Bacteriocin-like inhibitory substance in aquaculture: a classic method of protein precipitation for a new aplicability / Substância inibidora tipo bacteriocina na aquicultura: método clássico de precipitação de proteínas para novas aplicações

Techniques to decrease losses from bacterial diseases are always important to improve the fish production. The use of antagonistic substances (bacteriocins) has been proven to be a viable option. The aim of this study was to evaluate different methods of purification for bacteriocin like inhibitory substances (BLIS). For the purification process, we isolated and used two Gram-positive bacilli that produce antagonistic substances for pathogens in aquaculture. Tests for detection of interfering factors were also performed. After the confirmation that the antagonistic action was due the BLIS activity, we carried out the purification methods. The methods tested were: cell free supernatant, acid extraction and ammonium sulfate precipitation at two concentrations (20 and 50%). Salmonella Tiphy CFP/IAL1472 and Aeromonas hydrophila (isolated in a tilapia production environment) were used as indicators of the efficiency of extracts in controlling pathogenic potentials. Ammonium sulfate precipitation at 50% was the most appropriate for purifying the antagonistic substance for both indicators. The extracts of the two isolates remained active for 22 days at 25ºC. These are promising results regarding the water and fish health without the use of antibiotics, in this manner being a safer environmental practice.

Técnicas para diminuir as perdas causadas por doenças bacterianas são importantes para melhorar continuamente a produção de pescado. O uso de substâncias antagônicas (bacteriocinas) tem-se mostrado uma opção viável. O objetivo do trabalho foi avaliar diferentes métodos de purificação de bacteriocinas como substâncias inibidoras (BLIS). Dois bacilos Gram-positivos, produtores de substâncias antagonistas para agentes patogênicos da aquicultura, foram utilizados em processos de purificação. Depois de confirmada a ação antagônica pela atividade de BLIS, os métodos de purificação foram realizados. Os métodos testados foram: células livres de sobrenadante, extração ácida e precipitação por sulfato de amônia em duas concentrações (20 e 50%). Salmonella Typhi PCP/IAL1472 e Aeromonas hydrophila (isolada de um ambiente de tilapicultura) foram utilizadas como indicadores de eficiência dos extratos. O precipitado por sulfato de amônio a 50% foi o mais adequado para purificar a substância antagonista para ambos os isolados indicadores. Os extratos dos dois isolados permaneceram ativos por 22 dias em 25ºC. Estes resultados são promissores do ponto de vista da manutenção da sanidade da água e dos peixes, sem uso de antibióticos, constituindo uma prática ambientalmente mais segura.

Bacteriocin-like inhibitory substance in aquaculture: a classic method of protein precipitation for a new aplicability / Substância inibidora tipo bacteriocina na aquicultura: método clássico de precipitação de proteínas para novas aplicações

Techniques to decrease losses from bacterial diseases are always important to improve the fish production. The use of antagonistic substances (bacteriocins) has been proven to be a viable option. The aim of this study was to evaluate different methods of purification for bacteriocin like inhibitory substances (BLIS). For the purification process, we isolated and used two Gram-positive bacilli that produce antagonistic substances for pathogens in aquaculture. Tests for detection of interfering factors were also performed. After the confirmation that the antagonistic action was due the BLIS activity, we carried out the purification methods. The methods tested were: cell free supernatant, acid extraction and ammonium sulfate precipitation at two concentrations (20 and 50%). Salmonella Tiphy CFP/IAL1472 and Aeromonas hydrophila (isolated in a tilapia production environment) were used as indicators of the efficiency of extracts in controlling pathogenic potentials. Ammonium sulfate precipitation at 50% was the most appropriate for purifying the antagonistic substance for both indicators. The extracts of the two isolates remained active for 22 days at 25ºC. These are promising results regarding the water and fish health without the use of antibiotics, in this manner being a safer environmental practice.(AU)

