Resumo
As an important enzyme, xylanase is widely used in the food, pulp, and textile industry. Different applications of xylanase warrant specific conditions including temperature and pH. This study aimed to carry out sodium alginate beads as carrier to immobilize previous reported mutated xylanase from Neocallimastix patriciarum which expressed in E. coli, the activity of immobilization of mutated xylanase was elevated about 4% at pH 6 and 13% at 62 °C. Moreover, the immobilized mutated xylanase retained a greater proportion of its activity than the wide type in thermostability. These properties suggested that the immobilization of mutated xylanase has potential to apply in biobleaching industry.
Como importante enzima, a xilanase é amplamente utilizada na indústria alimentícia, de celulose e têxtil. Diferentes aplicações de xilanase garantem condições específicas, incluindo temperatura e pH. Este estudo teve como objetivo realizar grânulos de alginato de sódio como carreador para imobilizar xilanase mutada relatada anteriormente de Neocallimastix patriciarum que expressa em E. coli, a atividade de imobilização da xilanase mutada foi elevada em cerca de 4% em pH 6 e 13% a 62 °C. Além disso, a xilanase mutada imobilizada reteve uma proporção maior de sua atividade do que o tipo amplo em termoestabilidade. Essas propriedades sugerem que a imobilização da xilanase mutada tem potencial para aplicação na indústria de biobranqueamento.
Assuntos
Alginatos/farmacocinética , Neocallimastix , Xilanos/análiseResumo
Abstract As an important enzyme, xylanase is widely used in the food, pulp, and textile industry. Different applications of xylanase warrant specific conditions including temperature and pH. This study aimed to carry out sodium alginate beads as carrier to immobilize previous reported mutated xylanase from Neocallimastix patriciarum which expressed in E. coli, the activity of immobilization of mutated xylanase was elevated about 4% at pH 6 and 13% at 62 °C. Moreover, the immobilized mutated xylanase retained a greater proportion of its activity than the wide type in thermostability. These properties suggested that the immobilization of mutated xylanase has potential to apply in biobleaching industry.
Resumo Como importante enzima, a xilanase é amplamente utilizada na indústria alimentícia, de celulose e têxtil. Diferentes aplicações de xilanase garantem condições específicas, incluindo temperatura e pH. Este estudo teve como objetivo realizar grânulos de alginato de sódio como carreador para imobilizar xilanase mutada relatada anteriormente de Neocallimastix patriciarum que expressa em E. coli, a atividade de imobilização da xilanase mutada foi elevada em cerca de 4% em pH 6 e 13% a 62 °C. Além disso, a xilanase mutada imobilizada reteve uma proporção maior de sua atividade do que o tipo amplo em termoestabilidade. Essas propriedades sugerem que a imobilização da xilanase mutada tem potencial para aplicação na indústria de biobranqueamento.
Resumo
Abstract As an important enzyme, xylanase is widely used in the food, pulp, and textile industry. Different applications of xylanase warrant specific conditions including temperature and pH. This study aimed to carry out sodium alginate beads as carrier to immobilize previous reported mutated xylanase from Neocallimastix patriciarum which expressed in E. coli, the activity of immobilization of mutated xylanase was elevated about 4% at pH 6 and 13% at 62 °C. Moreover, the immobilized mutated xylanase retained a greater proportion of its activity than the wide type in thermostability. These properties suggested that the immobilization of mutated xylanase has potential to apply in biobleaching industry.
Resumo Como importante enzima, a xilanase é amplamente utilizada na indústria alimentícia, de celulose e têxtil. Diferentes aplicações de xilanase garantem condições específicas, incluindo temperatura e pH. Este estudo teve como objetivo realizar grânulos de alginato de sódio como carreador para imobilizar xilanase mutada relatada anteriormente de Neocallimastix patriciarum que expressa em E. coli, a atividade de imobilização da xilanase mutada foi elevada em cerca de 4% em pH 6 e 13% a 62 °C. Além disso, a xilanase mutada imobilizada reteve uma proporção maior de sua atividade do que o tipo amplo em termoestabilidade. Essas propriedades sugerem que a imobilização da xilanase mutada tem potencial para aplicação na indústria de biobranqueamento.
Assuntos
Neocallimastix , Temperatura , Escherichia coli/genéticaResumo
Guava is a fruit rich in antioxidants and its value can be enhanced by fresh-cut processing, which increases convenience for consumption. The objective of this study was to evaluate the changes in bioactive compounds, total antioxidant activity (TAA) and microbial quality in slices of fresh-cut (FC) 'Paluma' guava coated with chitosan at 2% (Q), calcium chloride at 1% (CC), calcium chloride at 1% + sodium alginate at 1% (CC + A), calcium chloride at 1% + chitosan at 2% (CC + Q), and control (T - without coating). Coated slices were packed in trays, wrapped with PVC film and kept at 3 ± 1 °C and 75 ± 4% RH for 12 days and evaluated for ascorbic acid, lycopene, ß-carotene, total extractable polyphenols (TEP), and TAA by ABTS+- and DPPH . Ascorbic acid content of slices did not differ by coatings, but TEP was higher in slices coated with Q. The TAA by DPPH was higher in slices coated with Q, however, by ABTS+- it was higher in those coated with Q, CC and CC + Q. No thermotolerant coliforms or Salmonella were detected in FC guava from any treatment. However, slices coated with Q showed the lowest counts of total coliforms and molds and yeasts. Therefore, the application of Q coating provided microbiological safety to FC guava, still maintaining the levels of bioactive compounds and TAA superior to the control slices, which can characterize this as a healthy FC product, with superior functional potential.(AU)
Goiaba é um fruto rico em antioxidantes e pode ser potencializado pelo processamento mínimo, que aumenta a conveniência ao consumo. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar as mudanças nos compostos bioativos, atividade antioxidante total (AAT) e qualidade microbiológica de goiaba 'Paluma' minimamente processada (MP) em fatias e recobertas com quitosana a 2% (Q), cloreto de cálcio a 1% (CC), cloreto de cálcio a 1% + alginato de sódio a 1% (CC + A), cloreto de cálcio a 1% + quitosana a 2% (CC+Q) e testemunha (T - sem recobrimento). Fatias recobertas foram embaladas em bandeja com filme de PVC de 12 µm e mantidas a 3±1 °C e 80±4% U.R durante 12 dias. As avaliações foram ácido ascórbico (AA), licopeno, ß-caroteno, polifenóis extraíveis totais (PET) e atividade antioxidante total (AAT) pelos métodos ABTS+- e DPPH. O conteúdo de AA das fatias não diferiu entre recobrimentos, mas o de PET foi superior nas recobertas com Q. A AAT pelo DPPH foi superior em fatias recobertas com Q, entretanto, pelo ABTS+- foi superior nas recobertas com Q, CC e CC + Q. Não foi detectado coliformes termotolerantes nem Salmonella em goiaba MP de nenhum tratamento. Fatias recobertas com Q apresentaram contagens mais baixas de coliformes e bolores e leveduras. Portanto, a aplicação dos recobrimentos Q conferiu segurança microbiológica à goiaba MP, ainda mantendo os teores de compostos bioativos e TAA superiores às fatias controle, o que pode caracterizar este como um produto MP saudável, com potencial funcional superior.(AU)
Assuntos
Cloreto de Cálcio , Psidium , Quitosana , Alginatos , Coliformes , Abastecimento de Alimentos , AntioxidantesResumo
The objective of this study was to evaluate the influence of the storage time of Monacrosporium thaumasium pellets on the predation of infective larvae of sheep gastrointestinal nematodes in the semi-arid area of Paraíba, Northeast Brazil. 24 sheep with zero in the count of eggs per gram of faeces EPG, were divided into four experimental groups: Group I, 3 g/10 kg live weight M. thaumasium pellets - 36 months of storage, single dose; Group II, 3 g/10 kg live weight M. thaumasium newly produced, single dose; Group III, 3 g/10 kg live weight pellets without fungi; and Group IV (control group) did not receive pellets. Every 24 h, up to 120 h, the faeces of the animals were collected and submitted to the laboratory for analysis. Fifteen grams of faeces were weighed from each animal and five grams of expanded vermiculite were added to produce the coprocultures. Subsequently, 1000 larvae (L3) sheep trichostrongilides were added, and larval recovery was performed after 7 days. Predation of larvae in Group I (M. thaumasium - 36 months) did not differ significantly (p > 0.01) from Group II (M. thaumasium - recent), with reductions of 75% and 79%. Both groups reached peak predation to larvae at 72 h. The helminth genus most recovered in the coprocultures was Haemonchus sp. The data indicate that the 36-month stocking period of M. thaumasium pellets in alginate matrix did not influence the efficacy of predation of infective larvae of sheep gastrointestinal nematodes, with fungal activity in the faeces up to 96 hours after administration to the animals.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do tempo de armazenamento de péletes de Monacrosporium thaumasium na predação de larvas infectantes de nematódeos gastrintestinais de ovinos no semiárido da Paraíba, Nordeste do Brasil. 24 ovelhas, com contagem de ovos por grama de fezes OPG, negativo, foram divididas em quatro grupos experimentais: Grupo I, 3 g / 10 kg de peso vivo, péletes de M. thaumasium - 36 meses de armazenamento, dose única; Grupo II, 3 g / 10 kg de peso vivo M. thaumasium recém-produzido, dose única; Grupo III, 3 g / 10 kg de peso vivo sem fungos; e Grupo IV (grupo controle), não recebeu péletes. A cada 24 h, até 120 h, as fezes dos animais foram coletadas e submetidas ao laboratório para análise. Quinze gramas de fezes foram pesados de cada animal e cinco gramas de vermiculita expandida foram adicionados para produzir as coproculturas. Subsequentemente, 1000 larvas (L3) de tricostrongilídeos de ovinos foram adicionadas e a recuperação larval foi realizada após sete dias. A predação de larvas no Grupo I (M. thaumasium - 36 meses) não diferiu significativamente (p> 0,01) do Grupo II (M. thaumasium - recente), com reduções de 75% e 79%. Ambos os grupos atingiram o pico de predação para larvas em 72 h. O gênero helminto mais recuperado nas coproculturas foi Haemonchus sp. Os dados indicam que o período de estocagem de 36 meses de péletes de M. thaumasium na matriz de alginato não influenciou a eficácia da predação de larvas infectantes de nematódeos gastrintestinais de ovinos, com atividade fúngica nas fezes até 96 horas após a administração aos animais.
