Immunoglobulin G proteolytic activity of Actinobacillus actinomycetemcomitans

Actinobacillus actinomycetemcomitans produces a protease to human immunoglobulin G that is an important evasion mechanism. In this study, the proteolytic activity of A. actinomycetemcomitans strain ATCC 43718 on human immunoglobulin G associated with culture supernatant concentrations, the growth period and the period of incubation with immunoglobulin G were evaluated by an enzyme linked immunosorbent assay. The protease fraction was detected by Sephadex G 150 chromatography. The results showed that A. actinomycetemcomitans produced a protease to human immunoglobulin G in the culture supernatant, and the highest activity was achieved witen the concentration was 27.5 mug protein/mL, after culturing for 72 hours and incubating with IgG for 24 hours. The molecular mass of the protease active fraction was from 43 to 150 kDa.

Actinobacillus actinomycetemcomitans produz protease ativa sobre imunoglobulina G humana, sendo um dos mecanismos importantes de escape do microrganismo. No presente trabalho, foi analisada a atividade proteolítica de sobrenadante de cultivo de A. actinomycetemcomitans ATCC 43718 sobre imunoglobulina G humana em função de concentração, tempo de cultivo do microrganismo e tempo de incubação com IgG, por ensaio imunoenzimático. Adicionalmente, foi determinada a fração com atividade de protease por meio de análise de eluatos de cromatografia em coluna de Sephadex G 150. Os resultados obtidos demonstraram que A. actinomycetemcomitans liberou protease ativa sobre imunoglobulina G humana em sobrenadante de cultivo, sendo a sua maior atividade evidenciada na concentração de 27,5 mig proteína/mL, com tempo de cultivo de 72 horas e com 24 horas de incubação com IgG. A massa molecular da fração ativa de protease foi compreendida entre 43 a 150 kDa.

Analysis of leukotoxin gene types of Actinobacillus actinomycetemcomitans in brazilians with aggressive periodontitis

Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) is considered a major etiologic agent of aggressive periodontitis but this species has also been associated with other forms of periodontal disease. Further, highly leukotoxic strains are related to severity of disease. The purpose of this study was to determine the prevalence of Aa and the occurrence of the leukotoxin gene 530-bp deletion in patients with generalized aggressive periodontitis (GAP) from a Brazilian population. Thirty periodontally healthy and 29 GAP subjects participated in the study. Full-mouth periodontal examination including probing pocket depth (PPD), clinical attachment level (CAL), supragingival biofilm (SB) and bleeding on probing (BOP) was carried out at 6 sites/tooth for all subjects. Whole saliva samples were collected for bacterial DNA isolation. The detection of Aa and the presence of the 530-bp genetic deletion were determined directly in the samples by polimerase chain reaction. Differences on clinical and microbiological parameters between the two groups were sought using the Mann-Whitney, Fisher´s exact and Chi-square tests. Associations between clinical and microbiological parameters were tested using the Pearson correlation coefficient. Aa was detected significantly more often in GAP patients (96.6%) than healthy subjects (76.7%) (chi2 = 4.9; p 0.05). The genetic deletion was observed in 16 of the 28 (57.1%) GAP patients who were positive for Aa. However, none of the samples from individuals with periodontal health presented this deletion (chi2 = 19.15; p 0.001). Strong correlations between the presence of the deletion and PPD (r=0.312, p 0.05), CAL (r=0.409, p 0.01), SB (r=0.278, p 0.05) and BOP (r=0.406, p 0.01) were found. A high frequency of Aa was observed in Brazilians with GAP and periodontal health. However, the highly leukotoxic genotype was observed only in subjects with generalized aggressive disease.

Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) tem sido associado com diferentes formas de doenças periodontais, mas tal espécie é considerada o principal agente etiológico da doença periodontal agressiva. Algumas cepas de Aa apresentam uma deleção de 530 pb na região promotora do operon do gene da leucotoxina, produzindo assim maiores quantidades de leucotoxina. Tal fato pode ter um importante papel na patogênese das doenças periodontais. A proposta do presente estudo foi determinar a prevalência do Aa e a ocorrência da deleção genética da leucotoxina em pacientes com periodontite agressiva generalizada (PAG) de uma amostra da população brasileira. Trinta indivíduos com saúde periodontal e 29 pacientes com PAG participaram do estudo. Profundidade de bolsa à sondagem (PBS), nível clínico de inserção (NCI), presença de placa supragengival (PL) e sangramento à sondagem (SAS) foram avaliados em 6 sítios/dente de todos os pacientes. Amostras de saliva foram coletadas para isolamento do DNA bacteriano. A detecção do Aa e a ocorrência da deleção genética foram realizadas através da técnica de PCR diretamente nas amostras. Diferenças nos parâmetros clínicos e microbiológicos entre os grupos foram avaliadas através dos testes de Mann-Whitney, Fisher e Qui-quadrado. Associações entre os parâmetros clínicos e microbiológicos foram testadas através do teste de Pearson. Aa foi detectado com maior frequência em pacientes com PAG (96,6%) do que pacientes saudáveis (76,7%) (chi2 = 4,9; p 0,05). A deleção genética foi observada em 16 dos 28 (57,1%) pacientes com PAG que foram positivos para Aa. Porém, nenhuma das amostras de indivíduos com saúde periodontal apresentaram a deleção (chi2 = 19,15; p 0,001). Correlações significantes entre a presença da deleção e os parâmetros clínicos PBS (r=0,312, p 0,05), NCI (r=0,406, p 0,01), PL (r=0,278, p 0,05) e SAS (r=0,409, p 0,01) foram observadas. Uma alta prevalência de Aa foi observada em brasileiros com PAG e saúde periodontal, entretanto o genótipo altamente leucotóxico foi detectado somente em pacientes com doença agressiva.

Prevalence of leukotoxic genotypes of Actinobacillus actinomycetemcomitans in Brazilians with chronic periodontitis

Actinobacillus actinomycetemcomitans is considered a major etiologic agent of aggressive periodontitis but this species has also been associated with other forms of periodontal disease. Further, highly leukotoxic strains are related to severity of disease. This investigation determined the prevalence of A. actinomycetemcomitans and the occurrence of the leukotoxin gene 530-bp deletion in Brazilian subjects with chronic periodontitis. Twenty periodontally healthy and 20 chronic periodontitis subjects were selected. Full-mouth clinical examination was carried out at 6 sites/tooth. Subgingival biofilm samples were collected from the 3 deepest sites and 3 healthy sites from periodontitis subjects, as well as from 3 sites of individuals with periodontal health. A. actinomycetemcomitans and the genetic deletion were determined by the polymerase chain reaction. Significant differences were sought by Mann-Whitney, Chi-square, and Wilcoxon sign tests. Periodontitis subjects presented a higher prevalence (75%) of A. actinomycetemcomitans than individuals with health (45%) (p = 0.053). A mean frequency of 57.5% of A. actinomycetemcomitans - positive sites was observed in the periodontitis group. Of those, 75% were diseased, whereas 40% were healthy sites (p = 0.0001). Healthy subjects showed a mean frequency of 35% of positive sites. In contrast, the genetic deletion was detected only in 4 diseased sites from 2 chronic periodontitis patients. A high prevalence of A. actinomycetemcomitans was observed in Brazilians with chronic periodontitis. However, the leukotoxin gene 530-bp deletion was rarely detected in the subgingival biofilm of these subjects.

