Identification by molecular techniques of halophilic bacteria producing important enzymes from pristine area in Campeche, Mexico / Identificação por técnicas moleculares de bactérias halofílicas que produzem enzimas importantes em área intocada de Campeche, México

Isla Arena is located in the coordinate 20° 70´ N - 90° 45´ W, from Campeche, Mexico. In these estuaries, the ocean mixes with fresh water, and ecosystems are concentrated where petenes and pink flamingos proliferate. Crustaceans and mollusks abound in the sea. Despite its enormous marine wealth, there are no studies carried out on which halophilic microorganisms are present in these waters. In this work, the diversity and structure of the microbial community was investigated through a metagenomics approach and corroborated for sequencing of 16S rRNA genes. It was found that the phylum Fimicutes predominates with more than 50%, in almost the same proportion of the class Bacilli and with almost 41% of relative abundance of the order Bacillales. The sequencing results showed that one of the samples presented a high percentage of similarity (99.75%) using the Nucleotide BLAST program with a peculiar microorganism: Bacillus subtilis. This microorganism is one of the best characterized bacteria among the gram-positive ones. Our results demonstrate that B. subtilis can be an efficient source of proteases, lipases and cellulases, from halophilic microbial communities located in poorly explored areas.

Isla Arena está localizada na coordenada 20°70’N - 90°45’W, de Campeche, México. Nesses estuários, o oceano se mistura com a água doce e os ecossistemas se concentram onde proliferam petenos e flamingos rosa. Crustáceos e moluscos abundam no mar. Apesar de sua enorme riqueza marinha, não há estudos realizados sobre a presença de microrganismos halofílicos nessas águas. Neste trabalho, a diversidade e estrutura da comunidade microbiana foram investigadas através de uma abordagem metagenômica e corroboradas para o sequenciamento de genes 16S rRNA. Verificou-se que o filo Fimicutes predomina com mais de 50%, quase na mesma proporção da classe Bacilli e com quase 41% de abundância relativa da ordem Bacillales. Os resultados do sequenciamento mostraram que uma das amostras apresentou alto percentual de similaridade (99,75%) pelo programa Nucleotide BLAST com um microrganismo peculiar: Bacillus subtilis. Nossos resultados demonstram que B. subtilis pode ser uma fonte eficiente de proteases, lipases e celulases, provenientes de comunidades microbianas halofílicas localizadas em áreas pouco exploradas.

Identification by molecular techniques of halophilic bacteria producing important enzymes from pristine area in Campeche, Mexico

Abstract Isla Arena is located in the coordinate 20° 70´ N - 90° 45´ W, from Campeche, Mexico. In these estuaries, the ocean mixes with fresh water, and ecosystems are concentrated where petenes and pink flamingos proliferate. Crustaceans and mollusks abound in the sea. Despite its enormous marine wealth, there are no studies carried out on which halophilic microorganisms are present in these waters. In this work, the diversity and structure of the microbial community was investigated through a metagenomics approach and corroborated for sequencing of 16S rRNA genes. It was found that the phylum Fimicutes predominates with more than 50%, in almost the same proportion of the class Bacilli and with almost 41% of relative abundance of the order Bacillales. The sequencing results showed that one of the samples presented a high percentage of similarity (99.75%) using the Nucleotide BLAST program with a peculiar microorganism: Bacillus subtilis. This microorganism is one of the best characterized bacteria among the gram-positive ones. Our results demonstrate that B. subtilis can be an efficient source of proteases, lipases and cellulases, from halophilic microbial communities located in poorly explored areas.

Resumo Isla Arena está localizada na coordenada 20°70N - 90°45W, de Campeche, México. Nesses estuários, o oceano se mistura com a água doce e os ecossistemas se concentram onde proliferam petenos e flamingos rosa. Crustáceos e moluscos abundam no mar. Apesar de sua enorme riqueza marinha, não há estudos realizados sobre a presença de microrganismos halofílicos nessas águas. Neste trabalho, a diversidade e estrutura da comunidade microbiana foram investigadas através de uma abordagem metagenômica e corroboradas para o sequenciamento de genes 16S rRNA. Verificou-se que o filo Fimicutes predomina com mais de 50%, quase na mesma proporção da classe Bacilli e com quase 41% de abundância relativa da ordem Bacillales. Os resultados do sequenciamento mostraram que uma das amostras apresentou alto percentual de similaridade (99,75%) pelo programa Nucleotide BLAST com um microrganismo peculiar: Bacillus subtilis. Nossos resultados demonstram que B. subtilis pode ser uma fonte eficiente de proteases, lipases e celulases, provenientes de comunidades microbianas halofílicas localizadas em áreas pouco exploradas.

Identification by molecular techniques of halophilic bacteria producing important enzymes from pristine area in Campeche, Mexico / Identificação por técnicas moleculares de bactérias halofílicas que produzem enzimas importantes em área intocada de Campeche, México

Abstract Isla Arena is located in the coordinate 20° 70´ N - 90° 45´ W, from Campeche, Mexico. In these estuaries, the ocean mixes with fresh water, and ecosystems are concentrated where petenes and pink flamingos proliferate. Crustaceans and mollusks abound in the sea. Despite its enormous marine wealth, there are no studies carried out on which halophilic microorganisms are present in these waters. In this work, the diversity and structure of the microbial community was investigated through a metagenomics approach and corroborated for sequencing of 16S rRNA genes. It was found that the phylum Fimicutes predominates with more than 50%, in almost the same proportion of the class Bacilli and with almost 41% of relative abundance of the order Bacillales. The sequencing results showed that one of the samples presented a high percentage of similarity (99.75%) using the Nucleotide BLAST program with a peculiar microorganism: Bacillus subtilis. This microorganism is one of the best characterized bacteria among the gram-positive ones. Our results demonstrate that B. subtilis can be an efficient source of proteases, lipases and cellulases, from halophilic microbial communities located in poorly explored areas.

