Resumo
Foram realizados dois experimentos com o objetivo de avaliar o desempenho, a hematologia e a bioquímica sérica, os problemas locomotores, o desenvolvimento ósseo e cartilaginoso e a metabolizabilidade de nutrientes de frangos de corte suplementados com glicosaminoglicanos na ração. O primeiro experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3 x 3 (três níveis de sulfato de condroitina: 0; 0,05; 0,10%; e três níveis de sulfato de glucosamina: 0; 0,15 e 0,30%), cada tratamento com seis repetições de 30 aves. Foram avaliadas as variáveis de desempenho, gait score, valgus e varus, hematologia e bioquímica sérica, rendimento de carcaça, degeneração femoral, discondroplasia tibial, macroscopia da tíbia e da cartilagem articular, densitometria e resistência óssea, perfil de minerais ósseo, número de condrócitos, proteoglicanos e colágeno tipo II na cartilagem articular da tíbia, e expressão gênica da metaloproteinase MMP-9 e seu inibidor na cartilagem articular do fêmur. A suplementação com sulfato de glucosamina aumentou o ganho de peso aos 35 e 42 dias de idade (p = 0,0470 e p = 0,0385, respectivamente). Os sulfatos de condroitina e de glucosamina reduziram a frequência de gait score (p = 0,0067 e p = 0,0001, respectivamente) e de valgus e varus (p = 0,0138 e p = 0,0002, respectivamente). O sulfato de glucosamina reduziu a frequência de degeneração femoral nos fêmures direito (p = 0,0139) e esquerdo (p < 0,0001) e aumentou linearmente (p = 0,0284) a área da cartilagem em proliferação. Observou-se interação (p < 0,05) dos sulfatos para leucócitos, linfócitos, triacilgliceróis, lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e cálcio total aos 21 dias; lipoproteína de alta densidade (HDL) e cálcio iônico aos 21 e 42 dias; e para fósforo, cloretos e sódio aos 42 dias. O sulfato de condroitina aumentou linearmente (p = 0,0099) a albumina, e de forma quadrática (p = 0,0140) as proteínas séricas totais aos 21 dias, e linearmente (p = 0,0012) o cálcio no sangue aos 42 dias. O sulfato de glucosamina reduziu linearmente (p = 0,0237) os cloretos aos 21 dias e demonstrou um efeito quadrático (p = 0,0450) para albumina aos 42 dias. Houve interação (p < 0,05) dos sulfatos para comprimento da tíbia aos 21 dias, largura da epífise proximal aos 21 e 42 dias e epífise distal aos 42 dias, espessura transversal e medial da cartilagem articular da epífise proximal aos 21 dias e da epífise distal aos 42 dias. Aos 42 dias, observou-se efeito quadrático do sulfato de glucosamina sobre o comprimento da tíbia (p = 0,0320) e linear crescente sobre o peso da cartilagem articular distal (p = 0,0322). Verificou-se maior porcentagem de cálcio (p = 0,0009) e fósforo (p = 0,0007) na tíbia aos 21 dias com a inclusão de sulfato de glucosamina, bem como interação (p < 0,0001) dos sulfatos para cálcio aos 42 dias. Houve interação (p < 0,05) dos sulfatos para número de condrócitos, colágeno tipo II e proteoglicanos aos 21 e 42 dias, e para a expressão gênica da MMP-9 e seu inibidor aos 42 dias. O segundo experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 2 (dois níveis de sulfato de condroitina: 0 e 0,10%; e dois níveis de sulfato de glucosamina: 0 e 0,30%), com oito repetições de 10 aves. Foram avaliados o desempenho, a metabolização dos nutrientes da ração e a histomorfometria intestinal. Aos 21 dias de idade, os frangos suplementados com sulfato de glucosamina apresentaram maior ganho de peso (p = 0,0229). Houve interação (p < 0,05) dos sulfatos para os coeficientes de metabolização de nitrogênio, de matéria mineral e de cálcio, e para a altura de vilo do jejuno. Conclui-se, que a suplementação com sulfato de glucosamina na ração aumentou o ganho de peso e estimulou a histomorfometria intestinal, e em conjunto com o sulfato de condroitina melhoraram a condição de locomoção e o desenvolvimento ósseo e cartilaginoso. Os sulfatos isoladamente promoveram maior metabolização de minerais.