Técnicas para diminuir as perdas causadas por doenças bacterianas são importantes para melhorar continuamente a produção de pescado. O uso de substâncias antagônicas (bacteriocinas) tem-se mostrado uma opção viável. O objetivo do trabalho foi avaliar diferentes métodos de purificação de bacteriocinas como substâncias inibidoras (BLIS). Dois bacilos Gram-positivos, produtores de substâncias antagonistas para agentes patogênicos da aquicultura, foram utilizados em processos de purificação. Depois de confirmada a ação antagônica pela atividade de BLIS, os métodos de purificação foram realizados. Os métodos testados foram: células livres de sobrenadante, extração ácida e precipitação por sulfato de amônia em duas concentrações (20 e 50%). Salmonella Typhi PCP/IAL1472 e Aeromonas hydrophila (isolada de um ambiente de tilapicultura) foram utilizadas como indicadores de eficiência dos extratos. O precipitado por sulfato de amônio a 50% foi o mais adequado para purificar a substância antagonista para ambos os isolados indicadores. Os extratos dos dois isolados permaneceram ativos por 22 dias em 25ºC. Estes resultados são promissores do ponto de vista da manutenção da sanidade da água e dos peixes, sem uso de antibióticos, constituindo uma prática ambientalmente mais segura.(AU)

Technology and safety assessment for lactic acid bacteria isolated from traditional Bulgarian fermented meat product "lukanka"

The present work discusses the technological and new selection criteria that should be included for selecting lactic acid bacteria for production of fermented meat. Lactic acid bacteria isolated from Bulgarian traditional fermented "lulanka" salami was studied regarding some positive technological parameters (growth at different temperature, pH, and proteolytic activity). The presence of genes related to the virulence factors, production of biogenic amines, and vancomycin resistance were presented in low frequency in the studied lactic acid bacteria. On the other hand, production of antimicrobial peptides and high spread of bacteriocin genes were broadly presented. Very strong activity against L. monocytogenes was detected in some of the studied lactic acid bacteria. In addition, the studied strains did not present any antimicrobial activity against tested closely related bacteria such as Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Enterococcus spp. or Pediococcus spp. To our knowledge this is the first study on the safety and antimicrobial properties of lactic acid bacteria isolated from Bulgarian lukanka obtained by spontaneous fermentation.(AU)

Bactérias ácido láticas bacteriocinogênicas e velame (Croton heliotropiifolius) da caatinga na tecnologia do queijo coalho de cabra: inibição de Staphylococcus aureus e ação antioxidante

O estudo teve como objetivo isolar Bactérias Ácido Láticas (BAL) bacteriocinogênicas, portadoras de genes de enterocinas e seguras e aplicar os isolados selecionados e o óleo essencial de Croton heliotropiifolius na inibição de Staphylococcus aureus e no aumento da ação antioxidante em queijo coalho de cabra. Os isolados de BAL foram obtidos de queijos de cabra e testados quanto à capacidade bacteriocinogênica e inibitória a S. aureus e quanto ao efeito de diferentes tratamentos na atividade das bacteriocinas. Também foram testados quanto à segurança e existência de genes de enterocinas. O óleo essencial de C. heliotropiifolius foi extraído por hidrodestilação e testado quanto à atividade inibitória a S. aureus. Em seguida, foram elaborados queijo contendo S. aureus (Q SA), queijo contendo S. aureus e mix de BAL selecionadas (Q SA+BAL) e queijo contendo S. aureus e óleo essencial de C. heliotropiifolius (Q SA+OE), que foram armazenados por 21 dias a 10 °C. Análises microbiológicas e físico-químicas foram realizadas nos dias 0, 7, 14 e 21. Três isolados de BAL produziram bacteriocinas com ampla atividade inibitória a S. aureus e resistentes a diferentes tratamentos. Os isolados foram caracterizados como seguros e portadores de genes de enterocinas. O óleo essencial de C. heliotropiifolius também apresentou atividade inibitória a S. aureus. Até o dia 17, a menor população de S. aureus foi constatada no Q SA+OE, com a menor contagem no dia 13. A partir do dia 18, a menor população de S. aureus foi no Q SA+BAL. O pH e o conteúdo de proteínas declinaram ao longo do tempo nos três tratamentos, o que foi mais expressivo no Q SA+BAL. Em contrapartida, o conteúdo fenólico total (CFT) e a atividade antioxidante aumentaram significativamente nos três tratamentos. O Q SA+OE apresentou o maior CFT e a maior atividade antioxidante pelos métodos de eliminação de radicais 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS). Enquanto o Q SA+BAL, o maior poder antioxidante redutor férrico. Em conclusão, BAL bacteriocinogênicas indígenas do queijo de cabra e óleo essencial de C. heliotropiifolius são recursos da caatinga que possibilitam a redução de S. aureus e a maior ação antioxidante em queijo coalho de cabra do Semiárido nordestino.