Resumo Isla Arena está localizada na coordenada 20°70'N - 90°45'W, de Campeche, México. Nesses estuários, o oceano se mistura com a água doce e os ecossistemas se concentram onde proliferam petenos e flamingos rosa. Crustáceos e moluscos abundam no mar. Apesar de sua enorme riqueza marinha, não há estudos realizados sobre a presença de microrganismos halofílicos nessas águas. Neste trabalho, a diversidade e estrutura da comunidade microbiana foram investigadas através de uma abordagem metagenômica e corroboradas para o sequenciamento de genes 16S rRNA. Verificou-se que o filo Fimicutes predomina com mais de 50%, quase na mesma proporção da classe Bacilli e com quase 41% de abundância relativa da ordem Bacillales. Os resultados do sequenciamento mostraram que uma das amostras apresentou alto percentual de similaridade (99,75%) pelo programa Nucleotide BLAST com um microrganismo peculiar: Bacillus subtilis. Nossos resultados demonstram que B. subtilis pode ser uma fonte eficiente de proteases, lipases e celulases, provenientes de comunidades microbianas halofílicas localizadas em áreas pouco exploradas.

Identification by molecular techniques of halophilic bacteria producing important enzymes from pristine area in Campeche, Mexico / Identificação por técnicas moleculares de bactérias halofílicas que produzem enzimas importantes em área intocada de Campeche, México

Isla Arena is located in the coordinate 20° 70´ N - 90° 45´ W, from Campeche, Mexico. In these estuaries, the ocean mixes with fresh water, and ecosystems are concentrated where petenes and pink flamingos proliferate. Crustaceans and mollusks abound in the sea. Despite its enormous marine wealth, there are no studies carried out on which halophilic microorganisms are present in these waters. In this work, the diversity and structure of the microbial community was investigated through a metagenomics approach and corroborated for sequencing of 16S rRNA genes. It was found that the phylum Fimicutes predominates with more than 50%, in almost the same proportion of the class Bacilli and with almost 41% of relative abundance of the order Bacillales. The sequencing results showed that one of the samples presented a high percentage of similarity (99.75%) using the Nucleotide BLAST program with a peculiar microorganism: Bacillus subtilis. This microorganism is one of the best characterized bacteria among the gram-positive ones. Our results demonstrate that B. subtilis can be an efficient source of proteases, lipases and cellulases, from halophilic microbial communities located in poorly explored areas.(AU)

Isla Arena está localizada na coordenada 20°70N - 90°45W, de Campeche, México. Nesses estuários, o oceano se mistura com a água doce e os ecossistemas se concentram onde proliferam petenos e flamingos rosa. Crustáceos e moluscos abundam no mar. Apesar de sua enorme riqueza marinha, não há estudos realizados sobre a presença de microrganismos halofílicos nessas águas. Neste trabalho, a diversidade e estrutura da comunidade microbiana foram investigadas através de uma abordagem metagenômica e corroboradas para o sequenciamento de genes 16S rRNA. Verificou-se que o filo Fimicutes predomina com mais de 50%, quase na mesma proporção da classe Bacilli e com quase 41% de abundância relativa da ordem Bacillales. Os resultados do sequenciamento mostraram que uma das amostras apresentou alto percentual de similaridade (99,75%) pelo programa Nucleotide BLAST com um microrganismo peculiar: Bacillus subtilis. Nossos resultados demonstram que B. subtilis pode ser uma fonte eficiente de proteases, lipases e celulases, provenientes de comunidades microbianas halofílicas localizadas em áreas pouco exploradas.(AU)

Cellulolytic activity of anaerobic facultative fungi from the digestive tract of sheep fed with banana leaf hay / Atividade celulolítica de fungos aeróbios facultativos do trato digestório de ovinos alimentados com feno da folha de bananeira

The addition of cellulolytic fungi, or their enzymes, in diets containing high levels of fiber are promising strategy for improving the performance. In this study, the aims were to select cellulolytic fungi from the digestive tract of sheep fed different concentrations of banana leaf hay. Thirty lambs raised in a feedlot were evaluated, distributed in a completely randomized design, with diets containing 0, 125, 250, 375, or 500 g/Kg of dry matter and six replications. Approximately 15 mL of ruminal fluid and swabs from the rectal ampulla were collected. The cultures were carried out in a medium containing microcrystalline cellulose (C medium). The mycelial fungi isolates were identified through the microculture technique. Among the fungi from the ruminal fluid, 23 isolates corresponded to the genus Aspergillus and three to Paecilomyces spp. Among the isolates from the rectal ampulla, seven were A. spp., and three were P. spp. The A. genus predominated among the isolates from both evaluated sites (p <0.05). Fragments of these fungi were inoculated in triplicate in medium C at 37 °C and the cellulolytic activity index (CAI) was determined after 24, 48, and 72 hours of incubation. There was no difference in the CAI of Aspergillus spp. from animals fed different diets or of different evaluated sites (P > 0.05). However, 22 isolates of Aspergillus spp. and three of Paecilomyces spp. showed a CAI > 1, indicating biotechnological potential for cellulase production. These selected isolates could be selected for the elaboration of microbial additives in ruminant diets.(AU)

