tested surfaces) was analyzed. A completely randomized design was used in a factorial 13x3x2x2. In AVC agar, 38.7% (n = 58) of the 150 isolates were positive for biofilm formation. The 93.3% (n = 140) of the 150 isolates had the cIfA gene, 87.3% (n = 131) the eno, 62.7% (n = 94) the ebpS, 54.7% ( n = 82) fib, 54% (n = 81) the fnbA, 53.3% (n = 80) the icaD, 47.3% (n = 71) icaA and clfB gens, 43.3% (n = 65) the fnbB, 17.3% (n = 26) bap, 8% (n = 8) the cna and 4% (n = 40) bbp gene. The factors strain, temperature and surface were significant (Friedman test p <0.0001) for both response variables in the formation of biofilms, while, time did not have significant difference (p> 0.05). The increased production of biofilm (assessed by optical density) was observed at 25 °C in stainless steel surfaces. The strains S. epidermidis ATCC 35984 and S. aureus 119 were the strains that showed the highest production of biofilm. In the tested surfaces, microbiological counts were observed in the range between 6.5 and 7.6 log10 CFU m-2 suggesting biofilm formation. The formation of biofilms in 6 evaluated strains has been confirmed by Scanning Electron Microscopy (SEM).

PESQUISA DOS GENES icaA, icaD e bap DE ADESÃO INTERCELULAR BACTERIANA E FORMAÇÃO DE BIOFILME POR Staphylococcus aureus E Staphylococcus coagulase-negativa ISOLADOS DE MASTITE BOVINA

Staphylococcus aureus é comum em infecções intramamárias, que frequentemente se tornam crônicas, entre outros fatores, pela capacidade dessa bactéria em produzir biofilme. Objetivou-se verificar a capacidade produtora de biofilme em estirpes de S. aureus e Staphylococcus coagulase negativa (SCN), oriundas de mastite bovina clínica e subclínica. Um total de 100 cepas de S. aureus e 100 cepas de SCN foram isoladas de casos de mastites subclínicas e clínicas em duas propriedades do Estado de São Paulo. O teste de triagem da mastite subclínica foi o California Mastitis Test (CMT). Foi realizada Contagem de Células Somáticas (CCS) e cultivo microbiológico das amostras de leite. Pesquisou-se a presença de genes icaA, icaD e bap pela Reação em Cadeia pela Polimerase (Polimerase Chain Reaction - PCR) e caracterização fenotípica no ágar Vermelho Congo (VC) e teste de produção de biofilme em placas. Não houve relação entre a intensidade da reação ao CMT e a CCS. A média de CCS foi de 2,88±0,59 para S. aureus e 2,71±0,35 para SCN. Não houve significância estatísticas entre os valores de CCS para estirpes que continham a presença dos genes pesquisados. Porém as médias dos valores de CCS foram maiores nos isolados que continham tais genes. As frequências de icaA, icaD e bap em S. aureus foram de 82%, 83% e 58%, respectivamente. Observou-se que dos 83 isolados de S. aureus que apresentaram icaD, 82 (98,8%) também apresentaram icaA, com significância estatística no Teste Exato de Fischer (p<0,001). Na associação entre os genes icaA e bap, também foi observada associação significante pois das 82 estirpes que apresentaram icaA, foi possível observar a presença de bap em 56 (68,3%). Das 83 linhagens que continham o gene icaD em 56 (67,5%) delas, também foi detectada presença do gene bap. Não houve concordância entre os testes fenotípicos (K<0,2). A positividade no vermelho congo revelou que 25% das estirpes de S. aureus produziram biofilme in vitro. Já no teste de aderência em placas, esse número foi menor, com 15% de positividade. Pela análise dos resultados, pode-se verificar que ambos os testes fenotípicos não foram indicados para avaliar a capacidade produtora de biofilme em linhagens de S. aureus de mastite bovina. A presença de quaisquer dos genes pesquisados, não refletiu no processo inflamatório, bem como na CCS.

Staphylococcus aureus is common in intramammary infections, which often become chronic, among other factors, by the ability of this bacteria to produce biofilm. The objective was to verify the production of biofilm capacity in strains of S. aureus and coagulase negative Staphylococcus (CNS), derived from clinical and subclinical bovine mastitis. A total of 100 strains of S. aureus and 100 strains of CNS were isolated from cases of subclinical and clinical mastitis in two properties of São Paulo State. The screening test of subclinical mastitis was the California Mastitis Test (CMT). Somatic Cell Count (SCC) and microbiological culture of milk samples was performed. We researched the presence of icaA, icaD and bap genes by the Polymerase Chain Reaction (PCR) and phenotypic characterization on congo red agar (CRA) and biofilm production on plates. There was no observed relationship between the intensity of the reaction to the CMT and SCC. The mean of SCC was 2.88 ± 0.59 for S. aureus and 2.71 ± 0.35 for CNS. There was no significant statistical between SCC values for strains containing the presence of those researched genes. But the means of the CCS values were higher in isolates that containing such genes. The frequency icaA, icaD and bap in S. aureus were 82%, 83% and 58%, respectively. It was observed that the 83% of S. aureus isolates that had icaD, 82 (98.8%) also had icaA, with statistical significance in the Fischer's exact test (p <0.001). In association between icaA and bap genes, was also observed significant association, for the 82 strains that showed icaA, we observed the presence of bap in 56 (68.3%). Of the 83 strains that containing the icaD gene, 56 (67.5%) of them was also detected the presence of bap gene. There was no agreement between the phenotypic tests (K<0.2). The positivity on congo red agar revealed that 25% of S. aureus strains produced in vitro biofilm. In the adhesion test plates, this number was lower, with 15% of positivity. Examining the results, it can be seen that both phenotypic tests were not recommended to assess the capacity of biofilm production in strains of S. aureus from bovine mastitis. The presence of any the genes studied, not reflected in the inflammatory process, as well as the CCS.

