INFLUÊNCIA DE DUAS CONCENTRAÇÕES DE NOREPINEFRIA DE ACIDIFICAÇÃO NO CRESCIMENTO E ADESÃO DE SALMONELLA HEIDELBERG DE ORIGEM AVÍCOLA

Salmonella spp. é um dos principais patógenos responsáveis por doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo. Comunidades bacterianas usam o sistema de quorum sensing para controlar a formação de biofilme. O quorum sensing caracteriza-se por ser um sistema de comunicação intra e interespécies de microrganismos, baseado na emissão de estímulos e respostas dependentes da densidade populacional. Trata-se de um mecanismo de sinalização célula-a-célula envolvendo a produção, liberação e detecção de compostos semelhantes a hormônios chamados de auto-indutores. A norepinefrina utilizada pelos animais utilizam a mesma sinalização bacteriana dos auto-indutores 3 que servem como um sinal de quorum sensing. Situações estressantes como a superlotação, depreciação nutricional e condições inadequadas dos aviários, fazem com que ocorra um aumento do risco de doenças infecciosas, modificando a gravidade da infecção por Salmonella. O estresse ácido é um desafio encontrado por microrganismos no ambiente de processamento de alimentos e no trato gastrointestinal dos hospedeiros. Para alcançar o intestino, colonizar e invadir os tecidos, as células patogênicas de Salmonella devem sofrer à barreira ácida do estômago, sendo por esta razão, a adaptação ácida uma característica no processo da infecção. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência duas concentrações de norepinefrina (100 µM e 250 µM) e meio acidificado (pH 3,0) no crescimento e na adesão de cepas de Salmonella Heidelberg isoladas de fontes avícolas a 12ºC e 25ºC. Além disso, três genes associados ao processo de formação de biofilme foram detectados (adrA, csgD e sidA). Para os ensaios de crescimento e adesão usou-se ensaio de microplaca de poliestireno. A PCR foi utilizada na detecção de genes de virulência associados à produção de biofilme. Dentre os resultados encontrados, com relação a indução ácida, a Salmonella Heidelberg teve um menor crescimento em indução ácida, sendo isto esperado pois um bom número delas não consegue sobreviver. Diferente da adesão, em que a indução ácida teve uma maior formação de biofilme em ambas as temperaturas 12ºC e 25ºC. Houve diferença na adesão quando as bactérias foram tratadas com norepinefrina nas temperaturas 12ºC e 25ºC para a concentração de 250 µM. Em relação à adesão bacteriana, não se observou influência do estímulo da catecolamina nas cepas de Salmonella Heidelberg, independentemente da concentração utilizada, para temperaturas de incubação de 12ºC e 25ºC. O emprego de meio acidificado resultou em um aumento significativo da adesão das cepas Salmonella Heidelberg em ambas as temperaturas testadas. Os genes (adrA, csgD e sidA) para as cepas analisadas, com alta frequência de detecção dos genes adrA e sidA, sendo superior à frequência do gene csgD, presente em 50% das cepas avaliadas. A estimulação de cepas de S. Heidelberg com noradrenalina não resultou aumento do crescimento ou maior adesão bacteriana. No entanto, o meio acidificado favoreceu o processo de formação do biofilme.