A adição de fungos celulolíticos, ou suas enzimas, em dietas contendo elevados teores de fibras são estratégias pro-missoras para melhorar o desempenho. Neste estudo os objetivos foram selecionar fungos celulolíticos do trato digestório de ovinos alimentados com diferentes concentrações do feno da folha da bananeira (FBH). Foram avaliados 30 borregos criados em sistema intensivo, distribuídos em delineamento inteiramente ao acaso, com cinco dietas contendo 0, 125, 250, 375 ou 500 g/KG de matéria seca em seis repetições. Foram coletados aproximadamente 15 mL de fluido ruminal e swabs da ampola retal. Os cultivos foram realizados em meio de cultura contendo celulose microcristalina (meio C). Os fungos micelianos foram identificados após a técnica de microcultivo. Entre os fungos provenientes do fluido ruminal, 23 isolados corresponderam ao gênero Aspergillus e três a Paecilomyces spp.. Foram identificados nas fezes dos animais sete Aspergillus spp. e três Paecilomyces spp.. O gênero Aspergillus predominou entre os isolados de ambos os sítios avaliados (p =0,013). Fragmentos desses fungos foram inoculados em triplicada em meio C a 37 °C e determinou-se o índice de atividade celulolítica(IAC) após 24, 48 e 72 horas de incubação. Não houve diferença entre CAI de isolados de Aspergillus spp. provenientes dos animais em diferentes dietas ou sítios avaliados (P > 0.05). Entretanto, 22 isolados de Aspergillus spp. e três de Paecilomyces spp. apresentaram IAC >1, indicando potencial biotecnológico para produção de celulases.(AU)

Fungal cellulases: production by solid-state cultivation in packedbed bioreactor using solid agro-industrial by-products as substrates and application for hydrolysis of sugarcane bagasse / Celulases fúngicas: produção por cultivo sólido em biorreator de leito empacotado usando resíduos sólidos agroindustriais como substratos e aplicação na hidrólise de bagaço de cana

Cellulases are essential for the hydrolysis of lignocellulosic materials in the production of second generation ethanol. Solid-state cultivation is a process that provides high concentrations of enzymes that can be used in this hydrolysis. The objectives of this work were to produce cellulases by cultivating the fungus Myceliophthora thermophila I-1D3b in a packed bed bioreactor with sugarcane bagasse (SCB) and wheat bran (WB) as substrate and to evaluate the efficiency of the enzymatic extract in the hydrolysis of SCB in natura (BIN) and pretreated with ozone, alkali and ultrasound (BOU). The conditions for enzyme production in the bioreactor were SCB:WB at a ratio of 2.3:1 (w/w), 75 % moisture content; 45 ºC; aeration rate 240 L h-¹ and 96 h. The enzyme production was evaluated by endoglucanase, xylanase, filter paper (FPU) and β-glycosidase activities. For the application of the enzymes, a central composed response surface design with 5 repetitions of the central point was used, taking enzyme volume and hydrolysis time as factors. Such cultivation yielded the following enzymatic activities: 723 U gss-¹ of endoglucanases, 2024 U gss-¹ of xylanase, 12.6 U gss-¹ of FPU and 41 U gss-¹ of β-glucosidase. The results of the application tests indicated the best conditions as 7.0 mL of the enzyme extract (4.2 FPU) and 6 hours for BIN and BOU. The best cellulose-glucose conversions were obtained for BOU, reaching 32.1 % at 65 ºC. In conclusion, the enzyme production in the packed bed bioreactor was efficient and BOU pretreatment improved the hydrolysis of biomass, increasing the efficiency of conversion of cellulose to glucose.

Celulases são essenciais para a hidrólise de materiais lignocelulósicos visando à produção de etanol de segunda geração. O cultivo em estado sólido é um processo que proporciona altas concentrações de enzimas que podem ser aplicadas nessa hidrólise. O objetivo deste trabalho foi produzir celulases pelo fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b em biorreator de leito empacotado com bagaço decana (BC) e farelo de trigo (FT) como substrato e avaliar a eficiência deste extrato enzimático na hidrólise de bagaço de cana in natura (BIN) e pré-tratado com ozônio, álcali e ultrassom (BOU). As condições para produção de enzimas no biorreator foram BC:FT numa proporção de 2,3:1 (m/m); 75 %de umidade em base úmida; 45 ºC; taxa de aeração 240 L h-1 e 96 h. A produção de enzimas foi avaliada pelas atividades de endoglucanase, xilanase, papel de filtro (FPU) e β-glicosidase. Para a aplicação das enzimas, foi utilizado um planejamento de superfície de resposta central composto com 5 repetições do ponto central, tendo como fatores o volume de extrato enzimático e o tempo de hidrólise. Esse cultivo produziu as seguintes atividades enzimáticas: 723 U gss-1 de endoglucanases, 2024 U gss-¹ de xilanase, 12,6 U gss-¹ de FPU e 41 U gss-¹ de β-glucosidase. Os resultados da aplicação dessas enzimas na hidrólise indicaram como ótimos 7,0 mL de extrato enzimático (4,2 FPU) e 6 horas para BIN e BOU. As melhores conversões de celulose-glicose foram obtidas para a BOU, atingindo 32,1 % a 65 ºC. Em conclusão, a produção de enzimas no biorreator de leito compactado foi eficiente e o pré-tratamento BOU melhorou a hidrólise da biomassa, aumentando a eficiência de conversão de celulose em glicose.