Actinobacillus actinomycetemcomitans tem sido associado com diferentes formas de doenças periodontais, mas tal espécie é considerada o principal agente etiológico da doença periodontal agressiva. Algumas cepas de A. actinomycetemcomitans apresentam uma deleção de 530 pb na região promotora do operon do gene da leucotoxina, produzindo assim maiores quantidades desta toxina. Tal fato pode ter um importante papel na patogênese das doenças periodontais. A proposta do presente estudo foi determinar a prevalência do A. actinomycetemcomitans em amostras de biofilme subgengival de indivíduos brasileiros com periodontite crônica e saúde periodontal; bem como avaliar a distribuição do tipo genético leucotóxico desta espécie nestes indivíduos. Vinte pacientes com periodontite crônica e 20 controles com saúde periodontal foram selecionados. O exame clínico periodontal foi realizado em 6 sítios/dente em todos os dentes. Amostras de biofilme subgengival foram coletadas de 3 sítios com a maior profundidade de bolsa e 3 sítios sem doença dos pacientes com periodontite, assim como de 3 sítios aleatórios dos controles. A detecção do A. actinomycetemcomitans e a ocorrência da deleção genética foram realizadas utilizando a técnica de PCR diretamente nas amostras de biofilme. Pacientes com periodontite crônica apresentaram uma alta prevalência de A. actinomycetemcomitans (75%) quando comparados aos indivíduos sem doença periodontal (45%), porém essa diferença não foi significativa (p = 0.053). Foi observada uma freqüência média de 57.5% de sítios com A. actinomycetemcomitans no grupo com periodontite. Destes sítios, 75% eram sítios com doença, enquanto 40% eram sítios saudáveis (p = 0.0001). Indivíduos sem doença periodontal apresentaram uma freqüência média de 35% de sítios com A. actinomycetemcomitans. A deleção de 530-pb foi encontrada somente em 4 sítios doentes de 2 pacientes com periodontite crônica. Uma alta prevalência de A. actinomycetemcomitans foi observada em pacientes Brasileiros com doença periodontal crônica. Entretanto, a deleção de 530 pb no gene da leucotoxina foi raramente detectada no biofilme subgengival desses indivíduos.

LEUKOTOXIC ACTIVITY OF ACTINOBACILLUS ACTINOMYCETEMCOMITANS ISOLATED FROM HUMAN AND NON-HUMAN PRIMATES

Actinobacillus actinomycetemcomitans is a clinically relevant periodontopathogenic Gram-negative coccobacillus that produces a leukotoxin of the RTX cytolysin family. In this study, we evaluated the leukotoxic activity of A. actinomycetemcomitans strains isolated from human and marmosets by Trypan blue exclusion and by the chemiluminescence assays. Among eight A. actinomycetemcomitans human strains studied, two (P2.17 and P8.12) were classified as high leukotoxin producers and among eight marmoset strains, one (M22.11) showed high leukotoxin production, as determined by Trypan blue exclusion assay. The reference strains ATCC 29523 and FDC Y4 respectively behaved like moderate and low producers. The chemiluminescence assay was used to evaluate the leukotoxic activity of M22.11 and P2.17 strains submitted to different growth conditions. Leukotoxic activity was detected on cells at the logarithmic phase and was similar under anaerobic and microaerophilic growth conditions. It was greatly reduced when cells were grown at glucose concentrations lower or higher than 0.75% (0.25% and 1.5%) in thioglycolate medium. Leukotoxin production mainly by the M22.11 strain was low in BHI broth, whereas production in TSB medium showed a similar level as in thioglycolate broth medium. Sodium bicarbonate at 10 mM did not affect leukotoxin production.

Actinobacillus actinomycetemcomitans é um cocobacilo Gram negativo, periodontopatógeno clinicamente importante, que produz uma leucotoxina pertencente à família das citolisinas RTX. Neste estudo, avaliou-se a atividade leucotóxica de amostras de A. actinomycetemcomitans isoladas de seres humanos e de calitriquídeos pelos métodos de exclusão de azul de Tripan e quimioluminescência. Duas (P2.17 e P8.12) entre oito amostras de A. actinomycetemcomitans isoladas de seres humanos, e uma (M22.11) entre 8 amostras isoladas de sagüis se apresentaram como altamente produtoras de leucotoxina, como determinado pelo teste de exclusão de azul de Tripan. As amostras de referências de A. actinomycetemcomitans ATCC 29523 e FDC Y4 se comportaram como média e baixa produtoras de leucotoxina, respectivamente. O teste de quimioluminescência foi usado para avaliar a atividade leucotóxica das amostras M22.11 e P2.17 submetidas a diferentes condições de crescimento. A atividade leucotóxica foi detectada em células durante a fase logarítmica e foi similar sob crescimento em anaerobiose e microaerofilia. A atividade leucotóxica foi muito reduzida quando as células foram crescidas em concentrações de glicose mais baixa e mais alta que 0,75% (0,25% e 1,5%), em meio tioglicolato. A produção de leucotoxina, especialmente pela amostra M22.11, foi mais baixa em caldo BHI, enquanto em meio TSB a produção foi em nível similar a aquele em meio tioglicolato. Bicarbonato de sódio 10mM não afetou a produção de leucotoxina.