The study aimed to isolate bacteriocinogenic Lactic Acid Bacteria (LAB), carrying enterocin genes and safe and apply the selected isolates and Croton heliotropiifolius essential oil to inhibit Staphylococcus aureus and increase antioxidant action in coalho goat cheese. LAB isolates were obtained from goat cheeses and tested for bacteriocinogenic and inhibitory capacity to S. aureus and for the effect of different treatments on the activity of bacteriocins. They were also tested for safety and the existence of enterocin genes. The essential oil of Croton heliotropiifolius was extracted by hydrodistillation and tested for inhibitory activity against S. aureus. Then, control cheese containing S. aureus (Q SA), cheese containing S. aureus and selected LAB mix (Q SA+BAL) and cheese containing S. aureus and C. heliotropiifolius essential oil (Q SA+OE) were prepared and stored for 21 days at 10 °C. Microbiological and physical-chemical analyzes were performed on days 0, 7, 14 and 21. Three LAB isolates produced bacteriocins with broad inhibitory activity to the S. aureus and resistant to different treatments. The isolates were characterized as safe and carry structural enterocin genes. The essential oil of C. heliotropiifolius also showed inhibitory activity to S. aureus. Until the 17th, the smallest population of S. aureus was found in Q SA+OE, with the lowest count on the 13th and subsequent growth. From the 18th, the smallest population of S. aureus was in Q SA+BAL.The pH and protein content declined over time in the three treatments, which was more expressive in Q SA+BAL. In contrast, Total Phenolic Content (TPC) and antioxidant activity increased significantly in the three treatments. Q SA+OE showed the highest TPC and the highest antioxidant activity by the methods of eliminating radicals 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS). While Q SA+BAL, the highest ferric reducing antioxidant power. In conclusion, bacteriocinogenic LAB indigenous to goat cheese and essential oil of C. heliotropiifolius are resources of the caatinga that enable the reduction of S. aureus and and the greatest antioxidant potential coalho in goat cheese from the Northeastern Semiarid.

Caracterização dos isolados bacteriocinogênicos Enterococcus hirae e Pediococcus pentosaceus obtidos de queijo artesanal e suas bacteriocinas