Fungal cellulases: production by solid-state cultivation in packedbed bioreactor using solid agro-industrial by-products as substrates and application for hydrolysis of sugarcane bagasse / Celulases fúngicas: produção por cultivo sólido em biorreator de leito empacotado usando resíduos sólidos agroindustriais como substratos e aplicação na hidrólise de bagaço de cana

Cellulases are essential for the hydrolysis of lignocellulosic materials in the production of second generation ethanol. Solid-state cultivation is a process that provides high concentrations of enzymes that can be used in this hydrolysis. The objectives of this work were to produce cellulases by cultivating the fungus Myceliophthora thermophila I-1D3b in a packed bed bioreactor with sugarcane bagasse (SCB) and wheat bran (WB) as substrate and to evaluate the efficiency of the enzymatic extract in the hydrolysis of SCB in natura (BIN) and pretreated with ozone, alkali and ultrasound (BOU). The conditions for enzyme production in the bioreactor were SCB:WB at a ratio of 2.3:1 (w/w), 75 % moisture content; 45 ºC; aeration rate 240 L h-¹ and 96 h. The enzyme production was evaluated by endoglucanase, xylanase, filter paper (FPU) and β-glycosidase activities. For the application of the enzymes, a central composed response surface design with 5 repetitions of the central point was used, taking enzyme volume and hydrolysis time as factors. Such cultivation yielded the following enzymatic activities: 723 U gss-¹ of endoglucanases, 2024 U gss-¹ of xylanase, 12.6 U gss-¹ of FPU and 41 U gss-¹ of β-glucosidase. The results of the application tests indicated the best conditions as 7.0 mL of the enzyme extract (4.2 FPU) and 6 hours for BIN and BOU. The best cellulose-glucose conversions were obtained for BOU, reaching 32.1 % at 65 ºC. In conclusion, the enzyme production in the packed bed bioreactor was efficient and BOU pretreatment improved the hydrolysis of biomass, increasing the efficiency of conversion of cellulose to glucose.(AU)

Celulases são essenciais para a hidrólise de materiais lignocelulósicos visando à produção de etanol de segunda geração. O cultivo em estado sólido é um processo que proporciona altas concentrações de enzimas que podem ser aplicadas nessa hidrólise. O objetivo deste trabalho foi produzir celulases pelo fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b em biorreator de leito empacotado com bagaço decana (BC) e farelo de trigo (FT) como substrato e avaliar a eficiência deste extrato enzimático na hidrólise de bagaço de cana in natura (BIN) e pré-tratado com ozônio, álcali e ultrassom (BOU). As condições para produção de enzimas no biorreator foram BC:FT numa proporção de 2,3:1 (m/m); 75 %de umidade em base úmida; 45 ºC; taxa de aeração 240 L h-1 e 96 h. A produção de enzimas foi avaliada pelas atividades de endoglucanase, xilanase, papel de filtro (FPU) e β-glicosidase. Para a aplicação das enzimas, foi utilizado um planejamento de superfície de resposta central composto com 5 repetições do ponto central, tendo como fatores o volume de extrato enzimático e o tempo de hidrólise. Esse cultivo produziu as seguintes atividades enzimáticas: 723 U gss-1 de endoglucanases, 2024 U gss-¹ de xilanase, 12,6 U gss-¹ de FPU e 41 U gss-¹ de β-glucosidase. Os resultados da aplicação dessas enzimas na hidrólise indicaram como ótimos 7,0 mL de extrato enzimático (4,2 FPU) e 6 horas para BIN e BOU. As melhores conversões de celulose-glicose foram obtidas para a BOU, atingindo 32,1 % a 65 ºC. Em conclusão, a produção de enzimas no biorreator de leito compactado foi eficiente e o pré-tratamento BOU melhorou a hidrólise da biomassa, aumentando a eficiência de conversão de celulose em glicose.(AU)

In vitro degradability of coffee husks treated with doses of fibrolytic enzymes for use in ruminant nutrition / Avaliação da degradabilidade in vitro da casca de café tratada com doses de enzimas fibrolíticas para aproveitamento na alimentação de ruminantes

The agricultural activity has generated a progressive amount of waste, which needs a proper treatment to avoid negative environmental impacts. At the same time, values can be added to such waste, as its use in animal feed. This research was conducted at the laboratory of Animal Nutrition, State University of Southwestern Bahia, campuses of Vitória da Conquista and Itapetinga. The objective of this study was to evaluate the effect of coffee husks on ruminant feeds by increasing doses of fibrolytic enzymes, evaluating their effects on in vitro ruminal degradability of dry matter (DM), neutral detergent fiber (NDF), and acid detergent fiber (FDA) of the coffee husk (CH). The experiment was a completely randomized design in a 2x4 factorial scheme. It compounded the following treatments: Coffee husk (CH1): 1.5% enzymes (E) and 24 h enzymatic action (EA); CH2: 3.0% (E) and 24h (EA); CH3: 4.5% (E) and 24 h (EA); CH4: 6% (E) and 24 h (EA); CH5: 1.5% (E) 48 h (EA); CH6: 3% (E) and 48h (EA); CH7: 4.5% (E) and 48h (EA); and CH8: 6% (E) and 48 h (EA), all based on dry matter. An improvement in the degradability of the nutritional parameters MS, NDF, and FDA occurred with the addition of enzymes, with 3% enzyme addition being the best level, and 24 hours, as the best action time. In addition to that, as the EA on coffee husk increased, the degradation rate decreased. Therefore, the use of enzymes can improve the digestibility of the fibrous fraction, enabling the use of the coffee husk andpossibly other agroindustrial residues, thus minimizing their adverse effects on nature.