Salmonella spp. is one of the leading pathogens responsible for foodborne illness worldwide. Bacterial communities use the quorum sensing system to control biofilm formation. The quorum sensing is characterized by being an intra and interspecies communication system of microorganisms, based on the emission of stimuli and responses dependent on the population density. It is a cell-to-cell signaling mechanism involving the production, release and detection of hormone-like compounds called self-inducers. Norepinephrine used by animals uses the same bacterial signaling of auto-inducers 3 that serve as a quorum sensing signal. Stressful situations such as overcrowding, nutritional depreciation and inadequate poultry conditions lead to an increased risk of infectious diseases, modifying the severity of Salmonella infection. Acid stress is a challenge found by microorganisms in the food processing environment and in the gastrointestinal tract of hosts. To reach the intestine, colonize and invade the tissues, the pathogenic cells of Salmonella must undergo the acidic barrier of the stomach, being for this reason, the acid adaptation a characteristic in the process of the infection. The objective of this study was to evaluate the influence of two concentrations of norepinephrine (100 M and 250 M) and acidification (pH 3.0) of the medium on the growth and adhesion of Salmonella Heidelberg strains isolated from poultry sources at 12ºC and 25ºC. Furthermore, three genes associated with the biofilm formation process were detected (adrA, csgD, and sidA). For growth and adhesion assays, a polystyrene microplate assay was used. PCR was used in the detection of virulence genes associated with biofilm production. Among the results found, with respect to acid induction, Salmonella Heidelberg had a lower growth in acid induction, this being expected since a good number of them can not survive. Different from adhesion, in which the acid induction had a higher biofilm formation at both temperatures 12ºC and 25ºC. There was a difference in adhesion when the bacteria were treated with norepinephrine at temperatures 12ºC and 25ºC for the concentration of 250 M. Regarding bacterial adhesion, there was no influence of the catecholamine stimulus on Salmonella Heidelberg strains, regardless of the concentration used, for incubation temperatures of 12ºC and 25ºC. The use of acidified medium resulted in a significant increase in the adhesion of Salmonella Heidelberg strains at both temperatures tested. The genes (adrA, csgD and sidA) for the strains analyzed, with a high detection frequency of the adrA and sidA genes, were higher than the frequency of the csgD gene present in 50% of the strains evaluated. Stimulation of S. Heidelberg and noradrenaline strains did not result in increased growth or increased bacterial adhesion. However, the acidified medium favored the process of biofilm formation.

INFLUÊNCIA DAS CATECOLAMINAS NOREPINEFRINA E EPINEFRINA NA FORMAÇÃO DE BIOFILME EM ISOLADOS DE Salmonella ENTERITIDIS

A sanidade das aves, a inocuidade dos alimentos e a tecnologia de produção são grandes atributos do sistema de produção da cadeia avícola brasileira. No intenso processo de criação das aves, o aumento da excreção de patógenos como Salmonella, tem sido relacionado com o estresse associado à interação social, à manipulação e ao transporte das aves até a linha de abate. Situações de estresse ocasionam a liberação de hormônios como as catecolaminas (epinefrina e norepinefrina) que podem interferir na microbiota pela sinalização das bactérias do trato gastrointestinal. A epinefrina e a norepinefrina produzidas pelos animais utilizam a mesma via de sinalização bacteriana denominados de Auto-indutores Tipo 3. Esses auto-indutores regulam uma gama de atividades como a simbiose, a virulência, a competência, a conjugação, a motilidade, a esporulação e formação de biofilmes. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito das catecolaminas epinefrina e norepinefrina como indutores na formação de biofilmes em 30 isolados de Salmonella Enteritidis provenientes de produtos avícolas e de produtos envolvidos em surtos de salmonelose em humanos e também avaliar a presença dos genes associados na formação de biofilme csgD, adrA e fimA. As cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas foram isoladas de pintos de um dia, carne de frango, suabe de arrasto e surtos de salmonelose. Foram testadas duas concentrações de epinefrina e norepinefrina (50µM e 100µM) e duas temperaturas de incubação: 12°C (temperatura da sala de cortes) e a 25°C (temperatura ambiente). O ensaio de formação de biofilme foi feito em placas de poliestireno pela metodologia de coloração de cristal violeta. Dentre os resultados encontrados, cepas incubadas a 25°C apresentaram maior formação de biofilme quando comparadas àquelas incubadas a 12°C. A norepinefrina na concentração de 100 µM estimulou a formação de biofilme por cepas de Salmonella Enteritidis quando incubadas a temperatura de 12°C. Não houve interferência das catecolaminas (epinefrina e norepinefrina) nos ensaios de formação de biofilme a temperatura de 25°C nas concentrações utilizadas e todas as cepas avaliadas no presente trabalho apresentaram os três genes (csgD, adrA e fimA) associados a formação de biofilme pesquisados.