Assuntos
Animais , Ascomicetos , Gastroenteropatias/parasitologia , Larva , Nematoides , Ovinos/parasitologia , Agentes de Controle Biológico/uso terapêutico , Alginatos/uso terapêuticoResumo
ABSTRACT: The effect of the incorporation of cinnamon (Cinnamomum cassia) and nut meg (Myristicafragrans) essential oils in alginate-based edible coatings that were applied on minimally processed apples, is reported. The minimum inhibitory concentrations were 1.25mg.mL-1 (cinnamon) and 2.50mg.mL-1 (nutmeg), against both Escherichia coli and Penicillium commune. Over storage periods there was a significant reduction in the E. coli and P. commune counts compared to the control. The extent of enzymatic browning was also significantly reduced in the coated samples. In the coated minimally processed apples sensory tests, the flavor had the lowest rating of the properties analyzed, for both treatments, followed by aroma and firmness.
RESUMO: O efeito da incorporação dos óleos essenciais de canela (Cinnamomum cassia) e noz-moscada (Myristicafragrans) em revestimentos comestíveis à base de alginato, aplicados em maçãs minimamente processadas é apresentado. As concentrações inibitórias mínimas foram de 1,25mg.mL-1 (canela) e 2,50mg.mL-1 (noz-moscada), contra Escherichia colie Penicillium commune. Durante o armazenamento, houve redução significativa nas contagens de E.coli e P. Commune em comparação com o controle. A extensão do escurecimento enzimático também foi significativamente reduzida nas amostras revestidas. Nas análises sensoriais, o sabor dos óleos essenciais apresentou a menor classificação das propriedades analisadas, tanto para os óleos essenciais, quanto para aroma e firmeza.
Resumo
ABSTRACT: Microencapsulation is used for protection and release of bioactive compounds. Combination of encapsulation methods allows the production of matrices with better technological properties compared to the application of one of the methods alone. Use of ionic gelation produces porous microparticles, and coating it with a protein, by electrostatic interaction, may contribute to a better protection of the active compound. The objective of the research was to produce alginate microparticles (AG) through ionic gelation and to coat them with soluble protein from soy protein concentrate. Two factors were studied, calcium concentration during ionic gelation (0.8, 1.6 and 2.4% w/w) and pH (3.5 and 7.0) of the protein solution for electrostatic interaction. Zeta potential (ZP) of biopolymers and microparticles were determined. Microparticles were characterized according to its morphology, average size and size distribution, as well as protein adsorption. Microparticles presented (154-334μm) multinuclear distribution of active compound, continuous and smooth surface, with a great standard deviation considering average size. The calcium concentration did not influence the protein adsorption on microparticles.The pH used in protein adsorption showed significant effect, with higher adsorption occurring at pH 3.5 (6.5 to 6.7% w/w, dry basis,db, of adsorbed protein) compared to pH 7.0 (<2.0% w/w, db, of adsorbed protein) indicating that electrostatic interaction was determinant for the protein coating. At this situation, ionic gelation microparticles and proteins presented ZP with opposite charges (pH>pKa AG<Isoelectric point, IP).
RESUMO: A microencapsulação é utilizada para a proteção de compostos bioativos e controle de sua liberação. A combinação de métodos de encapsulação permite a obtenção de matrizes com melhores propriedades tecnológicas em relação às técnicas utilizadas individualmente. Na gelificação iônica são produzidas micropartículas porosas, e o recobrimento por interação eletrostática com uma proteína permite a obtenção de micropartículas mais protetivas. O objetivo do trabalho foi produzir micropartículas de alginato (AG) através da gelificação iônica e recobri-las com proteínas solúveis de concentrado proteico de soja. Dois fatores foram estudados, o teor de cálcio utilizado na gelificação iônica (0,8,1,6 e 2,4% m/m) e o pH (3,5 e 7,0) para o recobrimento eletrostático com uma camada proteica. Os potenciais zeta (PZ) dos biopolímeros e das micropartículas foram determinados. As micropartículas foram caracterizadas quanto a morfologia, tamanho médio e sua distribuição e quanto ao teor de proteína adsorvida nas situações estudadas. As micropartículas obtidas apresentaram-se (154-334μm) com recheio distribuído de forma multinuclear, com superfície continua e visualmente lisas, porém com variação grande no tamanho médio. A variação do teor de cálcio não foi significativa na adsorção proteica. O pH utilizado na adsorção proteica foi significativo, com adsorções muito maiores em pH 3,5 (6,5 - 6,7% m/m de proteína adsorvida, base seca) comparado ao pH 7,0 (<2,0% m/m de adsorção proteica, base seca), indicando que a interação eletrostática foi determinante no recobrimento proteico. Nesta situação, micropartículas AG e a proteína apresentam PZ com cargas opostas (pH>pKa AG<ponto isoeletrico, PI).
Resumo
Medicated wound dressings are important barriers to avoid contamination and, when they contain antimicrobial additives, can be used as treatment for infected wounds. There are several types of polysaccharide materials that serve as matrices for medicated wound dressings, among them, sodium alginate. For the preparation of the films studied in this paper, sodium alginate was employed in combination with essential oils/oleoresins (EO/OL) of six peppers that are commonly used in cooking. The EO/OL were incorporated at three different concentrations (low, intermediate and high). Most of the films prepared had better dispersion of the EO/OL at the intermediate concentration. All films studied in this research were dissolved in water at different rates. The antibacterial activity of the prepared films showed significant results against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus, and demonstrated that the films studied may be a new alternative for medicated wound dressings.
Os curativos medicamentosos são importantes barreiras para se evitar contaminação e ainda, quando contém aditivos antimicrobianos, servem como tratamento para ferimentos infectados. Existem vários tipos de materiais polissacarídicos que servem como matrizes para curativos medicamentosos, dentre eles, destaca-se o alginato de sódio. Para a preparação dos filmes estudados neste trabalho, utilizou-se alginato de sódio e incorporou-se óleos essenciais/oleoresinas (OE/OL) de seis pimentas utilizadas na culinária, em três diferentes concentrações. A maioria dos filmes preparados apresentou melhor dispersão dos OE/OL na concentração intermediária destes. Todos os filmes estudados neste trabalho apresentam solubilidade em água, em uma certa extensão. A atividade antibacteriana dos filmes preparados mostra resultados significantes contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Bacillus Cereus, mostrando que os filmes estudados podem ser uma nova alternativa como curativos medicamentos.