A atividade agrícola tem gerado uma quantidade progressiva de resíduos, os quais necessitam serem tratados de forma adequada para que não promovam impactos ambientais negativos e que, ao mesmo tempo, sejam agregados valores a estes para que possam ser utilizados na alimentação animal. A pesquisa foi conduzida no laboratório de Nutrição Animal da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus de Vitória da Conquista e Itapetinga. Objetivou-se o aproveitamento da casca de café na alimentação de ruminantes através do tratamento com doses crescentes de enzimas fibrolíticas avaliando seus efeitos sobre a degradabilidade ruminal in vitro da matéria seca (MS), fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) da casca de café (CC). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado, com esquema fatorial 2x4, constituindo os seguintes tratamentos Casca de café (CC1): 1,5% de Enzimas (E) e 24h de Ação Enzimática (AE); CC2: 3% (E) e 24h (AE); CC3: 4,5%(E) e 24 h(AE); CC4:6 % (E) e 24 h(AE); CC5: 1,5% (E) 48 h(AE); CC6: 3% (E) e 48h(AE); CC7:4,5% (E) e 48h(AE); CC8: 6% (E) e 48 h(AE), com base na matéria seca. Constatou-se que com adição de enzimas, ocorreu uma melhora na degradabilidade dos parâmetros nutricionais MS, FDN e FDA, sendo 3% de enzimas o melhor nível e 24 horas o melhor tempo de ação. Além disso, à medida que a ação enzimática na casca de café aumentou, a taxa de degradação diminuiu. Portanto, o uso de enzimaspode melhorar a digestibilidade da fração fibrosa, possibilitando o uso da casca de café e possivelmenteoutros resíduos agroindustriais, minimizando assim seus efeitos adversos sobre a natureza.

In vitro degradability of coffee husks treated with doses of fibrolytic enzymes for use in ruminant nutrition / Avaliação da degradabilidade in vitro da casca de café tratada com doses de enzimas fibrolíticas para aproveitamento na alimentação de ruminantes

The agricultural activity has generated a progressive amount of waste, which needs a proper treatment to avoid negative environmental impacts. At the same time, values can be added to such waste, as its use in animal feed. This research was conducted at the laboratory of Animal Nutrition, State University of Southwestern Bahia, campuses of Vitória da Conquista and Itapetinga. The objective of this study was to evaluate the effect of coffee husks on ruminant feeds by increasing doses of fibrolytic enzymes, evaluating their effects on in vitro ruminal degradability of dry matter (DM), neutral detergent fiber (NDF), and acid detergent fiber (FDA) of the coffee husk (CH). The experiment was a completely randomized design in a 2x4 factorial scheme. It compounded the following treatments: Coffee husk (CH1): 1.5% enzymes (E) and 24 h enzymatic action (EA); CH2: 3.0% (E) and 24h (EA); CH3: 4.5% (E) and 24 h (EA); CH4: 6% (E) and 24 h (EA); CH5: 1.5% (E) 48 h (EA); CH6: 3% (E) and 48h (EA); CH7: 4.5% (E) and 48h (EA); and CH8: 6% (E) and 48 h (EA), all based on dry matter. An improvement in the degradability of the nutritional parameters MS, NDF, and FDA occurred with the addition of enzymes, with 3% enzyme addition being the best level, and 24 hours, as the best action time. In addition to that, as the EA on coffee husk increased, the degradation rate decreased. Therefore, the use of enzymes can improve the digestibility of the fibrous fraction, enabling the use of the coffee husk andpossibly other agroindustrial residues, thus minimizing their adverse effects on nature.(AU)

A atividade agrícola tem gerado uma quantidade progressiva de resíduos, os quais necessitam serem tratados de forma adequada para que não promovam impactos ambientais negativos e que, ao mesmo tempo, sejam agregados valores a estes para que possam ser utilizados na alimentação animal. A pesquisa foi conduzida no laboratório de Nutrição Animal da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus de Vitória da Conquista e Itapetinga. Objetivou-se o aproveitamento da casca de café na alimentação de ruminantes através do tratamento com doses crescentes de enzimas fibrolíticas avaliando seus efeitos sobre a degradabilidade ruminal in vitro da matéria seca (MS), fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) da casca de café (CC). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado, com esquema fatorial 2x4, constituindo os seguintes tratamentos Casca de café (CC1): 1,5% de Enzimas (E) e 24h de Ação Enzimática (AE); CC2: 3% (E) e 24h (AE); CC3: 4,5%(E) e 24 h(AE); CC4:6 % (E) e 24 h(AE); CC5: 1,5% (E) 48 h(AE); CC6: 3% (E) e 48h(AE); CC7:4,5% (E) e 48h(AE); CC8: 6% (E) e 48 h(AE), com base na matéria seca. Constatou-se que com adição de enzimas, ocorreu uma melhora na degradabilidade dos parâmetros nutricionais MS, FDN e FDA, sendo 3% de enzimas o melhor nível e 24 horas o melhor tempo de ação. Além disso, à medida que a ação enzimática na casca de café aumentou, a taxa de degradação diminuiu. Portanto, o uso de enzimaspode melhorar a digestibilidade da fração fibrosa, possibilitando o uso da casca de café e possivelmenteoutros resíduos agroindustriais, minimizando assim seus efeitos adversos sobre a natureza.(AU)

Caracterização de fungos isolados da região Amazônica quanto ao potencial para produção das enzimas envolvidas na conversão da biomassa vegetal / Characterization of fungi isolated from the Amazon region for the potential of biomass-degrading enzymes production

A conversão da biomassa vegetal proveniente de resíduos agroindustriais e florestais em biocombustíveis e bioprodutos, dentro do conceito de biorrefinarias, é de grande interesse, principalmente para o Brasil, onde a agroenergia possui um enorme potencial de desenvolvimento. Entretanto, para garantir a viabilidade do processo de conversão, é fundamental reduzir o custo das enzimas utilizadas na etapa de hidrólise. Para isso, deve-se dispor da peça chave deste processo, que é o microrganismo. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar fungos isolados da região Amazônica em relação ao potencial de produção das enzimas celulases e xilanases. De um total de 40 isolados cultivados por fermentação em estado sólido (FES), durante 10 dias, os fungos que se destacaram quanto à produção de endoglucanase (351,79Ug-1 em 120h) e -glicosidase (62,31Ug-1em 72h) foi o P47C3 (A. niger), e na produção de xilanase (1076,94Ug-1 em 72h) e FPase (2,46Ug-1 em 120h) foram o P6B2 (A. oryzae) e o P40B3, respectivamente. Os resultados obtidos demonstram o enorme potencial de aplicação das enzimas produzidas pelos fungos isolados da Amazônia, contribuindo, assim, para gerar os avanços tecnológicos necessários para o aumento da eficiência do uso da biomassa vegetal como fonte de energia renovável.(AU)