Poultry health, food safety and food production technology are major attributes from the Brazilian poultry chain. Stress associated with poultry transport or mixing has long been correlated with enhanced faecal excretion of diarrheal zoonotic pathogens in animals such as Salmonella enterica. Stress situations release hormones (such catecholamines - epinephrine and norepinephrine) that can influence the microbiota by signaling the bacteria from the gastrointestinal tract, so they are able to initiate the multiplication process and the production of virulence factors as part of the process infectious diseases. Epinephrine and norepinephrine produced by the animals use the same pathway of the bacteria, called Auto Inducer Type 3. These auto-inducers regulate a range of activities such as symbiosis, virulence, competence, conjugation, motility, sporulation and biofilm formation. The Salmonella ability to makes complexes associated to surfaces, called biofilms, contributes to its persistence and resistance in both host and non-host environments and is especially important in environments used in food processing. The present paper evaluated the influence of catecholamines epinephrine and norepinephrine on the biofilm formation about 30 samples of Salmonella Enteritidis from poultry products and products involved in salmonellosis outbreaks and to evaluate the presence of associated genes in the biofilm formation (csgD, adrA and fimA). The strains of Salmonella Enteritidis used were isolated from day-old chicks, chicken meat, drag swabs and salmonellosis outbreaks. Two epinephrine and norepinephrine concentrations were used (50M and 100M) and two incubation temperatures were analyzed: 12°C (required by the Brazilian sanitary service in cutting rooms of broiler processing plants) and 25°C (room temperature).The biofilm assay was done on polystyrene plates by violet crystal staining methodology. Samples incubated at 25°C produced higher biofilm formation them samples incubated at 12°C. The norepinephrine concentration of 100 M has stimulated the biofilm formation of Salmonella Enteritidis strains when incubated at 12°C. At 25°C, there was no catecholamine (epinephrine and norepinephrine) influence in the biofilm assay in the concentrations used. All the samples evaluated in the present study were positive for the genes csgD, adrA and fimA associated with biofilm formation investigated.

Effect of renal denervation procedure on left ventricular hypertrophy of hypertensive rats and its mechanisms / Efeito da denervação renal na hipertrofia do ventrículo esquerdo de ratos hipertensos e seu mecanismo

PURPOSE: To investigate the effect of renal denervation (RDN) on the blood pressure, left ventricular hypertrophy and myocardial expression of TLR4/NF-κB in spontaneously hypertensive rats (SHR). METHODS: A total of 36 SHR were randomly assigned into control group (D0), RDN group (D) and sham group (S). 12 WKY rats of same age served as controls (WKY group). Rats in the D0 and WKY groups were sacrificed, but rats in the D and S group were sacrificed at one week and six weeks after surgery. The heart was collected and the left ventricle weighted followed by calculation of left ventricular mass index (LVMI). RESULTS: In the D0 group, the blood pressure, LVMI and protein expression of TLR4, NF-κB, TNF-α and IL-6 in the myocardium were markedly higher than that in the WKY group (p<0.05). In the D1 and D2 group, the LVMI, NE and protein expression of TLR4, NF-κB, TNF-α and IL-6 in the myocardium were significantly reduced (p<0.05). CONCLUSION: Renal denervation can significantly delay the progression of left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats, which may be attributed to the not only the suppression of sympathetic activity and attenuation of pressure load but the improvement of myocardial immuno-inflammation.(AU)

OBJETIVO: Investigar o efeito da denervação renal na pressão sanguínea, na hipertrofia do ventrículo esquerdo e a expressão miocárdica de TLR4/NF-kB em ratos espontaneamente hipertensos. MÉTODOS: Trinta e seis SHR ratos foram aleatoriamente distribuídos em grupo controle, grupo denervação renal (D) e grupo sham(S). 12 WKY ratos de mesma idade serviram de controle. Os ratos controles foram sacrificados, mas os ratos com denervação renal e sham foram sacrificados uma semana e seis semanas após a cirurgia. O coração foi retirado e o ventrículo esquerdo pesado seguido pelo cálculo da massa ventricular (LVMI). RESULTADOS: No grupo DO, a pressão sanguínea, LVMI e a expressão proteica de TLR4, NF-κB, TNF-α e IL-6, no miocárdio foram marcadamente maiores do que o grupo WKY (p<0,05). Nos grupos D1 e D2, o LVMI, NE e a expressão proteica de TLR4, NF-κB, TNF-α e IL-6 no miocárdio foi significantemente reduzido (p<0,05). CONCLUSÃO: A denervação renal pode significantemente retardar a progressão da hipertrofia ventricular esquerda em ratos espontaneamente hipertensos, o que pode ser atribuído não apenas pela supressão da atividade simpática e atenuação da pressão, mas pela melhora na imunoinflamação miocárdica.(AU)

Identificação de uma comunicação bidirecional entre neurônios e macrófagos intestinais via receptores 2 adrenérgicos