Assuntos
Alginatos , Anti-Infecciosos , Bandagens , Pimenta , Óleos Voláteis , Bacillus cereus , Escherichia coli , Staphylococcus aureusResumo
FERRONATO, G. A. Produção in vitro de embriões bovinos em diferentes sistemas de cultivo 3D: efeitos na morfologia nuclear, padrão de metilação, transcrição gênica e vesículas extracelulares. 2022. 97 f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2022. A produção in vitro de embriões (PIV) é uma técnica amplamente utilizada para melhorar os parâmetros reprodutivos em bovinos e humanos. No entanto, a PIV ainda apresenta algumas limitações, como menores taxas de blastocisto e prenhez em comparação com embriões produzidos in vivo. Além disso, os embriões obtidos através da PIV possuem alterações epigenéticas que podem afetar o estabelecimento da prenhez e da saúde pós-natal. In vitro, os embriões são cultivados em placas, que podem ser seis vezes mais rígidas do que o ambiente in vivo, o que causa diferentes estímulos externos que geram diferentes respostas biológicas intracelulares nesses embriões. Uma alternativa bem estabelecida por ser mais fisiológica são os cultivos tridimensionais (3D), que consistem na criação de um microambiente onde as células interagem melhor entre si e com o meio de cultivo. Esses cultivos podem ser produzidos de diferentes formas e materiais. As liquid marbles (LM), são um tipo de cultivo 3D que consiste na criação de um ambiente através de uma pequena gota de líquido encapsulada por partículas de uma sustância hidrofóbica. Outro material constantemente utilizado é o alginato, que possui a capacidade de gerar um hidrogel estável a partir da adição de um íon bivalente. Baseado nisso, a nossa hipótese é que os sistemas 3D por LM ou hidrogéis de alginato possam contribuir positivamente durante as etapas de maturação e cultivo dos embriões produzidos in vitro. Para isso, no experimento 1 (capítulo 2), a maturação in vitro (MIV) foi realizada no sistema de LM e quando avaliada a taxa de maturação nuclear observamos que foi semelhante à do cultivo convencional. Contudo, a expansão das células do cumulus e a expressão de genes importantes para o processo de maturação dos oócitos nas células do cumulus foram diminuídos no grupo LM. O cultivo de prováveis zigotos também foi realizado no sistema LM. No dia 7, foi observada uma menor taxa de blastocisto, diminuição na expressão do bta-miR-615 e aumento na metilação e hidroximetilação global de DNA nos blastocistos do grupo LM. No experimento 2 (capítulo 3), o sistema de cultivo 3D por hidrogéis de alginato foi utilizado no cultivo de prováveis zigotos. Neste experimento, o cultivo convencional foi denominado 2D; uma superfície de hidrogel de alginato foi o grupo 2.5D; e o grupo 3D foi aquele em que os embriões foram encapsulados nos hidrogéis de alginato. No dia 7 do cultivo, foi observado uma diminuição na taxa de blastocisto em ambos os grupos 2.5D e 3D em comparação ao controle. Também houve uma diminuição da expressão dos miRNAs miR-1245 e miR-1260b no grupo 2.5D em relação aos demais. Além disso, o miR-541 foi menos expresso nos blastocistos do grupo 3D em relação ao 2D e 2.5D. Os padrões de metilação e hidroximetilação foram aumentados apenas nos embriões do grupo 2.5D. Além disso, também foi observado uma mudança no perfil transcricional global dos blastocistos cultivados em 2.5D e 3D quando comparados com o grupo 2D, em que genes importantes para o desenvolvimento embrionário inicial foram diferentemente expressos entre os embriões dos diferentes grupos. Juntos, estes resultados sugerem que os cultivos 3D utilizados nos nossos experimentos tiveram um impacto negativo na taxa de produção de embriões bovinos. Entretanto, mais estudos são necessários, visto que, para obtenção dos resultados de embriões produzidos in vitro que temos atualmente foram necessários mais de 40 anos de estudo e essa técnica continua sendo constantemente aprimorada. Portanto, em pesquisas futuras precisamos considerar a hipótese de que com a utilização do cultivo 3D será possível obter blastocistos de PIV semelhantes aos produzidos in vivo.
FERRONATO, G. A. In vitro production of bovine embryos in different 3D culture systems: effects on nuclear morphology, methylation pattern, gene transcription and extracellular vesicles. 2022. 97 f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2022. The in vitro embryo production (IVP) is a technique widely used to improve the reproductive parameters in bovines and humans. However, the IVP still have some limitations, such as lower blastocysts and pregnancies rates in comparison with the in vivo produced embryos. Moreover, the embryos produced by IVP harbor epigenetic alterations which can affect the conception rates and the health of the offspring. IVP embryos are cultured in petri dishes, that are ~6 x more rigid than the in vivo environment, causing different external stimuli and generating different intracellular responses in the embryos. An alternative to circumvent this and create a more physiological culture environment is to use the 3D cultures, which consists in the creation of a microenvironment where the cells can interact themselves and with the culture medium. These culture systems can be produced using several methodologies and materials. The Liquid Marbles (LM) are a type of 3D culture that consists in the creation of an environment trapping a small droplet of culture medium using a hydrophobic substance. An alternative material used is the alginate, that possess the capacity to generate a stable hydrogel after the addition of a bivalent ion. On this basis, our hypothesis was that the 3D systems produced using LM or alginate hydrogels can benefit the in vitro maturation and in vitro culture of bovine oocytes and embryos, respectively. To this end, in the experiment 1 (chapter 2), the in vitro maturation was carried out in LM. We observed that the nuclear maturation rate was similar between the LM and control group. However, the cumulus cells expansion and the expression of genes involved in the maturation processes were decreased in the LM group. The culture of presumptive zygotes was also carried out in LM. As a result, on the day 7 was observed lower blastocysts rate, decrease in the expression of the miRNA bta-miR-615 and increased in the global levels of DNA methylation and hydroxymethylation in the LM blastocysts compared with the controls. In the experiment 2 (chapter 3), the 3D system using alginate hydrogels were used to culture the embryos. In this experiment, the conventional culture was termed 2D; the embryo culture on top of an overlay of alginate termed 2.5D; and the culture with the embryos encapsulated in an alginate hydrogel termed 3D. After the culture for 7 days in each system, the blastocysts rates were examined. We observed a decrease in the blastocysts rates in the embryos cultured in the 2.5 and 3 D systems compared to the control. Regarding the miRNas expression, the miRNAs miR-1245 and miR-1260b were decreased in the 2.5D group compared with the other groups. Moreover, the miR-541 presented lower expression in the 3D group when compared with the other groups. The global levels of DNA methylation and hydroxymethylation increased only in the embryos from the 2.5D group. In addition, the transcriptome from embryos from the 2.5D and 3D differed from the control group, and are more similar between them. Also, several genes critical for embryo development, pluripotency, placentation were decreased in the embryos cultured in the alginate hydrogel. Altogether, these results suggest that the 3D culture systems used in our experiments impaired the embryo development. However, more studies are necessary to fully understand the effects caused by these molecules on embryos. The IVP technique has constantly evolved in the past 40 years, and always a new approach was attempted a lot of drawbacks had to be surpassed. In the future, we envision that the embryos will be cultured in more physiological systems and they will be more similar to the in vivo ones.
Resumo
O zebrafish (Danio rerio) é um importante modelo animal e tem se desta ado na esquisa iom di a or sua omo ogia fisiológica e genética aos humanos. Com isso, diversas linhagens e animais de grande valor genético têm sido desenvolvidos, possuindo assim, grande necessidade de sua preservação. o entanto a rio reser aç o de oócitos de peixe ainda é limitada e necessita aprimoramento. O hidrogel de alginato de sódio além de fornecer suporte para as células, tem demonstrado ser um potencial crioprotetor. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência da técnica de encapsulamento em hidrogel de alginato de sódio durante o procedimento de vitrificação do tecido ovariano de zebrafish. No Experimento 1, foram avaliados a forma de encapsulamento (imersão ou em 30 L de alginato), o momento de exposição ao crioprotetor (antes ou após o encapsulamento) e a temperatura de aquecimento (28, 37 e 50ºC) e foi avaliada a integridade da membrana pela coloração azul de tripan. Os dados mostraram que o tecido ovariano encapsulado por imersão, exposto ao crioprotetor após o encapsulamento e aquecido a 28ºC, apresentou maior integridade de membrana em todas as fases de desenvolvimento dos oócitos (PG: 37.71 ± 3.86 %; CA: 29.93 ± 4.18 %; Vtg1: 18.61 ± 4.69 %) e foi utilizado no Experimento 2. No Experimento 2 foram avaliados quatro grupos vitrificados (VS: Metanol 1,5 M + Me2SO 5,5 M + sacarose 0,5 M; VS1-A: Metanol 1,5 M + Me2SO 5,5 M + sacarose 0,5 M - encapsulado em alginato; VS2-A: Metanol 0,75 M + Me2SO 2,75 M + sacarose 0,25 M - encapsulado em alginato; VA: encapsulado em alginato) e foram avaliados a integridade da membrana (SYBR-14/PI), morfologia (histologia HE), atividade mitocondrial (MTT) e peroxidação lipídica (TBARS). O tratamento VA demonstrou menor percentagem de integridade de membrana, enquanto VS demonstrou maior integridade de membrana no qual não diferenciou do tratamento VS1-A. A atividade mitocondrial foi maior no tratamento não encapsulado (VS) e os tratamentos encapsulados tiveram menor valor. O tratamento VA obteve o maior nível de peroxidação lipídica, enquanto VS1-A e VS obtiveram os menores valores no qual VS não se diferenciou do tratamento VS2-A. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a técnica de encapsulamento em hidrogel de alginato de sódio não teve ação crioprotetora e não permitiu a redução da concentração de crioprotetores. No entanto, a partir de observações durante os experimentos, foi encapsulamento dos fragmentos de tecido ovariano em hidrogel de alginato, possibilitou suporte e evitou perda de células durante o processo de vitrificação.