The conversion of biomass from forestry and agroindustrial residues into biofuels and bioproducts, within the biorefinery concept, is of great interest, especially to Brazil, where bioenergy has a huge potential for development. However, to ensure the viability of the conversion process it is essential to reduce the cost of the enzymes used in the hydrolysis step. For this, one must have the key element of this process, which is the microorganism. In this context, the objective of this study was to evaluate different fungi isolated from the Amazon region for their potential in terms of the production of cellulase and xylanase enzymes. Of a total of 40 strains cultivated under solid state fermentation (SSF) for 10 days, the strain that stood out for the production of endoglucanase (351.79Ug-1120h) and -glucosidase (62.31Ug-1 at 72h) was P47C3 (A. niger) whereas for xylanase (1076.94Ug-1 in 72 hours) and FPase (2.46Ug-1 in120 hours) were P6B2 (A. oryzae) and P40B3, respectively. These results demonstrate the great potential application of the enzymes produced by the Amazon isolated fungi, thus contributing to generate the necessary technological advances in order to increase the efficiency of the use of biomass as a renewable energy source.(AU)

A CIANOBACTÉRIA Synechococcus elongatus COMO UMA BIOFÁBRICA SUSTENTÁVEL PARA A PRODUÇÃO DE -GLICOSIDASES MELHORADAS APLICADAS À PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

As -glicosidases são enzimas que atuam na etapa final da hidrólise enzimática da celulose, clivando as ligações glicosídicas 1-4 da celobiose, para obtenção do etanol de segunda geração (2G). Embora essa classe de enzimas seja considerada o fator limitante na produção de etanol 2G, sua concentração nos coquetéis enzimáticos é baixa além de serem facilmente inibidas pelo seu produto final, a glicose. Esses dois fatores contribuem para o alto custo do etanol 2G, diminuindo sua competitividade no mercado. Por serem fixadores de CO2 e não competirem com cultivos agrícolas por terra ou água, as cianobactérias são consideradas biorreatores interessantes para a produção de -glicosidases tolerantes à glicose através da engenharia genética. Na presente tese, produzimos uma linhagem de Synechococcus elongatus, através da inserção do sistema pET, capaz de expressar altos níveis de uma -glicosidase tolerante à glicose. Nossos dados mostram não só que o sistema pET promoveu uma elevada expressão do gene recombinante, como também a -glicosidase mutante apresentou uma resistência à retro15 inibição pela glicose quando comparada com a enzima original. A utilização de cianobactérias transgênicas para produção de -glicosidases mais eficientes possibilita a integração da produção do etanol de 2G com o etanol 1G, uma vez que poderiam utilizar subprodutos da própria usina (CO2, vinhaça e bagaço de cana) para a geração mais energia. Assim, os biorreatores fotossintéticos podem não apenas produzir -glicosidases eficientes e em maior quantidade, mas também reduzir o impacto ambiental causado pelas usinas de etanol.

-glucosidases are enzymes that act in the final step of the enzymatic hydrolysis of cellulose, cleaving the 1-4 glycosidic bonds of cellobiose, to obtain the second generation ethanol (2G). Although this class of enzymes is considered the limiting factor in the production of 2G ethanol, its concentration in enzyme cocktails is low and they are easily inhibited by its final product, glucose. These two factors contribute to the high cost of 2G ethanol, reducing its competitiveness in the market. Because they are CO2 fixers and do not compete with agricultural crops for land or water, cyanobacteria are considered to be interesting bioreactors for the production of glucose tolerant -glucosidases through genetic engineering. In the present thesis, we produced a strain of Synechococcus elongatus, through the insertion of the pET system which was able to express high levels of a glucose tolerant -glucosidase. Our data show not only that the pET system promoted high expression of the recombinant gene, but also the mutant variant showed a resistance to back-inhibition by glucose when compared to the original enzyme. The use of transgenic cyanobacteria for the production of more efficient -glucosidases makes it possible to integrate the production of 2G ethanol with 1G ethanol, since they could use by-products from the plant itself (CO2, vinasse and sugar cane bagasse) to generate more energy. Thus, photosynthetic bioreactors can not only produce efficient -glucosidases in larger quantities, but can also reduce the environmental impact caused by ethanol plants.

Cloning and expression of cellulase XF-818 of Xylella fastidiosa in Escherichia Coli

Xylella fastidiosa's genome was the first of a plant pathogen to be completely sequenced. Through comparative sequence analysis many genes were identified and, among them, several potentially involved in plant-pathogen interaction. However, the biological role of each gene should be assigned experimentally. On this regard, heterologous protein expression is a powerful tool to produce proteins from such genes, allowing their characterization. X. fastidiosa lives inside xylem vessels and eventually would degrade pit membranes from xylem cells to move radialy into the host. The identification of several putative plant cell wall degrading enzymes on X. fastidiosa genome prompted the assession of the function of such proteins. The open reading frame (ORF) Xf-818 was cloned into expression vector pET20b and E. coli cells harboring such plasmid exhibited cellulase activity. Using IPTG at 0.4 mmol L-1 with a 12 h incubation at 32°C are the best conditions to produce higher amounts of heterologous protein. The enzyme degrades cellulose confirming the endoglucanase activity of Xf-818.