Two experiments were carried out to evaluate performance, hematology and serum biochemistry, locomotor problems, bone and cartilage development, and nutrient metabolizability of broilers supplemented with glycosaminoglycans on ration. The first experiment was conducted in completely randomized design, in a 3 x 3 factorial scheme (three levels of chondroitin sulfate: 0, 0.05, 0.10%, and three levels of glucosamine sulfate: 0, 0.15 and 0.30%), each treatment with six replicates of 30 birds. It was evaluated variables of performance, gait score, valgus and varus, hematology and serum biochemistry, carcass yield, femoral degeneration, tibial dyschondroplasia, macroscopy of tibia and articular cartilage, bone densitometry and strength, bone mineral profile, chondrocyte number, proteoglycans and type II collagen detection tibia articular cartilage, and gene expression of MMP-9 metalloproteinase and its inhibitor in femur articular cartilage. Glucosamine sulfate supplementation increased weight gain at 35 and 42 days old (p = 0.0470 and p = 0.0385, respectively). Chondroitin and glucosamine sulfates reduced the frequency of gait score (p = 0.0067 and p = 0.0001, respectively), and valgus and varus (p = 0.0138 and p = 0.0002, respectively). Glucosamine sulfate reduced frequency of femoral degeneration in the right (p = 0.0139) and left (p < 0.0001) femurs and linearly increased (p = 0.0284) the proliferating cartilage area. Interaction (p < 0.05) was observed of sulfates for leukocytes, lymphocytes, triacylglycerols, very low density lipoprotein (VLDL) and total calcium at 21 days; high density lipoprotein (HDL) and ionic calcium at 21 and 42 days; and for phosphorus, chlorides and sodium at 42 days. Chondroitin sulfate increased linearly (p = 0.0099) albumin and quadratic (p = 0.0140) total serum proteins at 21 days, and linearly (p = 0.0012) calcium blood at 42 days. Glucosamine sulfate linearly reduced (p = 0.0237) the chlorides at 21 days and demonstrated a quadratic effect (p = 0.0450) for albumin at 42 days. There was interaction (p < 0.05) of sulfates for tibial length at 21 days, proximal epiphysis width at 21 and 42 days, and epiphysis distal at 42 days, transverse and medial thickness of articular cartilage of proximal epiphysis at 21 days, and distal epiphysis at 42 days. At 42 days, there was a quadratic effect of glucosamine sulfate levels on tibial length (p = 0.0320) and increasing linear on distal articular cartilage weight (p = 0.0322). There was a higher percentage of calcium (p = 0.0009) and phosphorus (p = 0.0007) on tibia at 21 days with inclusion of glucosamine sulfate, as well as interaction (p < 0.0001) of sulfates for calcium at 42 days. There was interaction (p < 0.05) of sulfates for chondrocytes number, collagen type II and proteoglycans at 21 and 42 days, and for MMP-9 genes expression and its inhibitor at 42 days. The second experiment was performed in completely randomized design, was used in a 2 x 2 factorial scheme (two levels of chondroitin sulfate: 0 and 0.10%, and two levels of glucosamine sulfate: 0 and 0.30%), with eight replicates of 10 birds. Performance, feed nutrient metabolization and intestinal histomorphometry were evaluated. At 21 days old, broilers supplemented with glucosamine sulfate presented greater weight gain (p = 0.0229). There was interaction (p < 0.05) of sulfates for the metabolic coefficients of nitrogen, mineral matter and calcium, and for jejunum villi height. It was concluded that supplementation with glucosamine sulfate in broiler ration increased weight gain and stimulated intestinal histomorphometry and together with the chondroitin sulfate improved the locomotion condition and the bony and cartilaginous development. Sulfates alone promoted greater metabolism of minerals.
