Avaliação da Resposta Inflamatória na Infecção por Brachyspira hyodysenteriae em Leitões Tratados com Nutracêutico

O presente estudo buscou elucidar os mecanismos envolvidos na ação protetiva e terapêutica conferida por nutracêuticos a base de fibras insolúveis sobre o trato gastrointestinal de suínos experimentalmente inoculados com B. hyodysenteriae. Foram utilizadas técnicas de qPCR, isolamento bacteriano, histopatologia, mensuração da concentração de enzimas antioxidantes recuperadas de raspado de mucosa intestinal e recuperação sérica de Fitc Dextran. Para realização do estudo foram utilizados 40 leitões de 21 dias de idade, randomizados e separados em quatro grupos: controle negativo, não inoculados com B. hyodysenteriae e não suplementados com aditivo neutracêutico (CN) (n=10); grupo suplementado com nutracêutico 7 dias antes da inoculação com B. hyodysenteriae (NAI) (n=10); grupo suplementado com nutracêutico após a inoculação com B. hyodysenteriae (NPI) (n=10); e controle positivo, inoculados com B. hyodysenteriae e não suplementados com nutracêutico (CP) (n=10). Os animais foram aclimatados as instalações por 7 dias, recebendo ração e água ad libitum. Quatorze dias após a chegada, os leitões foram inoculados com B. hyodysenteriae, por três dias consecutivos, ou inoculados com caldo BHI estéril (CN). Após 14 dias da primeira inoculação, os animais foram eutanasiados e necropsiados. Os resultados relacionados a sinais clínicos, eliminação de B. hyodysenteriae nas fezes dos suínos, além de manifestações de lesões macroscópicas, microscópicas e permeabilidade intestinal demonstraram que o uso de nutracêuticos a base de fibras insolúveis na alimentação de suínos inoculados experimentalmente com B. hyodysenteriae não foi determinante na prevenção ou tratamento de DS, não contribuindo para manutenção da integridade intestinal ou redução na eliminação do agente. Da mesma forma, as concentrações de enzimas antioxidantes Glutationa-S-transferase e Superóxido Dismutase foram superiores nos grupos CP e CN, sugerindo que o nutracêutico não forneceu proteção adicional contra o estresse oxidativo durante a DS. Entretanto, as concentrações de proteínas teciduais e lipoperoxidação apresentaram valores similares entre o grupo CN e os dois grupos com nutracêuticos, demonstrando redução do estresse oxidativo nesses grupos durante a manifestação de DS.

The aim of this study was to elucidate mechanisms involved in the protective and therapeutic action conferred by nutraceuticals based on insoluble fibers on the gastrointestinal tract of pigs experimentally inoculated with B. hyodysenteriae. The samples were tested by qPCR, bacterial isolation and histopathology, in addition were performed to mensured antioxidant enzymes concentration recovered from intestinal mucosa scraping and FITC Dextran serum recovery, administered orally to the animals. Forty 21-day-old piglets were randomized and separated into four groups: negative control, not inoculated with B. hyodysenteriae and not supplemented with nutraceutical additive (CN) (n = 10); group supplemented with nutraceuticals 7 days before inoculation with B. hyodysenteriae (NAI) (n = 10); group supplemented with nutraceutical after inoculation with B. hyodysenteriae (NPI) (n = 10); and positive control, inoculated with B. hyodysenteriae and not supplemented with nutraceutical (CP) (n = 10). Fourteen days after arrival the animals were inoculated with B. hyodysenteriae during three consecutive days and the negative inoculated group received sterile BHI broth (CN). After 14 days post inoculation, all animals were euthanized and necropsied. The results related to clinical signs, fecal shedding of B. hyodysenteriae, gross lesions, microscopic lesions and intestinal permeability suggested that the use of insoluble fiber nutraceuticals in the feed of pigs experimentally inoculated by B. hyodysenteriae was not decisive in the prevention or treatment of DS, did not contributed to the maintenance of intestinal integrity nor to the reduction of elimination of the agent. The results regarding the concentrations of antioxidant enzymes Glutathione-S-transferase and Superoxido dismutase were higher in the CP and CN groups, suggesting that the nutraceutical did not provide additional protection against oxidative stress during DS. However, the concentrations of tissue proteins and lipoperoxidation were reduced in nutraceutical groups, indicating the positive effect on the oxidative stress during the onset of DS.

Diversidade microbiana intestinal de suínos saudáveis e afetados por disenteria suína e enteropatia proliferativa

Esta tese foi organizada em dois capítulos, ambos avaliando o microbioma fecal de animais acometidos por enfermidades entéricas. O primeiro capítulo teve o objetivo de avaliar a microbiota das fezes coletada de animais à campo com disenteria suína. Foi aplicada a técnica de sequenciamento de nova geração da região hipervariável V4 do rRNA 16S em fezes de 37 animais negativos e 32 animais positivos para B. hyodysenteriae, obtidas de submissões diagnósticas que ocorreram entre 2012 e 2016. O gênero foi o único grau taxonômico com diferenças significativas, observando-se maior abundância relativa de Anaerovorax, Mogibacterium e p-75-a5 em animais positivos e Bifidobacterium, Coprococcus, Dialister, Fibrobacter, Rummeliibacillus e Streptococcus em animais negativos. O segundo capítulo teve como objetivo avaliar o quadro clínico, alterações anatomopatológicas, eliminação nas fezes e o microbioma intestinal de animais inoculados por Brachyspira hyodysenteriae e Lawsonia intracellularis, em infecção individual e coinfecção. Foram utilizados 45 leitões de cinco semanas de idade separados em quatro grupos: coinfecção (Brachyspira hyodysenteriae e Lawsonia intracellularis), B. hyodysenteriae, L. intracellularis e controle negativo. Utilizando o método "Fusion" pelo kit Ion Torrent 16S Metagenomics, o DNA extraído das fezes dos dias -5 e 21 foram amplificados com alvo na região hipervariável V4 do gene 16S rRNA e sequenciados associado a avaliação clinica e anatomopatológica completa, qPCR, imuno-histoquímica e isolamento bacteriano. O grupo coinfecção apresentou um quadro mais grave quanto início dos sinais clínicos, número de animais afetados e gravidade das lesões macro e microscópicas. Foi possível observar maior abundância relativa com diferença estatística em comparação com os demais grupos para os gêneros Prevotella, Anaerovibrio, Bacteroides, Butyricimonas, Desulfovibrio, Fusobacterium e p75-a5 no grupo CO, maior abundância de Clostridium no grupo BRA. No grupo LAW, Megasphaera e Dialister foram estatisticamente significantes e Odoribacter para o grupo NEG. É possível concluir que existe uma alteração da microbiota à nível de gênero em animais naturalmente e experimentalmente infectados com diferenças significativas quanto à expressão do quadro clinico em animais do grupo coinfecção

