Evaluation of recombinant Cryptosporidium hominis GP60 protein and anti-GP60 chicken polyclonal IgY for research and diagnostic purposes / Avaliação da proteína recombinante GP60 de Cryptosporidium hominis e da IgY policlonal anti-GP60 recombinante para uso em pesquisa e diagnóstico

In this study, a method for expressing Cryptosporidium hominis GP60 glycoprotein in Escherichia coli for production of polyclonal anti-GP60 IgY in chickens was developed aiming future studies concerning the diagnosis, prevention and treatment of cryptosporidiosis. The full-length nucleotide sequence of the C. hominis gp60 gene was codon-optimized for expression in E. coli and was synthesized in pET28-a vector. Subcloning was performed on several different strains of BL21 E. coli. Temperature, time and inducer IPTG concentration assays were also performed and analyzed using SDS-PAGE. The optimal conditions were observed at a temperature of 37 °C, with overnight incubation and 1 mM of IPTG. Purification was performed by means of affinity chromatography using the AKTA Pure chromatography system and the Hi-Trap HP column (GE Healthcare). The recombinant protein GP60 (rGP60) thus generated was used to immunize laying hens owing the production of polyclonal IgY. Western blot and indirect immunofluorescence showed that the polyclonal antibody was capable of binding to rGP60 and to Cryptosporidium parvum sporozoites, respectively. The rGP60 and the IgY anti-rGP60 generated in this study may be used as templates for research and for the development of diagnostic methods for cryptosporidiosis.(AU)

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de expressão da glicoproteína GP60 de Cryptosporidium hominis em Escherichia coli visando produzir anticorpos IgY anti-GP60 em galinhas para utilização em estudos futuros com os objetivos de diagnóstico, prevenção e tratamento da criptosporidiose. A sequência completa de nucleotídeos do gene gp60 de C. hominis foi códon-otimizada para expressão em E. coli e sintetizada no vetor pET28-a. A subclonagem foi realizada em várias estirpes diferentes de E. coli BL21. Os ensaios de concentração do indutor IPTG, temperatura e tempo foram realizados e analisados por SDS-PAGE. As condições ótimas de expressão foram observadas em temperatura de 37 °C, incubação durante a noite e 1 mM de IPTG. A purificação da proteína foi realizada por cromatografia de afinidade utilizando o sistema de cromatografia AKTA Pure e a coluna Hi-Trap HP (GE Healthcare). A proteína recombinante GP60 (rGP60) foi utilizada para imunizar galinhas poedeiras para produzir IgY policlonal anti-rGP60. Verificou-se por Western blot e por imunofluorescência indireta que o anticorpo policlonal apresentou reatividade com a rGP60 e com esporozoítos de Cryptosporidium parvum, respectivamente. A rGP60 e a IgY anti-rGP60 geradas neste estudo podem ser utilizadas como modelos para o desenvolvimento de ensaios para pesquisa e diagnóstico da criptosporidiose.(AU)

Fish and seafood qualitative analysis using anti-histamine polyclonal antibodies / Produção de anticorpos policlonais contra histamina para análises qualitativas de peixes e frutos do mar

This paper had the objective to produce polyclonal antibodies against histamine, which is a biogenic amine produced by the histidin aminoacid decarboxilation. The qualitative analysis of histamine in commercialized fish and seafood is very important for human health, once the histamine presence is followed by cadaverine, spermidine and putrescine, all produced during the post-mortem process. Polyclonal antibodies were raised against histamine and used in PTA-ELISA tests (“plate trapped antigen – enzyme linked immunosorbent assay”) to evaluate the presence of histamine in frozen fish (“pescada”, cat fish, sardines, salmon, “manjuba”, tilapia fillets) and for seafood ( shrimp and common squid) during storage process. The antibodies showed sensibility up to 1 ng of histamine per gram of samples. Histamine appears as picks during the 50 hours of analysis, for the fish and seafood samples, maintained on the top of crushed ice. Bacterial growth was also determined, being identified 14 species transforming aminoacids on the samples surface during the process of analysis. ELISA showed to be an efficient and sensible test for the hitamine presence.