Resumo
Avaliaram-se os efeitos dos precursores dos glicosaminoglicanos (GAG) e do sulfato de condroitina A (SC) sobre a histomorfometria da cartilagem articular normal ou de cartilagem de cães com doença articular degenerativa (DAD) experimental. Os grupos experimentais constituíram-se de animais com articulação direita normal, que não foi submetida a procedimento cirúrgico, e com articulação esquerda osteoartrótica e que foi submetida à intervenção cirúrgica. Os grupos foram subdivididos em animais com articulação não tratada e tratada, portanto: normais (N) (n=5), NGAG (n=5) e NSC (n=4); e osteoartróticos (O) (n=5), OGAG (n=5) e OSC (n=4). Secções de cartilagens do fêmur, da tíbia e da patela foram utilizadas neste estudo. Nos normais (N, NGAG e NSC), não se encontraram lesões que caracterizassem a DAD, embora tenha havido diminuição na celularidade nos de NGAG e NSC, em relação a N. Foram observadas alterações em graus variáveis entre os grupos osteoartróticos. Houve redução acentuada dos condrócitos no grupo O em comparação aos normais enquanto os grupos osteoartróticos tratados apresentaram celularidade semelhante aos normais tratados. Estes resultados foram confirmados pela análise do índice de proporção (IP), que se mostrou elevado em O, indicando menor síntese de proteoglicanos. Não houve diferença significativa entre os IPs dos grupos osteoartróticos tratados (OGAG, OSC) apesar do comportamento distinto do OSC ao assemelhar-se aos grupos N e NSC. Estes resultados sugeriram que o SC agiu na cartilagem osteoartrótica de maneira mais eficaz, reduzindo a perda de proteoglicanos e estimulando a viabilidade celular e a atividade metabólica.(AU)
The effects of precursors of glycosaminoglycans (GAG) and chondroitin sulphate A (CS) on the histomorphometry of normal articular cartilage and with experimental degenerative joint disease (DJD) in dogs were evaluated. The groups were constituted as follows: normal joints were not undergone to the surgical procedure and left osteoarthritics that suffered surgical intervention. These were then distributed into joints that did not receive drug treatment and those that received: normal (N) (n = 5); NGAG (n = 5), and NCS (n = 4); and osteoarthritics: O (n = 5); OGAG (n = 5); and OCS (n = 4). Cartilage sections of the femur, tibia, and patella were used in this study. In normal groups (N, NGAG, and NCS) no lesions were found that could characterize DJD, although the cellularity was shown to be slightly diminished in NGAG and NCS, in relation to N. Characteristic DJD disorders were identified in variable degrees among osteoarthritic groups and were more severe in O. There was marked reduction of the number of chondrocytes in group O, as compared to the normal groups, while treated osteoathritic groups showed similar cellularity to that of normal groups. These results were supported by the analysis of the index of proportion (IP), which was high in O, indicating less synthesis of proteoglycans. These results suggest that chondroitin A sulphate acted on osteoarthritic cartilage in a more efficient way than glycosaminoglycan precursors, reducing the loss of proteoglycans caused by the degenerative process, stimulating cellular viability and metabolic activity.(AU)
Assuntos
Animais , Cães , Cartilagem/anatomia & histologia , Glicosaminoglicanos/uso terapêutico , Sulfatos de Condroitina/uso terapêutico , Artroscopia , Osteoartrite/veterináriaResumo
Quinze cães, sem raça definida, de ambos os sexos, de peso entre 18 e 25kg, foram submetidos à secção artroscópica do ligamento cruzado cranial (LCCr) para indução da doença articular degenerativa (DAD). Após três semanas de instabilidade articular, o LCCr foi substituído pela fáscia lata segundo a técnica de Schwalder (1989) e os animais foram distribuídos em três grupos de cinco. Os animais do grupo I, controle, não receberam tratamento medicamentoso; os do grupo II, 24mg/animal de sulfato de condroitina, por via IM, de cinco em cinco dias, totalizando seis aplicações; e os do grupo III foram tratados com hialuronato de sódio na dose de 20mg/animal, por via IV, de cinco em cinco dias num total de três administrações. Ao final de 90 dias, os animais foram eutanasiados e procedeu-se à colheita e ao processamento histológico da membrana sinovial e da cartilagem articular para avaliações morfológica e morfométrica. No grupo I foram observadas alterações degenerativas de DAD mais acentuadas que nos demais grupos, como redução do número de condrócitos, presença de pânus, fibrilações, fissuras, erosões e irregularidades na superfície articular. No grupo II observou-se elevação do