Xylella fastidiosa foi a primeira bactéria fitopatogênica que teve seu genoma completamente seqüenciado. A identificação de diversos genes, através de similaridade de seqüências, indicou os possíveis mecanismos de patogenicidade da bactéria. Entretanto, a determinação da função de um gene requer a confirmação experimental e, neste aspecto, a expressão heteróloga é uma poderosa ferramenta. X. fastidiosa coloniza somente o xilema das plantas hospedeiras e a identificação putativa de diversos genes semelhantes a enzimas que degradam a parede celular vegetal, estimularam o presente estudo de catacterização destas enzimas. A clonagem da ORF Xf-818 de X. fastidiosa no vetor de expressão pET20b possibilitou a produção da proteína heterologamente em E. coli. O emprego de IPTG a 0,4 mmol L-1 com 12 h a 32°C, possibilitou as melhores condições para E. coli produzir a proteína heteróloga. Clones de E. coli que expressam Xf-818, apresentam atividade celulásica, degradando eficientemente a celulose. A identificação de Xf-818 como uma endoglicanase foi assim confirmada.

In vitro degradability of coffee husks treated with doses of fibrolytic enzymes for use in ruminant nutrition / Avaliação da degradabilidade in vitro da casca de café tratada com doses de enzimas fibrolíticas para aproveitamento na alimentação de ruminantes

The agricultural activity has generated a progressive amount of waste, which needs a proper treatment to avoid negative environmental impacts. At the same time, values can be added to such waste, as its use in animal feed. This research was conducted at the laboratory of Animal Nutrition, State University of Southwestern Bahia, campuses of Vitória da Conquista and Itapetinga. The objective of this study was to evaluate the effect of coffee husks on ruminant feeds by increasing doses of fibrolytic enzymes, evaluating their effects on in vitro ruminal degradability of dry matter (DM), neutral detergent fiber (NDF), and acid detergent fiber (FDA) of the coffee husk (CH). The experiment was a completely randomized design in a 2x4 factorial scheme. It compounded the following treatments: Coffee husk (CH1): 1.5% enzymes (E) and 24 h enzymatic action (EA); CH2: 3.0% (E) and 24h (EA); CH3: 4.5% (E) and 24 h (EA); CH4: 6% (E) and 24 h (EA); CH5: 1.5% (E) 48 h (EA); CH6: 3% (E) and 48h (EA); CH7: 4.5% (E) and 48h (EA); and CH8: 6% (E) and 48 h (EA), all based on dry matter. An improvement in the degradability of the nutritional parameters MS, NDF, and FDA occurred with the addition of enzymes, with 3% enzyme addition being the best level, and 24 hours, as the best action time. In addition to that, as the EA on coffee husk increased, the degradation rate decreased. Therefore, the use of e

A atividade agrícola tem gerado uma quantidade progressiva de resíduos, os quais necessitam serem tratados de forma adequada para que não promovam impactos ambientais negativos e que, ao mesmo tempo, sejam agregados valores a estes para que possam ser utilizados na alimentação animal. A pesquisa foi conduzida no laboratório de Nutrição Animal da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus de Vitória da Conquista e Itapetinga. Objetivou-se o aproveitamento da casca de café na alimentação de ruminantes através do tratamento com doses crescentes de enzimas fibrolíticas avaliando seus efeitos sobre a degradabilidade ruminal in vitro da matéria seca (MS), fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) da casca de café (CC). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado, com esquema fatorial 2x4, constituindo os seguintes tratamentos Casca de café (CC1): 1,5% de Enzimas (E) e 24h de Ação Enzimática (AE); CC2: 3% (E) e 24h (AE); CC3: 4,5%(E) e 24 h(AE); CC4:6 % (E) e 24 h(AE); CC5: 1,5% (E) 48 h(AE); CC6: 3% (E) e 48h(AE); CC7:4,5% (E) e 48h(AE); CC8: 6% (E) e 48 h(AE), com base na matéria seca. Constatou-se que com adição de enzimas, ocorreu uma melhora na degradabilidade dos parâmetros nutricionais MS, FDN e FDA, sendo 3% de enzimas o melhor nível e 24 horas o melhor tempo de ação. Além disso, à medida que a ação enzimática na casca de

In vitro degradability of coffee husks treated with doses of fibrolytic enzymes for use in ruminant nutrition / Avaliação da degradabilidade in vitro da casca de café tratada com doses de enzimas fibrolíticas para aproveitamento na alimentação de ruminantes

The agricultural activity has generated a progressive amount of waste, which needs a proper treatment to avoid negative environmental impacts. At the same time, values can be added to such waste, as its use in animal feed. This research was conducted at the laboratory of Animal Nutrition, State University of Southwestern Bahia, campuses of Vitória da Conquista and Itapetinga. The objective of this study was to evaluate the effect of coffee husks on ruminant feeds by increasing doses of fibrolytic enzymes, evaluating their effects on in vitro ruminal degradability of dry matter (DM), neutral detergent fiber (NDF), and acid detergent fiber (FDA) of the coffee husk (CH). The experiment was a completely randomized design in a 2x4 factorial scheme. It compounded the following treatments: Coffee husk (CH1): 1.5% enzymes (E) and 24 h enzymatic action (EA); CH2: 3.0% (E) and 24h (EA); CH3: 4.5% (E) and 24 h (EA); CH4: 6% (E) and 24 h (EA); CH5: 1.5% (E) 48 h (EA); CH6: 3% (E) and 48h (EA); CH7: 4.5% (E) and 48h (EA); and CH8: 6% (E) and 48 h (EA), all based on dry matter. An improvement in the degradability of the nutritional parameters MS, NDF, and FDA occurred with the addition of enzymes, with 3% enzyme addition being the best level, and 24 hours, as the best action time. In addition to that, as the EA on coffee husk increased, the degradation rate decreased. Therefore, the use of e