Este trabalho teve por objetivo a produção de anticorpos policlonais contra histamina, que é uma amina biogênica produzida pela decarboxilação do aminoácido histidina. A análise qualitativa e quantitativa da histamina em peixes e frutos do mar comercializados torna-se importante devido ao fato desta ser tóxica ao organismo humano quando coexistente com as aminas biogênicas cadaverina e putrescina, também produzidas por decarboxilação de aminoácidos no processo pós-mortem. Os anticorpos policlonais produzidos foram utilizados em ensaios do tipo PTA-ELISA (“plate trapped antigen – enzyme linked immunosorbent assay”) para avaliação da presença de histamina em peixes (pescada, tilápia, manjuba, sardinha, salmão e pintado) e em frutos do mar (lula e camarão) durante o processo de armazenamento. Os anticorpos mostraram sensibilidade na detecção de 1 ng de histamina por grama de amostra analisada. A histamina apresentou picos de liberação nos diferentes materiais analisados por 50 horas, mantidos sobre o gelo e foi também verificada a presença de 14 bactérias contaminando e degradando aminoácidos na superfície das amostras, ao longo do teste. O ELISA se mostrou bastante eficiente e sensível para determinação da presença de histamina nos alimentos.

Fish and seafood qualitative analysis using anti-histamine polyclonal antibodies / Produção de anticorpos policlonais contra histamina para análises qualitativas de peixes e frutos do mar

This paper had the objective to produce polyclonal antibodies against histamine, which is a biogenic amine produced by the histidin aminoacid decarboxilation. The qualitative analysis of histamine in commercialized fish and seafood is very important for human health, once the histamine presence is followed by cadaverine, spermidine and putrescine, all produced during the post-mortem process. Polyclonal antibodies were raised against histamine and used in PTA-ELISA tests (“plate trapped antigen enzyme linked immunosorbent assay”) to evaluate the presence of histamine in frozen fish (“pescada”, cat fish, sardines, salmon, “manjuba”, tilapia fillets) and for seafood ( shrimp and common squid) during storage process. The antibodies showed sensibility up to 1 ng of histamine per gram of samples. Histamine appears as picks during the 50 hours of analysis, for the fish and seafood samples, maintained on the top of crushed ice. Bacterial growth was also determined, being identified 14 species transforming aminoacids on the samples surface during the process of analysis. ELISA showed to be an efficient and sensible test for the hitamine presence.

Este trabalho teve por objetivo a produção de anticorpos policlonais contra histamina, que é uma amina biogênica produzida pela decarboxilação do aminoácido histidina. A análise qualitativa e quantitativa da histamina em peixes e frutos do mar comercializados torna-se importante devido ao fato desta ser tóxica ao organismo humano quando coexistente com as aminas biogênicas cadaverina e putrescina, também produzidas por decarboxilação de aminoácidos no processo pós-mortem. Os anticorpos policlonais produzidos foram utilizados em ensaios do tipo PTA-ELISA (“plate trapped antigen enzyme linked immunosorbent assay”) para avaliação da presença de histamina em peixes (pescada, tilápia, manjuba, sardinha, salmão e pintado) e em frutos do mar (lula e camarão) durante o processo de armazenamento. Os anticorpos mostraram sensibilidade na detecção de 1 ng de histamina por grama de amostra analisada. A histamina apresentou picos de liberação nos diferentes materiais analisados por 50 horas, mantidos sobre o gelo e foi também verificada a presença de 14 bactérias contaminando e degradando aminoácidos na superfície das amostras, ao longo do teste. O ELISA se mostrou bastante eficiente e sensível para determinação da presença de histamina nos alimentos.

Polyclonal anti-intimin antibody: immunological characterization and its use in EPEC and EHEC diagnosis

Intimins are outer membrane proteins expressed by enteric bacterial pathogens capable of inducing intestinal attachment-and-effacement lesion (A/E). Through immunoblotting, immunofluorescence, flow citometry and immunogold we observed that the obtained polyclonal antibody against conserved intimin region recognizes the different intimin subtypes and suggests that it can be used as a tool for EPEC and EHEC detection. Besides, immuno-dot assay seems to be a possible alternative as a capture method.