número de condrócitos com aumento da atividade de síntese da matriz e redução das lesões na superfície da cartilagem. No grupo III houve aumento do número de condrócitos que eram, muitas vezes, morfologicamente inviáveis. Todos os grupos apresentaram proliferação da membrana sinovial e presença de infiltrado linfoplasmocitário na subíntima e na perivascular. Nos grupos I e III, a proliferação da membrana sinovial era exuberante com formação de pânus, presença de sinoviócitos achatados ou ausência de sinóvia com tecido de granulação. Os resultados sugerem que o sulfato de condroitina estimulou a cartilagem articular, diminuindo ou retardando as alterações da DAD e o hialuronato de sódio não interferiu no processo degenerativo da cartilagem articular. Não foi constatada ...(AU)
Fifteen mongrel dogs, both genders, weighting from 18 to 25kg were used and Degenerative Joint Disease (DJD) was induced through cranial cruciate ligament (CCrL) artroscopical section. After three weeks, CCrL was reconstructed by Schawalder's (1989) technique. Then, dogs were distributed in three groups and the following protocols were used: group I, control, no other treatment but the CCrL reconstruction; group II received chondroitin sulfate 24mg per animal every five days, intramuscularly, in a total of six injections; and group III received sodium hyaluronate 20mg per animal every five days, intravenously, in a total of three injections. Clinical observation was done until 90 days after treatments. By that time, the articular cartilage and synovium were collected and their morphology was evaluated. In group I, the degenerative alterations of the DJD were the most intense. Thus, decrease of chondrocytes number, pannus, fibrillations, grooves, erosion, and irregular articular surface were observed on the cartilage. In group II, raise of chondrocytes number was observed, with increase of synthesis activity of matrix and decrease of lesions on the articular surface. There was an increase of chondrocytes in group III, but the cells were morphologically unviable. All the groups showed proliferation of the synovial membrane, with limpho-plasma cells infiltrated in subintim and perivascular. In groups I and III, the proliferation of synovium was abundant, with formation of pannus, flattened synoviocytes or synovium absent with granulation tissue. Those results suggest that the chondroitin sulfate stimulated the articular cartilage; decreasing or delaying the alterations of DJD, as well as, the sodium hyaluronate did not interfere on degenerative process in articular cartilage. No favorable action of these drugs in the synovial membrane was verified.(AU)
Assuntos
Animais , Artropatias/veterinária , Artroscopia , Ácido Hialurônico , Membrana Sinovial , Cartilagem Articular/anatomia & histologia , Sulfatos de Condroitina , CãesResumo
Samples of articular cartilage of femur, tibia and patella of 15 dogs with experimentally induced degenerative joint disease (DJD) were microscopically analyzed. Animals were distributed into three groups (n=5): the control group received no medication; the second group was treated with chondroitin sulfate and the third received sodium hyaluronate. Samples were processed and stained with HE and toluidine blue for morphological evaluation. The metabolic and proliferative activity of the chondrocytes was evaluated by the measurement of nucleolar organizer regions (NORs) after impregnation by silver nitrate. Significant differences were not observed (P>0.05) in the morphology among the groups, however, the group treated with sodium hyaluronate had a higher score suggesting a trend to a greater severity of the lesions. Significant differences were not observed (P>0.05) in the measurement of NORs, cells and NORs/cells among the groups. Although differences were not significant, sodium hyaluronate group showed higher NOR and cell counts which suggested an increase of the proliferation rate of chondrocytes. In addition, a higher NOR/cell ratio in the group treated with chondroitin sulfate suggested that this drug may have stimulated the metabolic activity of the chondrocytes, minimizing the lesions resulting from DJD.(AU)