Avaliação de diferentes técnicas para coloração de sêmen de peixes / Different techniques to evaluate to stain fish semen / Evaluación de técnicas para colorear sémen de peces

A análise da morfologia dos espermatozóides do sêmen colhido de 30 pacus (Piaractus mesopotamicus) consistiu de três soluções fixadoras: formol salina tamponada (FS), citrato sódio diidratado a 3% (CS) e água destilado (Ag) e para corar as células espermáticas três corantes: Vermelho Congo (VC), Rosa Bengala (RB) e Williams-modificado (WM). As combinações de corantes e soluções fixadoras utilizadas foram: RB X FS, WM X FS, VC X FS, VC X Ag, WM X Ag, WM X CS e VC X CS. Na avaliação dos esfregaços levaram-se em consideração as alterações anatômicas, a eficiência do corante, a aglutinação e a sujidade. Quando o sêmen foi diluído em CS e Ag, os espermatozóides sofreram alterações anatômicas e aglutinação, inviabilizando a análise. O FS não gerou alteração anatômica e nem aglutinação dos espermatozóides, sendo possível avaliar a eficiência do corante. Ao analisar a combinação RB X FS verificou-se a melhor média estimada de 9,97 pontos (P<0,05), com baixa sujidade e boa eficiência do corante. A combinação WM X FS resultou na média estimada de 7,35 pontos e a do VC X FS de 6,83 pontos que foram valores menores (P<0,05) em comparação aos esfregaços da combinação RB X FS. De acordo com os resultados obtidos neste estudo, a combinação do RB X FS apresentou os melhores resultados, sendo recomendado preparar esfregaços para analisar a morfologia dos espermatozóides de pacus (Piaractus mesopotamicus).(AU)

The analyses of spermatozoa morphology from semen obtained from pacus (Piaractus mesopotamicus) consisted of three fi xers solution: formal-saline buffered (FB), 3 % sodium citrate diihydrated (SC) and distilled water (DW) and to stain the spermatic cells were used three dyeing: Congo red (CR), Bengal rose (BR) and Williams modifi ed (WM). Combinations of dyeing and fi xers solution were: BR x BF, WM x FB, CR x FB, CR x DW, WM x DW, WM x SC and CR x SC. In the rubbing brush stained evaluation was considered spermatozoa anatomic alterations, dyeing effi ciency, agglutination and dirtiness. For semen diluted in SC and DW was observed spermatozoa anatomic alterations and agglutination on the rubbing brush, becoming impossible any analyses. When semen was diluted in FB to prepare rubbing brush was not observed spermatozoa anatomic alterations and agglutination, becoming possible to evaluate dyeing effi ciency. In analyze of BR x FB combination was verifi ed the best estimate average of 9.97 points (P<0.05), showing reduced dirtiness and good effi ciency of dyeing. When combination was WM x FB the estimate average was 7.35 points and CR x FB was 6.83 points which were lower (P<0.05) than the average verifi ed in the rubbing brush stained with BR x FB. According to the results observed in this study, the best combination to evaluate spermatozoa morphology from pacus semen was rubbing brush stained with BR x FB combination.(AU)

El análisis de la morfologia de los espermatozoides del semen colectado de 30 pacus (Piaractus mesopotamicus) consistio en tres soluciones fi jadoras: Formol salina tamponada (FS), citrato sodio bihidratado al 3% (CS) y agua destilada (Ag) y para colorear las células espermáticas tres colorantes: Rojo Congo (VC), Rosa Bengala (RB) y Williams modifi cado (WM). Las combinaciones de colorantes y soluciones fi jadoras utilizadas fueron: RB x FS, WB x FS, VC x FS, VC x Ag, WM x Ag, WM x CS y VC x CS. En la evaluación de los frotis se tuvo en cuenta las alteraciones anatómicas, la efi ciencia del colorante, la aglutinacion y la suciedad. Cuando el semen fue diluído en CS y Ag, los espermatozoides sufrieron alteraciones anatómicas y aglutinación, inviabilizando el análisis. El FS no generó alteracion anatómica ni aglutinación de los espermatozoides, siendo posible evaluar la efi ciencia del colorante. Al analizar la combinación RB x FS se verifi có la mejor média estimada de 9,97 puntos (P〈0,05) con baja suciedad y buena efi ciencia del colorante. La combinación WM x FS resultó en el promedio estimado de 7,35 puntos y la de VC x FS de 6,83 puntos que fueron valores menores (P〈0,05) en comparación a los frotis de la combinación RB x FS. De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, la combinación de RB x FS presentó los mejores resultados, siendo recomendado para preparar frotis para analizar la morfologia de los espermatozoides de pacus (Piaractus mesopotamicus).(AU)