Zebrafish (Danio rerio) is an important animal model and has stood out in biomedical research for its physiological and genetic homology to humans. Thereby, several lines and animals of great genetic value have been developed, thus having a great need for their preservation. However, the cryopreservation of fish oocytes is still limited and needs improvement. The sodium alginate hydrogel, in addition to providing support for the cells, has been shown to be a potential cryoprotectant. Therefore, the aim of this study was to evaluate the efficiency of the sodium alginate hydrogel encapsulation technique during the zebrafish ovarian tissue vitrification procedure. In Experiment 1, were evaluated the encapsulation form (immersion or 30 L alginate bead), the moment of exposure to vitrification solution (before or after encapsulation) and the warming temperature (28, 37 and 50 ºC) and was evaluated the membrane integrity by trypan blue stain. Data showed that ovarian tissue encapsuled by immersion, exposed to vitrification solution after encapsulation and warmed at 28ºC, had higher membrane integrity of all oocyte developmental stage (PG: 37.71 ± 3.86 %; CA: 29.93 ± 4.18 %; Vtg1: 18.61 ± 4.69 %) and was used in Experiment 2. In Experiment 2 were evaluated four vitrified groups (VS: 1.5M Methanol + 5.5M Me2SO + 0.5M sucrose; VS1-A: 1.5M Methanol + 5.5M Me2SO + 0.5M sucrose encapsulated in alginate; VS2-A: 0.75M Methanol + 2.75M Me2SO + 0.25M sucrose encapsulated in alginate; VA: encapsulated in alginate) and were evaluated the membrane integrity (SYBR-14/PI), morphology (histology HE), mitochondrial activity (MTT), and lipid peroxidation (TBARS). The VA treatment showed a lower percentage of membrane integrity, while VS demonstrated a higher membrane integrity in which it did not differ from the VS1-A treatment. Mitochondrial activity was greater in the non-encapsulated treatment (VS) and the encapsulated treatments had less value. The VA treatment obtained the highest level of lipid peroxidation, while VS1-A and VS obtained the lowest values in which VS was not different from the VS2-A treatment. The results obtained in this study demonstrate that the sodium alginate hydrogel encapsulation technique did not have a cryoprotective action and did not allow the reduction of the CPA concentration. However, the encapsulation of the fragments of ovarian tissue in alginate hydrogel, enabled support and prevented loss of cells during the vitrification process.
Resumo
A resistência anti-helmíntica tem dificultado o controle de nematoides gastrintestinais em pequenos ruminantes. Dessa forma, novas alternativas de controle estão sendo estudadas, como o nanoencapsulamento de compostos bioativos, na tentativa de maximizar a eficácia parasitária desses compostos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade ovicida, larvicida e adulticida de nanoemulsões de carvona produzida por diferentes métodos de homogeneização sobre Haemonchus contortus. Três nanoemulsões de R-carvona foram preparadas usando dois equipamentos de homogeneização (ultra homogeneizador e sonicador) e com e sem revestimento de alginato de sódio: nanoemulsões de R-carvona sem revestimento homogeneizada em sonicador (NSR-son) e homogeneizadas em ultra homogeneizador (NSR- ultra) e R-carvona com revestimento de alginato de sódio (NCR-ultra). Foi realizada a análise de estabilidade, eficiência de encapsulamento e caracterizações físico-químicas das nanoemulsões. Os efeitos das nanoemulsões foi avaliado sobre H. contortus multirresistente no teste de eclosão de ovos (TEO), teste de desenvolvimento larvar (TDL) e teste de motilidade em adultos (TMA). As alterações na cutícula induzidas em H. contortus adultos foram avaliadas por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal de varredura a laser. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e comparados pelo teste Tukey (P<0,05). A concentração efetiva para inibir 50% da eclosão dos ovos e do desenvolvimento larvar (CE50) foi calculada no programa SPSS 17.0. NSR-ultra e NCR-ultra, foram mais estáveis frente à sedimentação e cremeação, respectivamente. Os tamanhos de partículas foram de 281,1 nm (NSR-son), 152,7 nm (NSR-ultra) e 557,8 nm (NCR-ultra) e os potenciais zeta de -15 mV (NSR-son), -10,8 mV (NSR-ultra) e -24,2 mV (NCR-ultra). A eficiência de encapsulamento foi de 99,84±0,01%. A microscopia eletrônica de varredura nas nanoemulsões detectou aumento no tamanho, distribuição não uniforme das partículas e presença de estruturas esféricas agregadas a rede polimérica. No TEO, as CE50 de NSR-son, NSR-ultra e NCR-ultra foram de 0,19 mg/mL, 0,02 mg/mL e 0,17 mg/mL, respectivamente. No TDL foram de 0,29 mg/mL, 0,31 mg/mL e 0,95 mg/mL para NSR-son, NSR-ultra e NCR- ultra, respectivamente. A inibição da motilidade de adultos foi de 100%, após 12h de exposição a NSR-ultra e NCR-ultra, enquanto que para NSR-son foi de 79,16%. A microscopia confocal e de varredura detectaram alterações na cápsula bucal e danos cuticulares. Conclui-se que as nanoemulsões de R-carvona com e sem revestimento de alginato de sódio produzidas por diferentes métodos de homogeneização causaram alterações morfológicas e inibiram a eclosão dos ovos, o desenvolvimento larvar e a motilidade de H. contortus adulto, sendo promissoras para controle de infecções por nematoides gastrintestinais em pequenos ruminantes após avaliações futuras no que se refere à segurança toxicológica desses produtos assim como a comprovação da eficácia anti-helmíntica in vivo.
Anthelmintic resistance has made it difficult to control gastrointestinal nematodes in small ruminants. Thus, new control alternatives are being studied, such as the nanoencapsulation of bioactive compounds, in an attempt to maximize the parasitic efficacy of these compounds. This work aimed to evaluate the ovicidal, larvicidal and adulticidal activity of carvone nanoemulsions produced by different homogenization methods on Haemonchus contortus. Three R-carvone nanoemulsions were prepared using two homogenization equipment (ultra homogenizer and sonicator) and with and without sodium alginate coating: uncoated R-carvone nanoemulsions homogenized in sonicator (UNAlg-son) and homogenized in ultra homogenizer (UNAlg-ultra) and sodium alginate coated R-carvone (CNAlg-ultra). Stability analysis, encapsulation efficiency and physicochemical characterizations of the nanoemulsions were performed. The of the nanoemulsions were evaluated on multidrug resistant H. contortus in the egg hatch test (EHT), larval development test (LDT) and adult worm motility test (AWMT). Changes in cuticle induced in adult H. contortus were evaluated by means of scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy. The results were submitted to analysis of variance (ANOVA) and compared using the Tukey test (P<0.05). The effective concentration to inhibit 50% of egg hatching and larval development (EC50) was calculated using the SPSS 17.0 program. UNAlg-ultra and CNAlg-ultra were more stable against sedimentation and creamation, respectively. The particle sizes were 281.1 nm (UNAlg-son), 152.7 nm (UNAlg-ultra) and 557.8 nm (CNAlg-ultra) and the zeta potentials were -15 mV (UNAlg-son), - 10.8 mV (NSR-ultra) and -24.2 mV (CNAlg-ultra). The encapsulation efficiency was 99.84±0.01%. Scanning electron microscopy of the nanoemulsions detected an increase in size, non-uniform distribution of particles and presence of spherical structures aggregated to the polymeric network. In EHT, the EC50 of UNAlg-son, UNAlg-ultra and CNAlg-ultra were 0.19 mg/mL, 0.02 mg/mL and 0.17 mg/mL, respectively. In LDT they were 0.29 mg/mL, 0.31 mg/mL and 0.95 mg/mL for UNAlg- son, UNAlg-ultra and CNAlg-ultra, respectively. The adult motility inhibition was 100% after 12h of exposure to UNAlg-ultra and CNAlg-ultra, while for UNAlg-son it was 79.16%. Confocal and scanning microscopy detected changes in the buccal capsule and cuticular damage. It is concluded that R-carvone nanoemulsions with and without sodium alginate coating produced by different homogenization methods caused morphological changes and inhibited egg hatching, larval development and adult motility of H. contortus, being promising for control of infections by gastrointestinal nematodes in small ruminants after further evaluations regarding the toxicological safety of these products as well as proof of anthelmintic efficacy in vivo.