EPEC e EHEC constituem um risco significativo para a saúde pública em diferentes partes do mundo. Ambas colonizam a mucosa intestinal e subvertem as funções celulares do epitélio intestinal ao produzirem uma lesão histopatológica característica, conhecida por lesão A/E (attaching-and-effacing), na qual a intimina é uma das proteínas envolvidas. A família das intiminas apresenta também uma região conservada, que compreende os aminoácidos de 388 a 667 (Int 388-667). O objetivo do presente trabalho foi a obtenção de um anticorpo policlonal contra a região conservada de intimina. A caracterização fenotípica das amostras de EPEC e EHEC utilizando este anticorpo permitiu observar-se a maneira variável que ele reconhece os diversos subtipos de intimina e sugere que ele seja uma ferramenta para detecção destes patógenos, sendo o ensaio de immuno-dot o método de captura de escolha.

Polyclonal anti-intimin antibody: immunological characterization and its use in EPEC and EHEC diagnosis

Intimins are outer membrane proteins expressed by enteric bacterial pathogens capable of inducing intestinal attachment-and-effacement lesion (A/E). Through immunoblotting, immunofluorescence, flow citometry and immunogold we observed that the obtained polyclonal antibody against conserved intimin region recognizes the different intimin subtypes and suggests that it can be used as a tool for EPEC and EHEC detection. Besides, immuno-dot assay seems to be a possible alternative as a capture method.

EPEC e EHEC constituem um risco significativo para a saúde pública em diferentes partes do mundo. Ambas colonizam a mucosa intestinal e subvertem as funções celulares do epitélio intestinal ao produzirem uma lesão histopatológica característica, conhecida por lesão A/E (attaching-and-effacing), na qual a intimina é uma das proteínas envolvidas. A família das intiminas apresenta também uma região conservada, que compreende os aminoácidos de 388 a 667 (Int 388-667). O objetivo do presente trabalho foi a obtenção de um anticorpo policlonal contra a região conservada de intimina. A caracterização fenotípica das amostras de EPEC e EHEC utilizando este anticorpo permitiu observar-se a maneira variável que ele reconhece os diversos subtipos de intimina e sugere que ele seja uma ferramenta para detecção destes patógenos, sendo o ensaio de immuno-dot o método de captura de escolha.

Polyclonal anti-intimin antibody: immunological characterization and its use in EPEC and EHEC diagnosis

Intimins are outer membrane proteins expressed by enteric bacterial pathogens capable of inducing intestinal attachment-and-effacement lesion (A/E). Through immunoblotting, immunofluorescence, flow citometry and immunogold we observed that the obtained polyclonal antibody against conserved intimin region recognizes the different intimin subtypes and suggests that it can be used as a tool for EPEC and EHEC detection. Besides, immuno-dot assay seems to be a possible alternative as a capture method.

EPEC e EHEC constituem um risco significativo para a saúde pública em diferentes partes do mundo. Ambas colonizam a mucosa intestinal e subvertem as funções celulares do epitélio intestinal ao produzirem uma lesão histopatológica característica, conhecida por lesão A/E (attaching-and-effacing), na qual a intimina é uma das proteínas envolvidas. A família das intiminas apresenta também uma região conservada, que compreende os aminoácidos de 388 a 667 (Int 388-667). O objetivo do presente trabalho foi a obtenção de um anticorpo policlonal contra a região conservada de intimina. A caracterização fenotípica das amostras de EPEC e EHEC utilizando este anticorpo permitiu observar-se a maneira variável que ele reconhece os diversos subtipos de intimina e sugere que ele seja uma ferramenta para detecção destes patógenos, sendo o ensaio de immuno-dot o método de captura de escolha.