Os produtos lácteos possuem uma microbiota autóctone bastante diversificada, na qual o grupo das Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é de notável relevância devido às suas características benéficas, tecnológicas e bioconservantes, atraindo o interesse para sua utilização em diversos segmentos biotecnológicos, em especial na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar BAL bacteriocinogênicas de queijos artesanais, caracterizando aspectos ligados à produção e purificação das bacteriocinas, inocuidade, potencial benéfico dos isolados e propriedades inibitórias contra Listeria spp. As cepas bacteriocinogênicas Enterococcus hirae ST57ACC e Pediococcus pentosaceus ST65ACC foram isoladas a partir da técnica de tripla camada e identificadas por metodologias fenotípicas e moleculares. As bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC demostraram estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, e foram inativadas após tratamento com enzimas proteolíticas, comprovando sua natureza proteica. Tratamentos com EDTA, SDS, NaCl e Tween 80 não afetaram a atividade das bacteriocinas. Os sobrenadantes de ambos os isolados foram capazes de inibir Listeria innocua e diversas cepas de L. monocytogenes pertencentes à diferentes sorogrupos e obtidas de fontes distintas, inibindo completamente o desenvolvimento de L. monocytogenes após 12 h. Em co-culturas das cepas bacteriocinogênicas com a cepa indicadora L. monocytogenes 422 em leite desnatado, observou-se que E. hirae ST57ACC foi capaz de controlar a multiplicação do patógeno após 48 h. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus não apresentaram resultados positivos para 25 genes relacionados a bacteriocinas conhecidas, indicando que podem produzir novas bacteriocinas. As cepas de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram também avaliadas quanto ao seu potencial benéfico e segurança: ambos os isolados permaneceram viáveis após tratamento em condições gastrointestinais simuladas, exibindo altos níveis de auto e co-agregação com L. monocytogenes e níveis variados de hidrofobicidade, demonstrando que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC podem prevenir potencialmente o estabelecimento de infecções pelo patógeno. Por meio da metodologia de agar-spot, avaliou-se a possibilidade de interferência de 33 medicamentos comerciais, de diferentes grupos sobre a multiplicação de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC, revelando que apenas antiinflamatórios e medicamentos contendo loratadina e cloridrato de propranolol apresentaram atividade inibitória sobre as cepas. Testes fenotípicos para determinação da susceptibilidade antimicrobiana demonstraram que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram resistentes à vancomicina, oxacilina e sulfa/trimetoprim dentre os 11 antibióticos testados pelo método de disco difusão. Com relação à PCR, poucos genes relacionados à resistência a antibióticos foi foram identificados. Nenhum dos isolados amplificou genes de produção de aminas biogênicas e nem apresentou produção das mesmas. A expressão de diferentes elementos do sistema de transporte ABC e metabolismo de açúcares foi identificada para ambos os isolados. Variações na proporção de inóculo não influenciaram a taxa de multiplicação de E. hirae ST57ACC nem de P. pentosaceus ST65ACC, no entanto, a produção de bacteriocinas foi detectada apenas 9 horas após a inoculação das cepas, quando inoculadas nas proporções de 5% e 10%. Adicionalmente, verificou-se que a densidade celular das cepas bacteriocinogênicas esteve correlacionada à produção de bacteriocinas em sistemas de fermentação tradicional e fermentação com controle de pH a 5,5 e agitação. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram capazes de se multiplicar e produzir bacteriocinas na presença de xilo-oligossacarídeos após 6 horas de incubação, porém em níveis reduzidos quando comparados ao cultivo em meio MRS. Por fim, as bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram purificadas a partir de diferentes metodologias. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus ST65ACC foi purificada em duas etapas, com rendimento final de 101,33 revelandose um peptídeo com massa molecular de 3,5 a 8,5 kDa, determinado por SDS-PAGE. Em contrapartida, um protocolo de três etapas foi empregado na purificação da bacteriocina produzida por E. hirae ST57ACC, com rendimento final de 3,05. Adicionalmente, uma fração semi-purificada foi testada com a linhagem celular HT29, demonstrando que a bacteriocina não apresenta efeitos citotóxicos contra células humanas, sendo considerada segura neste aspecto. Os dados obtidos neste trabalho indicam que os isolados E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST57ACC podem ser considerados importantes ferramentas biotecnológicas na produção de bacteriocinas de interesse ao controle de L. monocytogenes e na biopreservação de alimentos.