The thesis was organized in two chapters, in both chapters fecal microbioma in pigs affected by enteric diseases was evaluated. The first chapter aimed to assess the fecal microbioma from animals in herds affected with swine dysentery. The new generation sequencing of 16S rRNA region was applied in 37 negative and 32 positive B. hyodysenteriae pig feces submitted to the diagnostic laboratory between 2012 and 2016. The genus was the only taxonomic level with significant differences between negative and positive animals. Relative great abundance of Anaerovorax, Mogibacterium and p-75-a5 was observed in B. hyodysenteriae positive pigs and Bifidobacterium, Coprococcus, Dialister, Fibrobacter, Rummeliibacillus and Streptococcus in negative animals. The second chapter aimed to evaluate clinical signs, anatomopathological changes, fecal shedding and intestinal microbioma composition of animals inoculated with either B. hyodysenteriae or Lawsonia intracellularis and both agents. Forty-five-week-old piglets were divided in four groups: co-infection with B. hyodysenteriae and L. intracellularis, B. hyodysenteriae alone, L. intracellularis alone and negative control. Using the "Fusion" method by Ion Torrent 16S Metagenomics kit, the DNA extracted from feaces in (-5) and (21) dpi were amplified and sequenced using V4 region of 16S rRNA region. The clinical and anatomopathological evaluation, qPCR, immunohistochemistry and bacterial isolation were also performed and significant differences were observed among groups. The beginning of clinical signs, number of affected animals and severity of macro and microscopic lesions were higher in the co-infected group coinfection. It was possible to observe greater relative abundance with statistical difference in comparison with the other groups for the genera Prevotella, Anaerovibrio, Bacteroides, Butyricimonas, Desulfovibrio, Fusobacterium and p75-a5 in the CO group, a greater abundance of Clostridium in BRA group. In the LAW group, Megasphaera and Dialister were statistically significant and Odoribacter for the NEG group. It is possible to conclude that there is a change in the microbiota at the genus level in naturally and experimentally infected animals and for experimentally inoculated animals there are significant differences regarding the expression of the clinical signs in animals from the coinfection group.

Diversidade Genética e virulencia de amostras de Brachyspira hyodysenteriae isoladas de suinos assintomáticos e com doença clínica.

Esta tese foi dividida em dois estudos. Primeiro objetivou-se a tipificação e avaliação molecular de cepas de Brachyspira hyodysenteriae isoladas de suínos no Brasil. Foi aplicada a técnica de tipagem de sequências multilocus (MLST) de sete genes housekeeping em 46 isolados obtidos dos surtos de disenteria suína que ocorreram entre 2011 a 2015 nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Rio Grande do Sul e Santa Catarina e isolados históricos da década de 90 de granjas do Rio Grande do Sul. Foi detectado um perfil nacional independente das sequencias globais depositadas no banco de dados de Brachyspira spp. Na análise entre as amostras brasileiras, foi constatada relação epidemiológica molecular intra-granja, entre granjas e entre os estados. O segundo projeto teve como objetivo, em experimento in vivo em suínos, avaliar a patogenicidade, características clínicas e moleculares de uma cepa de B. hyodysenteriae isolada de uma granja sem sinais clínicos de disenteria suína comparada com outra cepa isolada de animal com sinal clínico da doença. Nesta avaliação foram observadas diferenças significativas entre os grupos, considerando o início dos sinais clínicos, número de animais afetados e severidade das lesões macroscópicas e microscópicas.

This thesis comprised the results of two studies. First, molecular typing and epidemiological evaluation of strains of Brachyspira hyodysenteriae isolated from swine in Brazil were performed. Multilocus Sequence Typing (MLST) analysis of seven housekeeping genes was performed in 46 Brazilian B. hyodysenteriae isolates obtained from pigs in farms during outbreaks of swine dysentery. Bacterial isolation was obtained between 2011 to 2015 in cases originated from the states of Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Rio Grande do Sul and Santa Catarina, and historical 1990s isolates from farms in the state Rio Grande do Sul. An independent MLST Brazilian MLST profile was observed compared with sequences deposited in the global Brachyspira spp database. Among the Brazilian strains, molecular relationship was observed in intra-farm profiles, among farms and among states. The second project used an in vivo challenge trial in pigs to evaluate the pathogenicity, clinical and molecular characteristics of a B. hyodysenteriae strain isolated from a pig with no clinical signs of swine dysentery, and a strain obtained from an animal with typical clinical signs of the disease. Significant differences were observed between groups, regarding onset of clinical signs, proportion ofclinically affected animals and severity of gross and microscopic lesions.