Capture immunoassay for LT detection produced by enterotoxigenic Escherichia coli in bacterial isolates

A capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which detects LT-I toxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli strains, has beendeveloped. This capture assay was performed using the IgG enriched fraction of anti-LT-I antiserum and IgG2b anti-LT-I monoclonal antibody and allowed a clear distinction between E. coli LT-I - producing and non-producing strains. The estimated accuracy of the assay is 78% for sensitivity, 94% for specificity and 92% for efficiency. Thus, the capture immunoassayis a sensitive tool for detection of E. coli, which produces heat-labile enterotoxin, and is suitable for use in clinical laboratories and epidemiological surveys in developing world.

O objetivo do presente trabalho foi a padronização de um imunoensaio de captura para detecção de amostras de E. coli produtoras da toxina LT-I. Este ensaio de captura foi desenvolvido utilizando-se a fração enriquecida em IgG do anticorpo policlonal anti-LT e um anticorpo monoclonal caracterizado como IgG2b. Através deste método verificou-se uma clara distinção entre cepas de E. coli produtoras e não produtoras da toxina (p 0,0001), sendo a sensibilidade do método de 78%, a especificidade de 94% e a eficiência de 92%. Assim, o imunoensaio de captura mostrou-se como uma ferramenta sensível para a detecção de amostras de E. coli que produzem a enterotoxina termo-lábil, podendo ser aplicado em laboratórios clínicos e inquéritos epidemiológicos em paises em desenvolvimento.

Capture immunoassay for LT detection produced by enterotoxigenic Escherichia coli in bacterial isolates

A capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which detects LT-I toxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli strains, has beendeveloped. This capture assay was performed using the IgG enriched fraction of anti-LT-I antiserum and IgG2b anti-LT-I monoclonal antibody and allowed a clear distinction between E. coli LT-I - producing and non-producing strains. The estimated accuracy of the assay is 78% for sensitivity, 94% for specificity and 92% for efficiency. Thus, the capture immunoassayis a sensitive tool for detection of E. coli, which produces heat-labile enterotoxin, and is suitable for use in clinical laboratories and epidemiological surveys in developing world.

O objetivo do presente trabalho foi a padronização de um imunoensaio de captura para detecção de amostras de E. coli produtoras da toxina LT-I. Este ensaio de captura foi desenvolvido utilizando-se a fração enriquecida em IgG do anticorpo policlonal anti-LT e um anticorpo monoclonal caracterizado como IgG2b. Através deste método verificou-se uma clara distinção entre cepas de E. coli produtoras e não produtoras da toxina (p 0,0001), sendo a sensibilidade do método de 78%, a especificidade de 94% e a eficiência de 92%. Assim, o imunoensaio de captura mostrou-se como uma ferramenta sensível para a detecção de amostras de E. coli que produzem a enterotoxina termo-lábil, podendo ser aplicado em laboratórios clínicos e inquéritos epidemiológicos em paises em desenvolvimento.

Capture immunoassay for LT detection produced by enterotoxigenic Escherichia coli in bacterial isolates

A capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which detects LT-I toxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli strains, has beendeveloped. This capture assay was performed using the IgG enriched fraction of anti-LT-I antiserum and IgG2b anti-LT-I monoclonal antibody and allowed a clear distinction between E. coli LT-I - producing and non-producing strains. The estimated accuracy of the assay is 78% for sensitivity, 94% for specificity and 92% for efficiency. Thus, the capture immunoassayis a sensitive tool for detection of E. coli, which produces heat-labile enterotoxin, and is suitable for use in clinical laboratories and epidemiological surveys in developing world.

O objetivo do presente trabalho foi a padronização de um imunoensaio de captura para detecção de amostras de E. coli produtoras da toxina LT-I. Este ensaio de captura foi desenvolvido utilizando-se a fração enriquecida em IgG do anticorpo policlonal anti-LT e um anticorpo monoclonal caracterizado como IgG2b. Através deste método verificou-se uma clara distinção entre cepas de E. coli produtoras e não produtoras da toxina (p 0,0001), sendo a sensibilidade do método de 78%, a especificidade de 94% e a eficiência de 92%. Assim, o imunoensaio de captura mostrou-se como uma ferramenta sensível para a detecção de amostras de E. coli que produzem a enterotoxina termo-lábil, podendo ser aplicado em laboratórios clínicos e inquéritos epidemiológicos em paises em desenvolvimento.