Resumo
A Brucelose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias Gram-negativas intracelulares facultativas, de grande importância em saúde animal e humana. Brucella ovis infecta ovinos causando principalmente epididimite e falha reprodutiva em carneiros. Práticas de vacinação, aliadas a um eficiente programa de vigilância são ferramentas fundamentais para o controle das doenças. Uma alternativa para o controle e erradicação da brucelose ovina por B. ovis seria a utilização de estirpes atenuadas desta espécie. Este estudo teve o objetivo de avaliar o potencial vacinal da candidata a vacina B. ovis abcBA associada a diferentes adjuvantes em camundongos desafiados com B. ovis. Camundongos imunizados com cápsulas de alginato com quitosana carregadas com a estirpe vacinal apresentaram uma redução significativa na recuperação bacteriana no baço e fígado após o desafio infeccioso quando comparados ao grupo não vacinado, conduzindo há uma diferença de aproximadamente 0,514 Log e 0,598 Log de recuperação bacteriana no baço e fígado, respectivamente. Durante a avaliação dos níveis de IgG os animais imunizados com alginato com quitosana carregadas com a estirpe vacinal exibiram altos níveis de IgG total, exibindo altos níveis dos isotipos IgG1 e IgG2a, ambas responsáveis por auxiliarem na condução de uma resposta imune tanto do tipo humoral quanto celular respectivamente. Este conjunto de resultados obtidos demonstram que B. ovis abcBA associadas a cápsulas de alginato com quitosana protege camundongos contra o desafio experimental com B. ovis.
Brucellosis is an infectious disease caused by facultative intracellular Gram-negative bacteria, of great importance in animal and human health. Brucella ovis infects sheep mainly causing epididymitis and reproductive failure in sheep. Vaccination practices, combined with an efficient surveillance program, are fundamental tools for disease control. An alternative for the control and eradication of ovine brucellosis by B. ovis would be the use of attenuated strains of this species. This study aimed to evaluate the vaccine potential of the candidate for the B. ovis abcBA vaccine associated with different adjuvants in mice challenged with B. ovis. Mice immunized with chitosan alginate capsules loaded with the vaccine strain showed a significant reduction in bacterial recovery in the spleen and liver after the infectious challenge when compared to the unvaccinated group, leading to a difference of approximately 0.514 Log and 0.598 Log of bacterial recovery in the spleen and liver, respectively. During the evaluation of IgG levels, animals immunized with chitosan alginate loaded with the vaccine strain exhibited high levels of total IgG, exhibiting high levels of the IgG1 and IgG2a isotypes, both responsible for assisting in the conduction of an immune response, both humoral and cell respectively. This set of results obtained shows that B. ovis abcBA associated with alginate capsules with chitosan protects mice against the experimental challenge with B. ovis.
Resumo
The consumption of probiotics is constantly growing due to the numerous benefits conferred on the health of consumers. In this context, Microencapsulation is a technology that favors the viability of probiotic cultures in food products, mainly by the properties of protection against adverse environmental conditions and controlled release. Currently there are different procedures for microencapsulation using polymers of various types of natural and synthetic origin. The use of sodium alginate polymers is one of the largest potential application in the encapsulation of probiotics because of their versatility, biocompatibility and toxicity exemption. The aim of this review is to present viable encapsulation techniques of probiotics with alginate, emphasizing the internal ionic gelation and external ionic gelation, with the possibility of applying, as well as promising for improving these techniques.
O consumo de probióticos está em constante crescimento, devido aos inúmeros benefícios conferidos à saúde dos consumidores. Neste contexto, a microencapsulação é uma tecnologia que favorece a viabilidade das culturas probióticas em produtos alimentícios, principalmente pelas propriedades de proteção contra as condições ambientais adversas e a liberação controlada. Atualmente, existem diversos procedimentos para a microencapsulação, com a utilização de vários tipos de polímeros de origem natural e sintética. O alginato de sódio é um dos polímeros com maior potencial para aplicação na encapsulação de probióticos, devido à sua versatilidade, biocompatibilidade e isenção de toxicidade. O objetivo desta revisão é apresentar técnicas viáveis de encapsulação de probióticos com alginato, enfatizando a gelificação iônica interna e gelificação iônica externa, com a possibilidade de aplicação, bem como as tecnologias promissoras para o melhoramento destas.
Resumo
Este trabalho objetivou produzir, imobilizar em alginato de cálcio, extrair em sistemas de duas fases aquosas (PEG/Citrato) e caracterizar proteases colagenolíticas obtidas de Aspergillus heteromorphus URM 0269. Para tanto, no primeiro momento, realizou-se uma fermentação em estado sólido (planejamento fatorial 22); obtendo-se a melhor condição de produção (3g de farelo de trigo e 20% de umidade, submetidos a 30ºC após 96 horas de fermentação, com atividade proteolítica e colagenolítica de 41,36 U/mL e 401,06 U/mL, respectivamente). A protease colagenolítica contida no extrato enzimático foi imobilizada por aprisionamento em esferas de alginato, sendo realizado um planejamento fatorial 22 onde foi obtido as melhores condições (CaCl2 0,6M; Alginato de sódio 4%), apresentando rendimento de 82,82% para atividade proteolítica e 94,58% de atividade colagenolítica. Esta enzima imobilizada reteve mais de 40% da atividade residual no terceiro ciclo e apresentou 36,82% de perda da atividade após 7 dias de armazenamento a 4°C. Também foram analisados pH e temperatura ótima, bem como as estabilidades. No segundo momento, foi realizado um planejamento fatorial (24) para purificação da protease colagenolítica utilizando o Sistema de duas fases aquosas (SDFA), tendo como variáveis independentes: massa molar de PEG (MPEG), concentração de PEG (CPEG), concentração de citrato de sódio (CCIT) e pH. Posteriormente, a protease extraída por SDFA foi utilizada para hidrólise da azocaseína e caracterizada em termos de parâmetros bioquímicos, cinéticos e termodinâmicos. A enzima foi particionada preferencialmente para a fase rica em PEG cujo maior fator de purificação e recuperação (PF = 7.8 e Y= 157.5%) foi obtido usando MPEG 8000 g/mol, CPEG 24%, CCIT 15% e pH 8,0, apresnetando-se estável a temperaturas de 10 a 30°Ce condições de pH de 5,0 a 6,0. A enzima particionada foi inibida parcialmente por PMSF. Os parâmetros cinéticos de ativação para hidrólise da azocaseína revelaram afinidade por azocaseína (KM = 2,8 mg/mL) com taxa máxima de catálise de 45,0 U/mL. A energia de ativação da reação e a variação de entalpia padrão do desenvolvimento da enzima foram de 24,2 e 54,2 kJ/mol, respectivamente. A hidrólise de caseína catalisada por protease a 25°C mostrou energia livre de Gibbs de ativação, entalpia e entropia de 65,8 kJ/mol, 21,8 kJ/mol e -146,7 J/mol.K, respectivamente. Os parâmetros termodinâmicos da termoinativação da protease no SDFA sugerem um mecanismo predominante de desdobramento reversível, uma vez que a inativação da energia livre de Gibbs aumentou de 91,0 para 102,3 kJ/mol. A fermentação em estado sólido foi eficaz com alta produção enzimática e a imobilização da protease colagenolítica em alginato de cálcio, mostrou ser um método eficiente no rendimento, armazenamento e reuso da enzima. Através de um processo rápido e econômico, a enzima foi purificada por SDFA, permitindo a remoção de contaminantes no extrato enzimático obtido de Aspergillus heteromorphus URM0269. Esses resultados indicam o potencial da protease colagenolítica a ser explorada em aplicações biotecnólogicas, como nas indústrias de curtume, de tenderização de carnes e uso biomédico.