A atividade agrícola tem gerado uma quantidade progressiva de resíduos, os quais necessitam serem tratados de forma adequada para que não promovam impactos ambientais negativos e que, ao mesmo tempo, sejam agregados valores a estes para que possam ser utilizados na alimentação animal. A pesquisa foi conduzida no laboratório de Nutrição Animal da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus de Vitória da Conquista e Itapetinga. Objetivou-se o aproveitamento da casca de café na alimentação de ruminantes através do tratamento com doses crescentes de enzimas fibrolíticas avaliando seus efeitos sobre a degradabilidade ruminal in vitro da matéria seca (MS), fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) da casca de café (CC). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado, com esquema fatorial 2x4, constituindo os seguintes tratamentos Casca de café (CC1): 1,5% de Enzimas (E) e 24h de Ação Enzimática (AE); CC2: 3% (E) e 24h (AE); CC3: 4,5%(E) e 24 h(AE); CC4:6 % (E) e 24 h(AE); CC5: 1,5% (E) 48 h(AE); CC6: 3% (E) e 48h(AE); CC7:4,5% (E) e 48h(AE); CC8: 6% (E) e 48 h(AE), com base na matéria seca. Constatou-se que com adição de enzimas, ocorreu uma melhora na degradabilidade dos parâmetros nutricionais MS, FDN e FDA, sendo 3% de enzimas o melhor nível e 24 horas o melhor tempo de ação. Além disso, à medida que a ação enzimática na casca de

Cloning and expression of cellulase XF-818 of Xylella fastidiosa in Escherichia Coli

Xylella fastidiosa's genome was the first of a plant pathogen to be completely sequenced. Through comparative sequence analysis many genes were identified and, among them, several potentially involved in plant-pathogen interaction. However, the biological role of each gene should be assigned experimentally. On this regard, heterologous protein expression is a powerful tool to produce proteins from such genes, allowing their characterization. X. fastidiosa lives inside xylem vessels and eventually would degrade pit membranes from xylem cells to move radialy into the host. The identification of several putative plant cell wall degrading enzymes on X. fastidiosa genome prompted the assession of the function of such proteins. The open reading frame (ORF) Xf-818 was cloned into expression vector pET20b and E. coli cells harboring such plasmid exhibited cellulase activity. Using IPTG at 0.4 mmol L-1 with a 12 h incubation at 32°C are the best conditions to produce higher amounts of heterologous protein. The enzyme degrades cellulose confirming the endoglucanase activity of Xf-818.

Xylella fastidiosa foi a primeira bactéria fitopatogênica que teve seu genoma completamente seqüenciado. A identificação de diversos genes, através de similaridade de seqüências, indicou os possíveis mecanismos de patogenicidade da bactéria. Entretanto, a determinação da função de um gene requer a confirmação experimental e, neste aspecto, a expressão heteróloga é uma poderosa ferramenta. X. fastidiosa coloniza somente o xilema das plantas hospedeiras e a identificação putativa de diversos genes semelhantes a enzimas que degradam a parede celular vegetal, estimularam o presente estudo de catacterização destas enzimas. A clonagem da ORF Xf-818 de X. fastidiosa no vetor de expressão pET20b possibilitou a produção da proteína heterologamente em E. coli. O emprego de IPTG a 0,4 mmol L-1 com 12 h a 32°C, possibilitou as melhores condições para E. coli produzir a proteína heteróloga. Clones de E. coli que expressam Xf-818, apresentam atividade celulásica, degradando eficientemente a celulose. A identificação de Xf-818 como uma endoglicanase foi assim confirmada.

Cellulase and xylanase productions by isolated Amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-state cultivation

In Brazil, a large amount of a fibrous residue is generated as result of soybean (Glycine max) protein production. This material, which is rich in hemicellulose and cellulose, can be used in solid state cultivations for the production of valuable metabolites and enzymes. In this work, we studied the bioconversion of this residue by bacteria strains isolated from water and soil collected in the Amazon region. Five strains among 87 isolated bacteria selected for their ability to produce either celullases or xylanases were cultivated on the aforementioned residue. From strain BL62, identified as Bacillus subtilis, it was obtained a preparation showing the highest specific cellulase activity, 1.08 UI/mg protein within 24 hours of growth. Concerning xylanase, the isolate BL53, also identified as Bacillus subtilis, showed the highest specific activity for this enzyme, 5.19 UI/mg protein within 72 hours of cultivation. It has also been observed the production of proteases that were associated with the loss of cellulase and xylanase activities. These results indicated that the selected microorganisms, and the cultivation process, have great biotechnological potential.

No Brasil, uma grande quantidade de resíduos fibrosos de soja (Glycine max) são gerados no processo de produção de proteína de soja. Estes materiais, ricos em celulose e hemicelulose, podem ser usados como substratos para cultivos microbianos visando a produção de valiosos metabólitos e enzimas. Neste trabalho, estudou-se a produção de enzimas, utilizando estes resíduos, por bactérias isoladas da água e do solo da região amazônica. Cinco cepas, dentre 87 iniciais, foram selecionadas e crescidas em cultivo semi-sólido (CSS). Preparações obtidas do isolado BL 62, identificado como Bacillus subtilis, apresentaram a maior atividade específica para celulase, 1,08 UI/ mg de proteína, em 24 horas de cultivo. No que se refere às xilanases, preparações obtidas do isolado BL 53, também identificado como Bacillus subtilis, apresentaram a maior atividade específica para esta enzima, com um valor de 5,19 UI/ mg de proteína, em 72 horas de cultivo. Também foi demonstrada a produção simultânea de proteases, o que pode ser associado à perda das atividades de celulase e xilanase durante o cultivo. Os resultados indicam que os microrganismos selecionados e o processo de cultivo empregado utilizando resíduo da soja apresentam grande potencial biotecnológico.