O intestino apresenta a maior área do corpo exposta ao ambiente, recebendo constantemente antígenos provenientes da alimentação e de microrganismos. A fim de manter a homeostase, evitando respostas inflamatórias desnecessárias e ao mesmo tempo respondendo apropriadamente à possíveis ameaças ao tecido, as células intestinas tem que ser capazes de perceber e responder apropriadamente a uma diversa gama de perturbações vindas do ambiente. Além do seu vasto sistema imune o intestino também abriga o maior número de neurônios fora do sistema nervoso central, os quais compõe o Sistema Nervoso Entérico (SNE). O SNE é composto por aproximadamente 100 milhões de neurônios que são capazes de regular autonomamente diversas funções fisiológicas do intestino e também de receber e enviar sinais para os sistemas nervoso autônomo simpático e parassimpático. Diversas evidências clínicas correlacionam inflamações intestinais com alterações no SNE, demonstrando a importância de se entender melhor as relações neuroimunes presentes no intestino. Os macrófagos são células essências da imunidade inata que residem tanto na área do intestino conhecida como lâmina própria como também na área conhecida como muscularis. Essas células fagocíticas desempenham um importante papel nas respostas antibacterianas e também na manutenção da homeostase do tecido, sendo capazes de adaptar rapidamente sua fisiologia em resposta aos sinais ambientais. Neste trabalho avaliamos a existência de uma comunicação bidirecional entre macrófagos e neurônios intestinais. Caracterizamos as duas populações de macrófagos presentes no intestino em homeostase e após um estimulo com SpiB um mutante de Salmonella, avaliando assim como estas células respondem à sinais de infecção provenientes do lúmen intestinal. Utilizando abordagens in vivo e in vitro, observamos que os macrófagos presentes na região da muscularis respondem rapidamente a uma possível infecção presente no lúmen regulando positivamente genes de proteção tecidual e reparo de danos, como Arg1 e Chi3l3. Nossos resultados indicam ainda que são os neurônios através da liberação de norepinefrina capaz de ativar os receptores 2 adrenérgicos presentes nos macrófagos intestinais que induzem a expressão dos genes relacionados com a proteção tecidual e reparo de danos. Observamos ainda que esta via induzida através da ativação dos receptores 2 adrenérgicos parece conferir também aos macrófagos um papel neuro-protetor em caso de danos teciduais. Em conjunto nossos resultados indicam a presença de uma comunicação neuroimune bidirecional entre os neurônios e macrófagos intestinais capaz de modular a resposta dos macrófagos a uma infecção entérica e de proteger os neurônios em caso de danos teciduais.

The intestine is the largest area of the body exposed to the environment, which receives food and microbe antigens. In order to maintain homeostasis, avoiding unnecessary inflammation, and at the same time responding properly to potential treats to the tissue, intestinal cells must be able to sense and respond properly to this diverse set of environmental perturbations. In addition to a vast immune system, the intestine also harbors the largest collection of neurons outside the central nervous system, which constitute the enteric nervous system (ENS). The ENS is composed of approximately 100 million neurons that are capable of regulating the physiological functions of the gut autonomously and also receive input and send signals to the sympathetic and parasympathetic nervous system. Numerous clinical findings correlate gut inflammation with abnormalities in the ENS, revealing the importance of a better understanding of the neuro-immune interactions at this site. Macrophages comprise an essential innate immune cell residing both in the intestinal lamina propria and muscularis regions. These phagocytic cells play important roles in anti-microbial responses but also in tissue homeostasis, being able to quickly adapt their physiology in response to environmental cues. We evaluated the crosstalk between intestinal macrophages and surrounding enteric neurons, characterizing how these cells respond to possible infection in the intestinal lumen. Using in vivo and in vitro approaches, we found that macrophages in the intestinal muscularis quickly respond to a possible distal luminal infection, up regulating tissue-protective and wound repair genes, like Arg1 and Chi3l3. Also, our results indicate that the neurons trough norepinephrine release and subsequent activation of the 2 adrenergic receptor present on the intestinal macrophages are the ones up regulating tissue-protective and wound repair genes. We also observed that this pathway, trough the 2 adrenergic receptor activation seems to induce a neuro-protective role to these macrophages under tissue damage scenarios. All together our results indicate that a neuro-immune crosstalk between neurons and macrophages modulates macrophages response towards enteric infections and confers neuro-protection in case of tissue damage.