Foram utilizadas amostras de cartilagem articular do fêmur, tíbia e patela de 15 cães com doença articular degenerativa (DAD), induzida experimentalmente. Foram constituídos três grupos de cinco animais: grupo 1 - controle, não medicado; grupo 2 - tratado com sulfato de condroitina e grupo 3 - tratado com hialuronato de sódio. As amostras foram processadas e coradas pelas técnicas de HE e de azul de toluidina para avaliação das alterações morfológicas, e impregnadas pelo nitrato de prata para análise da atividade metabólica e/ou proliferativa dos condrócitos, por meio da visualização e quantificação de regiões organizadoras do nucléolo (NORs). Não foram notadas diferenças significativas (P<0,05) na avaliação morfológica entre os grupos. O grupo tratado com hialuronato obteve maior escore sugerindo maior gravidade das lesões. Não foram observadas diferenças significativas (P>0,05) na contagem de NORs, células e NORs/célula entre os grupos. As maiores contagens de NORs e de células no grupo tratado com hialuronato de sódio sugeriram aumento da taxa de proliferação dos condrócitos. A maior relação de NORs/célula obtida no grupo tratado com sulfato de condroitina sugere que essa droga estimula a atividade metabólica do condrócito, minimizando as lesões ocorridas durante a DAD.(AU)
Assuntos
Animais , Artropatias , Ácido Hialurônico/efeitos adversos , Sulfatos de Condroitina/efeitos adversos , Cartilagem , Fêmur , Tíbia , Patela , CãesResumo
Avaliou-se o efeito da reconstrução do ligamento cruzado cranial, associado ou não ao sulfato de condroitina, na evolução da osteoartrite induzida experimentalmente em cães. Vinte cães hígidos, sem raça definida, machos e fêmeas, com peso corpóreo entre 19 e 25kg, foram submetidos à desmotomia do ligamento cruzado cranial. Trinta dias após, foram separados em dois grupos de 10 animais. Um grupo foi submetido à reconstrução do ligamento cruzado com uso de aloenxerto de ligamento patelar congelado, o outro não. Trinta e um dias após a desmotomia, cada grupo foi dividido em dois subgrupos de cinco animais. Um recebeu sulfato de condroitina, o outro não. Os cães foram avaliados clínica e radiograficamente antes da desmotomia e aos 30, 60 e 90 dias após a desmotomia. No último momento foram realizados exames macro e microscópico. Nos cães submetidos somente à desmotomia e tratados com sulfato de condroitina houve redução na progressão das alterações ósseas, ao exame radiográfico. A reconstrução do ligamento cruzado cranial melhorou a função do membro e, quando associada ao sulfato de condroitina, houve melhor resposta. Não houve diferença entre os subgrupos quanto aos exames macro e microscópico.(AU)
The effect of cranial cruciate ligament reconstruction, associated or not to chondroitin sulfate, on the evolution of experimentally induced osteoarthritis in dogs was studied. Twenty healthy mixed dogs, weighing between 19 and 25kg were submitted to cranial cruciate desmotomy. Thirty days later, the animals were divided into two groups with ten dogs each. One was submitted to cranial cruciate ligament reconstruction using frozen patellar tendon allograft and the other received no surgical treatment. Thirty one days after desmotomy, each group was divided into two subgroups with five animals each. One subgroup for each group received chondroitin sulfate and the other received no medical treatment. The dogs were evaluated clinically and radiographically before desmotomy, 30, 60 and 90 days after desmotomy, and at this moment, accomplished gross and microscopical exams. In dogs submitted to only desmotomy, chondroitin sulfate reduced radiographically the progression of osteoarthritic bone changes. Cranial cruciate ligament reconstruction improved dog's gait, however, when associated with chondroitin sulfate, the limb function improved even quicker. There were no statistical differences between subgroups at gross and histological evaluation.(AU)
Assuntos
Animais , Osteoartrite do Joelho/induzido quimicamente , Transplante Homólogo , Transplante Homólogo/veterinária , CãesResumo
O presente trabalho objetivou avaliar a associação de hialuronato de sódio e sulfato de condroitina no tratamento da doença articular degenerativa (DAD) em cães. Dez cães sem raça definida foram submetidos à secção artroscópica do ligamento cruzado cranial visando o desenvolvimento da DAD. Após 21 dias, foi substituído cirurgicamente o ligamento cruzado cranial em todos os animais e iniciado o tratamento com associação de hialuronato de sódio e sulfato de condroitina em cinco cães, sendo os remanescentes utilizados como grupo-controle. Avaliações artroscópica e radiológica do membro posterior esquerdo foram realizadas antes da secção do ligamento, no dia da sua substituição e 90 dias após a cirurgia. Histologicamente, o efeito da associação de hialuronato de sódio e sulfato de condroitina foi mais evidente na membrana sinovial, observando-se regeneração da camada íntima e diminuição da infiltração linfoplasmocitária na sub-íntima. Artroscópica e macroscopicamente não houve prevenção das lesões cartilaginosas decorrentes da DAD.(AU)