This work aimed to produce, immobilize in calcium alginate, extract in two-phase aqueous systems (PEG/Citrate) and characterize collagenolytic proteases obtained from Aspergillus heteromorphus URM 0269. Therefore, in chapter I, a solid state fermentation was carried out using a factorial design 22; the best production condition was: 3g of wheat bran, 20% moisture, submitted to 30°C after 96 hours of fermentation, with a proteolytic and collagenolytic activity of 41.36 U/mL and 401.06 U/mL, respectively. The collagenolytic protease contained in the enzymatic extract was immobilized by imprisonment in alginate beads, and a factorial design 22 was carried out where the best conditions were obtained (0.6M CaCl2; 4% sodium alginate) for further analysis of yield, reuse, stability of storage and biochemical characterization. In this best test there was a yield of 82.82% for proteolytic activity and 94.58% of collagenolytic activity. This immobilized enzyme retained more than 40% of the residual activity in the third cycle and showed only 36.82% loss of activity after 7 days of storage at 4°C. Optimum pH and temperature, as well as stability, were also analyzed. In chapter II, a factorial design (24) was carried out for purification of the collagenolytic protease using the aqueous two-phase system (ATPS), where it was possible to evaluate the interaction of the independent variables: molar mass of PEG (MPEG), concentration of PEG (CPEG), sodium citrate concentration (CCIT) and pH. Subsequently, the protease extracted by ATPS was used for the hydrolysis of azocasein and characterized in terms of biochemical, kinetic and thermodynamic parameters. The enzyme was preferentially partitioned for the PEG-rich phase whose greatest purification and recovery factor (PF = 7,8 and Y = 157,5%) was obtained using MPEG 8000 g / mol, CPEG 24%, CCIT 15% and pH 8,0. Although the enzyme acted ideally at 50°C and pH 8.0, it was more stable at lower temperatures (10-30 °C) and acidic pH conditions (5.0-6.0). The purified enzyme was inhibited by PMSF, classifying it as a serine protease. The kinetic activation parameters for azocasein hydrolysis revealed greater affinity for azocasein (KM = 2.8 mg / mL) with a maximum catalysis rate of 45.0 U/mL. The reaction activation energy and the standard enthalpy variation of the enzyme development were 24.2 and 54.2 kJ/mol, respectively. Protease catalyzed hydrolysis at 25°C showed Gibbs free energy of activation, enthalpy and entropy of 65.8 kJ/mol, 21.8 kJ/mol and -146.7 J/mol.K, respectively. The thermodynamic parameters of the protease thermoactivation in the ATPS suggest a predominant reversible unfolding mechanism, since the inactivation of Gibbs free energy increased from 91.0 to 102.3 kJ/mol. Solid state fermentation was effective with high enzymatic production. The immobilization of collagenolytic protease in calcium alginate, proved to be an efficient method in the yield, storage and reuse of the enzyme. Through a fast and economical process, the enzyme was purified by ATPS, allowing the removal of contaminants in the enzymatic extract obtained from Aspergillus heteromorphus URM0269. These results indicate the potential of collagenolytic protease to be explored in biotechnological applications, such as in the tannery and detergent industries.
Resumo
O tratamento de feridas corresponde a um grande desafio para os profissionais da área de saúde, em especial, feridas cutâneas extensas ou crônicas que causam limitações físicas, sofrimento emocional e altos custos de tratamento. Diversos curativos estão sendo desenvolvidos com finalidade de tratar essas feridas de forma eficiente e a um custo acessível, dentre eles os curativos com base em biomateriais como a celulose vegetal. O presente estudo objetivou avaliar a segurança e eficácia de membranas de celulose vegetal com alginato de sódio em feridas cutâneas. Para tal, feridas cutâneas foram induzidas em 117 ratos Wistar machos divididos aleatoriamente em três grupos de 36 animais: G1 (grupo controle negativo), G2 (grupo controle positivo - membrana de celulose bacteriana) e G3 (grupo tratamento - membrana de celulose vegetal). Todos os animais foram avaliados nos dias 4, 7, 11 e 14 em relação à retração cicatricial, inflamação, neovascularização e reepitelização. A biossegurança foi avaliada por meio de implante subcutâneo de discos de membrana de celulose vegetal com alginato de sódio em nove animais (Grupo G4), acompanhados durante 14 dias.Para a comparação das porcentagens de retração da ferida foi utilizado o teste ANOVA, e o teste de Mann-Whitney para comparação entre variáveis não paramétricas com grau de significância de p<0,05. O método de modelagem matemática foi empregado para determinar a retração cicatricial. Houve diferença significativa na retração cicatricial de G3 em todos os dias, atingindo 50% de retração em média aos 6.7 dias. Indícios de absorção da membrana ocorreu em até 11 dias, e não houve alterações macroscópicas ou sistêmicas associadas ao implante subcutâneo. A membrana de celulose vegetal e alginato aplicada topicamente demonstrou ser segura, sustentável, de baixo custo e promoveu retração cicatricial contínua sem necessidade de troca de curativo.
Wound treatment is a major challenge for healthcare professionals, especially long or chronic skin wounds that cause physical limitations, emotional distress, and high treatment costs. Several dressings are being developed with the purpose of treating these wounds efficiently and at an affordable cost, among them dressings based on biomaterials such as vegetable cellulose. The present study aimed to evaluate the safety and efficacy of vegetable cellulose membranes with sodium alginate in skin wounds. For this, cutaneous wounds were induced in 117 male Wistar rats randomly divided into three groups of 36 animals: G1 (negative control group), G2 (positive control group - bacterial cellulose membrane) and G3 (treatment group vegetable cellulose membrane). All animals were evaluated on days 4, 7, 11 and 14 in relation to cicatricial retraction, inflammation, neovascularization and reepithelialization. Biosafety was evaluated by subcutaneous implantation of plant cellulose membrane discs with sodium alginate in nine animals (Group G4), followed for 14 days. For the comparison of percentages of wound retraction, the ANOVA test was used, and the Mann-Whitney test was used to compare non-parametric variables with a significance level of p <0.05. The mathematical modeling method was used to determine cicatricial retraction. There was a significant difference in the cicatricial retraction of G3 in all days, reaching 50% of retraction at 6.7 days. Signs of membrane absorption occurred within 11 days, and there were no macroscopic or systemic changes associated with the subcutaneous implant. The topically applied vegetable cellulose and alginate membrane proved to be safe, effective and inexpensive and promoting continuous healing retraction without the need for dressing change.
Resumo
O Brasil é o segundo maior produtor de carne bovina do mundo e para se manter competitivo tem objetivado melhorias em higiene e segurança alimentar. Micro-organismos deteriorantes diminuem a vida de prateleira dos produtos e podem viabilizar patógenos em biofilmes predominantemente heterogêneos. Pseudomonas aeruginosa são bactérias mais comuns em carnes, e tem como característica a alta capacidade de produção de biofilme. Sendo ambientais, a contaminação da carne é facilitada por falhas de higiene e boas práticas, sendo relevante estudos sobre a sua presença em produtos cárneos. Neste trabalho, objetivou-se estudar a intensidade de produção de biofilme e sua expressão gênica por cepas de P. aeruginosa isoladas em planta de processamento bovino. As amostras foram obtidas por suabes de carcaças e superfícies em planta de processamento bovino totalizando sete coletas, divididas em dois dias, amostrando-se 22 pontos em cada coleta. Os isolados foram confirmados físico-quimicamente. A produção de biofilme por espectrofotometria classificou a intensidade em fortes, moderadas, fracas e não produtoras. Foram isoladas 32 cepas, das quais 4 demonstraram forte produção de biofilme, 3 moderadas, 4 fracas e 8 não produtoras. Foi predominante a contaminação em carcaças recém abatidas, anteriormente à refrigeração. As amostras foram confirmadas usando o alvo oprL em análise por qPCR, e a comparação da expressão de alginato, algU e algD posteriormente normalizados pelo gene 16S foi realizada em amostras fortes e fracas. As análises de expressão dos genes algU e algD não demonstraram diferença significativa pelas análises de quantificação relativa não correlacionando com a avaliação fenotípica
Brazil is the second largest beef producer in the world and in order to remain competitive, it has aimed at improving hygiene and food safety. Damaging microorganisms decrease the shelf life of products and may render pathogens viable in predominantly heterogeneous biofilms. Pseudomonas aeruginosa are the most common bacteria in meats, characterized by high biofilm production capacity being environmental, meat contamination is facilitated by good practices hygiene faults being relevant studies on their presence in meat products. The objective of this study was to determine the intensity of biofilm production and its gene expression by strains of P. aeruginosa isolated from a bovine processing plant. Samples were obtained by carcass swabs and surfaces in a bovine processing plant, totaling seven samples, divided in two days, sampling 22 points in each collection. The isolates were physico-chemically confirmed. The biofilm production by spectrophotometry classified the intensity as strong, moderate, weak and non-producing. Thirty-two strains were isolated, 4 of which showed strong biofilm production, 3 moderate, 4 weak and 8 non-producing. Contamination was predominant in freshly slaughtered carcass prior to refrigeration. All samples were confirmed in qPCR analysis with the oprL target, and gene expression of strong and weak samples were developmented with alginate genes, algU and algD, normalized by 16S gene. Expression analyzes of the algU and algD genes did not demonstrate significant difference by the relative quantification analyzes not correlating with the phenotypic evaluation.