The aim of this study was the assessment of hyaluronic acid and chondroitin sulphate association in the therapy of degenerative joint disease (DJD) in dogs. Ten mongrel dogs underwent arthroscopic section of cruciate cranial ligament aiming the development of DJD. Twenty one days after the procedure, surgical substitution of cruciate cranial ligament was carried out in all animals. Then five animals were treated with the combination of hyaluronic acid and chondroitin sulphate. The other five dogs were used as controls. Arthroscopical and radiological evaluations of the left fore limb were carried out before arthroscopic section at the some day and 90 days after cruciate cranial ligament substitution. Histologically the effect of the association of hyaluronic acid and chondroitin sulphate was more evident in the synovial membrane that had regeneration of the intimal layer and reduced lympho-plasmocitic infiltrate in the sub-intimal layer. However, the treatment did not prevent DJD cartilage lesions evaluated by arthroscopy and radiology.(AU)
Assuntos
Animais , Masculino , Feminino , Cães , Artroscopia , Membrana Sinovial , Ácido Hialurônico , Sulfatos de CondroitinaResumo
Avaliaram-se clínica e radiograficamente os efeitos do sulfato de condroitina e do hialuronato de sódio no tratamento da articulação femorotibiopatelar de cães com doença articular degenerativa (DAD) induzida experimentalmente. Foram utilizados 15 cães, sem raça definida, de ambos os sexos, pesando entre 18 e 25 kg, submetidos à secção artroscópica do ligamento cruzado cranial (LCCr) para desestabilização articular e indução da DAD. Após três semanas de instabilidade articular, o LCCr foi substituído utilizando-se a técnica intra-articular com emprego da fáscia lata. Os animais foram divididos em três grupos de cinco. Nos do grupo I fez-se somente a substituição do LCCr. Os do grupo II receberam 24mg/animal de sulfato de condroitina, via IM, de cinco em cinco dias, totalizando seis aplicações. Os do grupo III foram tratados com hialuronato de sódio na dose de 20mg/animal, via IV, de cinco em cinco dias, num total de três aplicações. Os animais foram observados por 90 dias, e avaliados clinicamente quanto à claudicação, à capacidade de suportar peso no membro afetado, à mensuração da atrofia muscular e à amplitude de movimento articular. Ao final, foram encaminhados para novo exame radiográfico. Os resultados demonstraram que os animais que receberam hialuronato de sódio apresentaram menor grau de claudicação quando comparados com os demais. Ao exame radiográfico observaram-se osteofitose periarticular e esclerose óssea subcondral. Essas alterações foram evidenciadas de forma mais acentuada nos animais tratados com hialuronato de sódio. Clinicamente, pôde-se observar melhor resultado com o hialuronato de sódio do que nos demais grupos, possivelmente devido à sua maior ação na membrana sinovial, reduzindo a dor e o grau de claudicação. O exame radiográfico não foi compatível com a sintomatologia clínica nos cães tratados com hialuronato de sódio.(AU)
The aim of this study was the evaluation of the effects of chondroitin sulfate and sodium hyaluronate in the knee joint of dogs with experimentally induced degenerative joint disease (DJD). Fifteen mongrel dogs, weighing 18 to 25kg were used. DJD was induced by cranial cruciate ligament (CCL) arthroscopical transection. After three weeks, CCL was repaired by an intrarticular technique, which uses fascia lata. The dogs were then divided into three groups as follows: group I received no other treatment, but the CCL reconstitution, group II received 24mg/animal of chondroitin sulfate/IM every five days, totaling six injections, and group III received 20mg/animal of sodium hyaluronate /IV every five days, totaling three injections. All dogs were examined clinically and radiographically for 90 days after the repairment surgery. The clinical evaluation was performed by assessment of lameness, weight-bearing, limb muscle atrophy and range of motion. The results demonstrated that the group treated with sodium hyaluronate had lower degree of lameness in comparison with other groups. The radiographic evaluation showed marginal osteophytes and subchondral bone sclerosis. These changes were more severe in the group treated with sodium hyaluronate. The better clinical results observed in this group, compared with the others, was probably due to the greater action of the drug in the synovium, decreasing the pain and lameness. Radiographic findings correlated poorly with the clinical signs in the group treated with sodium hyaluronate.(AU)