Resumo
A imobilização celular representa uma alternativa para a condução de bioprocessos. As células ficam retidas em matrizes e podem ser utilizadas por longos períodos. O objetivo deste trabalho foi testar uma nova metodologia de imobilização de fungos com custo reduzido, avaliar a viabilidade e segurança dos fungos submetidos ao novo método de encapsulamento e determinar a temperatura ideal para armazenar os fungos imobilizados. Os micélios dos fungos Aspergillus niger, Cladosporium cladosporioides e Penicillium solitum foram misturados com 15 g de arroz triturado e 3 g de alginato de sódio, que gotejava em uma solução de cloreto de cálcio a 0,25 M para a formação dos grânulos. Após a secagem em estufa a 26ºC, os grânulos foram armazenados em temperaturas ambiente, geladeira e freezer. Os plaqueamentos foram realizados a cada 15 dias em meio de cultura. As avaliações do tamanho das colônias e esporulação foram realizadas 7, 14 e 21 dias após o plaqueamento, durante 195 dias para A. niger, 225 dias para C. cladosporioides e 210 dias para P. solitum. A temperatura de armazenamento não afetou o desenvolvimento micelial de A. niger e P. solitum. Porém, a esporulação foi reduzida para os grânulos armazenados no freezer. O desenvolvimento micelial de C. cladosporioides foi influenciado pela temperatura. Os grânulos conservados em temperatura ambiente tiveram menor viabilidade. Na análise de microscopia eletrônica de varredura, observou-se que a imobilização é um método seguro no qual o micélio fúngico permanece no interior do grânulo, facilitando o transporte, o armazenamento e a aplicação de micro-organismos.(AU)
Cellular immobilization represents an alternative for the bioprocess conduction, in which the cells are kept in a matrix and can be used over long periods. The objective of this work was to test a new fungi immobilization methodology with reduced cost to evaluate the viability of these fungi when submitted to the new encapsulation method, and to determine the ideal temperature to store the immobilized fungi. The mycelium of the fungi Aspergillus niger, Cladosporium cladosporioides and Penicillium solitum were mixed with 15 g of titrated rice and 3 g of sodium alginate, which was dripped in a 0.25 M calcium chloride solution for the formation of pellets. After drying in an oven at 26ºC, the granules were stored at three temperatures: room, refrigerator and freezer. The platings were carried out every 15 days in culture medium. The evaluations of the colony size and sporulation were carried out 7, 14 and 12 days after plating, for 195 days for A. niger, 225 days for C. cladosporioides, and 210 days for P. solitum. Storage temperature did not affect the mycelial development of A. niger and P. solitum. However, sporulation was reduced for the granules stored in the freezer. The mycelial development of C. cladosporioides was influenced by temperature. The granules conserved at room temperature had lower viability than those stored in the refrigerator and freezer. In the Scanning Electronic Microscopy analysis, it was observed that the immobilization is a safe method in which the fungus mycelium remains inside the granule, facilitating transport, storage and application of micro-organisms.(AU)
Assuntos
Fungos , Imobilização , Microscopia Eletrônica de Varredura/métodos , Cladosporium , Alginatos , AgroindústriaResumo
Medidas de controle da mastite são de grande importância, uma vez que essa doença acarreta muitas perdas econômicas para o produtor. Staphylococcus aureus é um dos principais agentes envolvidos nessa patogenia, além de demonstrar diversos fatores de virulência, como o biofilme. No metabolismo bacteriano, o ferro é um nutriente essencial para diversas vias bioquímicas. De modo geral, naturalmente, o sistema de defesa do hospedeiro produz quelantes de ferro, que atuam restringindo o uso desse metal pelos microrganismos. Esse processo poderia ser adotado como forma alternativa de combate a patógenos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a interferência do alginato de sódio e 2,2-Bipyridyl, no crescimento bacteriano e no biofilme produzido por S. aureus isolados de mastite bovina. Para isto, foi confirmada a resistência antimicrobiana e produção de biofilme dos isolados de S. aureus de maneira fenotípica e genotípica. Em seguida, avaliou-se a capacidade de produção de sideróforos, por meio dos genes sfaD e sbnD, e de forma fenotípica por ensaio de avaliação do crescimento desses microrganismos com fonte exógena de ferro (Cloreto de ferro III). Foram também avaliadas as concentrações inibitórias e bactericidas mínimas para os quelantes testados. Baseado nesses resultados foi estudado a interferência dos quelantes no padrão de crescimento dos isolados, como também a influência dessas substâncias no biofilme produzido por S. aureus. Por fim, estudou-se o efeito sinérgico do uso do 2,2-Bipyridyl associado a um antimicrobiano. Os isolados demonstraram resistência a três das seis classes testadas, além da presença do gene blaZ em todos os isolados. Os dois quelantes inibiram o crescimento dos isolados desafiados com uma fonte exógena de ferro, ainda que 100% das cepas testadas tenham mostrado presença dos genes sfaD e sbnD. O alginato de sódio não demonstrou atividade bactericida, diferente do 2,2-Bipyridyl que mostrou concentrações bactericidas que variaram de 0,0156% a 0,2500% frente a S. aureus. Na curva de crescimento, os isolados testados apresentaram crescimento retardado na presença dos quelantes. Apesar das substâncias não terem demonstrado uma redução efetiva durante a etapa de formação do biofilme, houve interferência na estrutura do biofilme consolidado, pelos dois quelantes. Neste ensaio destacou-se o 2,2-Bipyridyl com interferência em 66,66% do biofilme produzido pelos isolados, contudo, por não apresentar um efeito sinérgico satisfatório, sugere o uso deste, de forma isolada. Assim, os dados apresentados no presente estudo evidenciam o potencial uso do 2,2-Bipyridyl no combate ao biofilme produzido por S. aureus, bem como sua utilização no tratamento da mastite.
Control measures of mastitis are of great importance, since this disease causes many economic losses for the producer. Staphylococcus aureus is one of the main agents involved in this pathogenesis, in addition to demonstrating several virulence factors, such as biofilm. In bacterial metabolism, iron is an essential nutrient for various biochemical pathways. In general, of course, the host defense system produces iron chelators, which act by restricting the use of this metal by microorganisms. This process could be adopted as an alternative form of fighting pathogens. Therefore, the objective of this study was to evaluate the interference of sodium alginate and 2,2'-Bipyridyl in bacterial growth and biofilm produced by S. aureus isolated from bovine mastitis. For this, the antimicrobial resistance and biofilm production of S. aureus isolates were confirmed in a phenotypic and genotypic manner. Then, the siderophores production capacity was evaluated by means of the sfaD and sbnD genes, and in phenotypic form by an evaluation of the growth of these microorganisms with exogenous source of iron (Iron chloride III). Minimum inhibitory and bactericidal concentrations were also evaluated for the chelants tested. Based on these results, it was studied the interference of the chelants in the growth pattern of the isolates, as well as the influence of these substances on the biofilm produced by S. aureus. Finally, the synergistic effect of the use of 2,2'-Bipyridyl associated with an antimicrobial was studied. The isolates showed resistance to three of the six classes tested, in addition to the presence of the blaZ gene in all isolates. The two chelators inhibited the growth of the challenged isolates with an exogenous source of iron, although 100% of the tested strains showed the presence of the sfaD and sbnD genes. Sodium alginate showed no bactericidal activity other than 2,2'-Bipyridyl which showed bactericidal concentrations ranging from 0.0156% to 0.2500% against S. aureus. In the growth curve, the tested isolates presented delayed growth in the presence of chelators. Although the substances did not show an effective reduction during the stage of biofilm formation, there was interference in the structure of the biofilm consolidated by the two chelants. In this study, 2.2'-Bipyridyl with interference in 66.66% of the biofilm produced by the isolates was highlighted, however, because it does not present a satisfactory synergic effect, it suggests the use of this, in an isolated way. Thus, data presented in the present study evidence the potential use of 2,2'-Bipyridyl in the fight against biofilm produced by S. aureus, as well as its use in the treatment of mastitis.
Resumo
No capítulo I, o objetivo do trabalho foi avaliar a ação do Monepantel e outros anti-helmínticos sobre nematódeos gastrintestinais de ovinos do Semiárido da Paraíba. O segundo trata-se da influência do tempo de estocagem de três anos de péletes de M. thaumasium sobre a predação de larvas infectantes de tricostrongilideos de ovinos. O primeiro estudo foi desenvolvido em 20 propriedades, onde utilizamos 30 ovinos de cada propriedade sem tratamento anti-helmíntico a pelo menos três meses. Os animais foram divididos em cinco grupos: grupo I, tratados com 2,0 mL / 10 kg de Albendazol 10%; grupo II, tratados com 2,5 mL / 10 kg de Ivermectina 0,08%; grupo III, tratado com 1,0 mL / 10 kg de Closantel 10%; grupo IV, tratado com 1,0 mL / 10 kg de Cloridrato de Levamisole 5%; e o grupo V, tratados com 1,0 mL / 10 kg de Monepantel 2,5%. Amostras fecais foram coletadas nos dias zero e dez para realização das análises fecais. Para avaliar a resistência, aplicou-se o teste de redução na contagem de ovos por grama de fezes (RCOF) e a coprocultura. Foi observada a multirresistência em todas as propriedades avaliadas, onde 95% das fazendas tinham alta resistência ao Albendazol, 85% à Ivermectina, 80% ao Closantel, 40% ao Levamisole e 45% ao Monepantel. O segundo TRCOF para Monepantel foi realizado quatro meses após o primeiro na propriedade 15, onde o vermífugo foi ineficaz, resultando em eficácia de 75%. Duas ovelhas foram eutanaziadas e necropsiadas, e Haemonchus contortus, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Oesophagostomum columbianum e Trichuris ovis foram recuperados. O segundo estudo foi realizado no Instituto Federal da Paraíba, campus Sousa, Foram utilizados oito ovinos com OPG negativo, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo I, 3g/10 kg de p.v de péletes de M. thaumasium 36 meses de estocagem, dose única; Grupo II, 3g/ 10 kg de péletes de M. thaumasium - recém produzidos, dose única; Grupo III, 3g/10 kg p.v, de péletes sem fungos; Grupo IV, controle. A cada 24h, até 120 h, as fezes dos animais foram coletadas e enviadas ao Laboratório de Parasitologia Veterinária para realização das análises. Foram pesadas 15 gramas de fezes de cada animal e acrescidas cinco gramas de vermiculite expandida, procedidas as coproculturas e adicionadas 1000 larvas infectantes (L3) de tricostrongilídeos de ovinos, sendo a recuperação larval realizada após sete dias. Observou-se que a predação de larvas no Grupo I (M. thaumasium - 36 meses) não diferiu estatisticamente (p>0,01) do Grupo II (M. thaumasium recente), apresentando respectivamente reduções de 75 e 79%. Ambos os grupos acrescentaram pico de predação larvas às 72h. O gênero de helminto mais recuperado nas coproculturas foi Haemonchus sp. Concluiu-se que os nematódeos gastrintestinais de ovinos estão resistentes ao monepantel e que foi frequente a ocorrência de multirresistência a anti-helmínticos por esses nematódeos. Concluiu-se que o período de estocagem de 3 anos de M. thaumasium na matriz de alginato não influenciou a eficácia da predação de larvas de trichotrongilidea de ovelhas, com alta redução da recuperação larval e presença de atividade fúngica nas fezes até 96 horas após administração aos animais.
In Chapter I, the objective of this study was to evaluate the action of Monepantel and other anthelmintics on gastrointestinal nematodes of sheep of the Paraíba Semi-arid. The second is the influence of the three-year storage time of M. thaumasium pellets on the predation of infective larvae of tricostrongilide sheep. The first study was developed in 20 properties, where we used 30 sheep from each farm without anthelmintic treatment for at least three months. The animals were divided into five groups: group I, treated with 2.0 mL / 10 kg of 10% Albendazole; group II, treated with 2.5 ml / 10 kg Ivermectin 0.08%; Group III treated with 1.0 mL / 10 kg of 10% Closantel; Group IV, treated with 1.0 mL / 10 kg of 5% Levamisole Hydrochloride; and group V treated with 1.0 mL / 10 kg of 2.5% Monepantel. Fecal samples were collected at days zero and ten to perform fecal analyzes. To evaluate the resistance, the reduction test was applied in egg count per gram of feces (RCOF) and coproculture. Multiresistance was observed in all the properties evaluated, where 95% of the farms had high resistance to Albendazole, 85% to Ivermectin, 80% to Closantel, 40% to Levamisole and 45% to Monepantel. The second TRCOF for Monepantel was performed four months after the first one at property 15, where the vermifuge was ineffective, resulting in 75% efficacy. Two sheep were euthanized and necropsied, and Haemonchus contortus, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Oesophagostomum columbianum and Trichuris ovis were recovered. The second study was carried out at the Federal Institute of Paraíba, Sousa campus. Eight negative OPG sheep were divided into four experimental groups: Group I, 3g / 10kg of pellets of M. thaumasium - 36 months of storage, dose only; Group II, 3g / 10 kg of M. thaumasium pellets - freshly produced, single dose; Group III, 3g / 10 kg p.v, of pellets without fungi; Group IV, control. Every 24 hours, up to 120 h, the faeces of the animals were collected and sent to the Veterinary Parasitology Laboratory for analysis. Fifteen grams of feces from each animal were weighed and five grams of expanded vermiculite were added, the coprocultures were added and 1000 infective larvae (L3) of tricostrongilídeos of ovinos, being the larval recovery realized after seven days. It was observed that the predation of larvae in Group I (M. thaumasium - 36 months) did not differ statistically (p> 0.01) from Group II (M. thaumasium - recent), respectively presenting reductions of 75 and 79%. Both groups added peak predation to larvae at 72 h. The genus of helminth most recovered in coprocultures was Haemonchus sp. It was concluded that the gastrointestinal nematodes of sheep are resistant to monepantel and that the occurrence of multi-resistance to anthelmintic by these nematodes was frequent. It was concluded that the 3-year storage period of M. thaumasium in the alginate matrix did not influence the efficacy of predation of sheep trichotrongilide larvae with high reduction of larval recovery and presence of fungal activity in the feces up to 96 hours after administration animals.
Resumo
A quitosana é um polissacarídeo amino derivado da quitina. Constitui a maior parte dos exoesqueletos dos insetos, crustáceos e parede celular de fungos, sendo um produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável. Características como biocompatibilidade e biodegradabilidade possibilitam diversas utilizações deste biomaterial na área da saúde. Com o presente estudo objetivou-se avaliar o efeito hemostático ao contato e a reação tecidual ao implante de esponja de quitosana-alginato em lesão hepática em camundongos (linhagem Swiss) saudáveis, comparando-os aos de esponjas de colágeno hidrolisado liofilizadas. As lesões foram induzidas cirurgicamente. O acesso à cavidade abdominal foi feito por meio de incisão longitudinal mediana préretro-umbilical, seguida de localização e exposição do lobo hepático esquerdo. O defeito hepático foi realizado por incisão circular através da cápsula hepática com punch dermatológico de 5,0mm, centralizado na região exposta do lobo esquerdo. Os efeitos hemostáticos de contato das esponjas de quitosana e colágeno hidrolisado foram avaliados por meio de sua compressão sobre as lesões hemorrágicas, enquanto os efeitos de seu implante foram observados a partir da incorporação de fragmentos das referidas esponjas nos defeitos hepáticos produzidos. Esponjas de gaze foram usadas como controle para o estudo de contato. Para a avaliação dos implantes, os segmentos hepáticos retirados para a produção da falha hepática foram utilizados como controles. Os tempos médios para hemostasia nos tratamentos com quitosana e colágeno foram de 49 segundos e, nos tratamentos com gaze, um minuto e 28 segundos. À macroscopia observaram-se aderências omentais sobre os implantes e integração mais rápida da esponja de colágeno ao tecido receptor. A avaliação microscópica evidenciou reação inflamatória aos dois materiais implantados e estímulo à síntese de colágeno. A percentagem média de colágeno dos segmentos hepáticos receptores dos implantes de esponja de quitosanaalginato e de esponja de colágeno hidrolisado apresentou elevação significativa entre 7 e 14 dias pós-operatórios, permitindo inferir efeito estimulante exercido pelas esponjas de quitosana sobre a reparação tissular. Concluiu-se que esponjas de quitosana apresentam ação hemostática e efeito estimulante sobre a síntese de fibras colágenas hepáticas.
Chitosan is a polysaccharide amino derivative of chitin, and constitutes most of the insects and crustaceans exoskeletons and fungal cell wall, thus being a low-cost, renewable and abundant, biodegradable natural product. Biological characteristics, biocompatibility and biodegradability allows various uses of this biomaterial in healthcare. The present study aimed to evaluate the hemostatic contact effect and tissue response to the implant of chitosan-alginate sponge in hepatic lesion in Swiss mice, comparing to freeze-dried hydrolyzed collagen sponges. The lesions were surgically induced. The hemostatic contact effects of chitosan and hydrolyzed collagen sponges were evaluated through its mechanical compression on hemorrhagic lesions, while the effects of his implants were observed from the incorporation of fragments of those sponges in liver failures. Gauze sponges were used as control for contact study. For the implants evaluation, liver segments removed to produce hepatic injury were used as controls. Average hemostasis times for chitosan and collagen treatments were 49 seconds, and one minute and 28 seconds for gauze treatments. Grossly, omental adhesions were observed on the implants and faster integration of collagen sponge at receiver tissue. Microscopic evaluation showed inflammatory reaction to both implanted materials and collagen synthesis stimulation. Average percentage of collagen from hepatic recipients segments of the chitosan-alginate sponge implant, and collagen hydrolyzate sponge implant increased significantly between 7 and 14 days postoperatively, pointing to a stimulating effect exerted by chitosan sponges for tissue repair. In conclusion, chitosan sponges have hemostatic action and stimulating effect on the synthesis of hepatic collagen fibers.