Dairy products present a rich and diverse autochthonous microbiota, in which Lactic Acid Bacteria (LAB) are relevant, due to their beneficial, technological and biopreservative features, attracting the interest for their biotechnological application, in food industry, pharmaceutic area and human and veterinary medicine fields. The aim of this study was to isolate and to identify bacteriocinogenic LAB from artisanal cheeses, characterizing some aspects linked to bacteriocin production and purification, safety and beneficial potential of the isolates, as well as their inhibitory properties against Listeria spp. Bacteriocinogenic strains Enterococcus hirae ST57ACC and Pediococcus pentosaceus ST65ACC were isolated by using the triplelayer technique and identified by phenotypical and molecular methods. Bacteriocins produced by E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were stable in a wide range of pH and temperature, losing their activity after treatment with proteolytic enzymes, confirming their proteinaceous nature. Treatments with EDTA, SDS, NaCl and Tween 80 did not affect bacteriocin activity. Cell-free supernatants from both isolates were able to inhibit Listeria innocua and several L. monocytogenes strains, from different serogroups obtained from diverse sources, eliminating L. monocytogenes after 12 h. In co-culture experiments conducted in skimmed milk with the bacteriocinogenic isolates and the target strain L. monocytogenes 422, E. hirae ST57ACC controlled the target strain growth after 48 h. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC did not present positive results for 25 known bacteriocin related genes, indicating that they might express new bacteriocins. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC were also evaluated for their beneficial and safety features: both isolates remained viable after treatment replicating gastrointestinal conditions, showing high levels of auto and co-aggregation with L. monocytogenes and diverse levels of hydrophobicity, demonstrating that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC might prevent the establishment of infections caused by this pathogen. Interference of 33 commercial drugs from different groups on growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC was tested by agar-spot method, revealing that only anti-inflammatories and drugs xv containing loratadine and propranolol hydrochloride influenced the growth of bacteriocinogenic strains. Phenotypical tests employed to determine antibiotic susceptibility have shown that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were resistant to vancomycin, oxacillin and sulfa/trimethoprim out of 11 antibiotics tested by disk-diffusion test, nonetheless low number of antibiotic resistance genes was observed by PCR analysis. None of the isolates amplified biogenic amines encoding genes neither presented phenotypical evidence of their production. Expression of different ABC transporters linked to bacteriocin export and sugar metabolism was detected, for both isolates. Changes in inoculum size did not influenced the growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC; however, bacteriocin production was affected, and bacteriocins were detected only after 9 h with inoculation at 5% and 10% of bacteriocinogenic strains. Additionally, it was observed that cell density of both bacteriocinogenic strains was linked to bacteriocin production in traditional and pH at 5.5 and agitation controlled fermentation continuous. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were capable to grow and produce bacteriocins in the presence of xylo-oligossacharides after 6 h of incubation, but in lower levels than those obtained with cultivation in MRS broth. Finally, E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were purified from different methods. The bacteriocin produced by P. pentosaceus ST65ACC was purified in two-steps, with final yield of 101.33, recognized as a 3.5 to 8.5 kDa peptide, determined by Tricine-SDS-PAGE. In contrast, a three-step-protocol was used to purify the bacteriocin produced by E. hirae ST57ACC, with final yield of 3.05. Moreover, a semi-purified fraction of E. hirae ST57ACC bacteriocin was tested in HT-29 cell-line, demonstrating no-cytotoxic effects in human cells, which means the bacteriocin can be considered safe in this aspect. Obtained data from this study indicate that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST57ACC may be considered as important biotechnological tools for bacteriocin production to control L. monocytogenes and as biopreservatives in food.

Bacteriocinogenic potential of lactic acid bacteria isolates from artisanal fermented meat products

O objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar bactérias ácido láticas (BAL) presentes em embutidos cárneos fermentados artesanais através de técnicas fenotípicas e genotípicas, buscando a seleção de isolados com potencial bacteriocinogênico. BAL isoladas foram obtidas de embutidos cárneos fermentados artesanais e foram caracterizadas quanto a sua atividade bacteriocinogênica; após o isolamento e identificação foram obtidos 5 diferentes isolados: Lactobacillus curvatus 12 e 36; Lactococcus garvieae 32 e Weissella viridescens 23 e 31 e realizada a detecção de genes de bacteriocinas; devido aos resultados encontrados em relação ao espectro de atividade e efeito de substâncias químicas e temperatura na atividade inibitória, três isolados foram selecionados (L. curvatus 12 e 36 e W. viridescens 23) para as demais análises para avaliar o potencial bacteriocinogênico. Os isolados selecionados apresentaram multiplicação distinta e a produção de bacteriocinas foi mais evidente em L. curvatus 12 e W. viridescens 23. As bacteriocinas produzidas foram adsorvidas pelas cepas produtoras em diferentes níveis. As bacteriocinas parcialmente purificadas mantiveram sua atividade inibitória após a eluição com 60% de isopropanol. Os padrões de lise celular foram semelhantes para todos os isolados testados. A detecção de -galactosidase indicou desestabilização da permeabilidade da membrana celular das BAL isoladas. As bacteriocinas produzidas por L. curvatus 12 foram purificadas através do HPLC e foram identificados 4 diferentes sequências de peptídeos. Os isolados de BAL selecionados foram capazes de produzir bacteriocinas com alta atividade inibitória contra L. monocytogenes, indicando sua potencial aplicação na indústria de alimentos como bioconservadores. Para a avaliação da presença de genes de virulência, resistência a antibióticos e probióticos foram utilizados os cinco isolados anteriormente identificados. Todos os isolados testados foram positivos para mub, enquanto EF226-cbp, EF1249-fbp eEF2380-maz foram detectados em pelo menos um isolado; nenhum isolado apresentou os genes map, EFTu ou prgB. Os isolados testados apresentaram resultados variados em relação aos genes de virulência e nenhum isolado apresentou os genes gelE, cylA, efsA, cpd, int-Tn ou sprE. Os genes de resistência aos antibióticos também apresentaram resultados variados. Os isolados de BAL apresentaram alguns aspectos benéficos, além da produção de bacteriocinas, porém a presença de genes de virulência e resistência a antibióticos é um problema ao utilizar esses isolados como culturas starter ou bioconservadores em alimentos. Considerando o potencial inibitório dessas cepas, uma alternativa seria o uso de suas bacteriocinas após procedimentos de semi-purificação ou purificação. Linguiça frescal foi preparada e inoculada com diferentes combinações de L. curvatus 12 (BAL bacteriocinogênica), L. sakei ATCC 15521 (BAL não bacteriocinogênica), L. monocytogenes, nisina e a bacteriocina parcialmente purificada produzida por L. curvatus 12 e estocadas a 7 °C durante 10 dias. As análises microbiológicas foram realizadas nos dias 1, 4, 7 e 10 e as análises físico-químicas (controle) nos dias 1 e 10. No geral, as contagens de BAL não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos e ao longo do período de estocagem (p > 0.05). As contagens de L. monocytogenes em linguiça frescal inoculada com o patógeno e a BAL bacteriocinogênica variaram de 1.0 a 2.0 log UFC/g, sendo significativamente diferente da linguiça inoculada apenas com L. monocytogenes (p < 0.05). Nisina e a bacteriocina parcialmente purificadas também determinaram uma redução nas contagens de L. monocytogenes quando comparado com o tratamento que foi inoculado somente o patógeno, variando de 1.0 a 3.0 log UFC/g (p > 0.05). Esses resultados indicam que BAL bacteriocinogênica foi capaz de determinar uma redução significativa na contagem de L. monocytogenes em linguiça frescal estocada a 7 °C.

The aim of the study was isolate and characterized lactic acid bacteria (LAB) from artisanal fermented meat products through phenotypic and genotypic methodologies, searching for the selection of isolates with bacteriocinogenic potential. LAB isolates were obtained from artisanal fermented meat products and were characterized to their bacteriocinogenic activity; after isolation and identification were obtained 5 different isolates: Lactobacillus curvatus 12 and 36; Lactococcus garvieae 32 and Weissella viridescens 23 and 31 and the detection of bacteriocins related genes were performed; L. curvatus 12 and 36 e W. viridescens 23 were selected for the other analysis to evaluate the bacteriocinogenic potential. The selected isolates showed distinct growth and bacteriocin production was more evident in L. curvatus 12 and W. viridescens 23. The bacteriocins produced were adsorbed by the producing strains at different levels. Partially purified bacteriocins maintained their inhibitory activity after elution with 60% isopropanol. Cell lysis patterns were similar for all isolates tested. Detection of -galactosidase indicated destabilization of the cell membrane permeability of the isolated BAL. The bacteriocins produced by L. curvatus 12 were purified by HPLC and four different peptide sequences were identified. The selected BAL isolates were able to produce bacteriocins with high inhibitory activity against L. monocytogenes, indicating their potential application in the food industry as bioconservatives. For the evaluation of the presence of virulence genes, resistance to antibiotics and probiotics, the five isolates previously identified were used. All isolates tested were positive for mub, while EF226-cbp, EF1249-fbp and EF2380-maz were detected in at least one isolate; none isolated showed map, EFTu or prgB. The isolates tested presented variable results in relation to the virulence genes and no isolates showed the genes gelE, cylA, efsA, cpd, int-Tn or sprE. Antibiotic resistance genes were also detected at different patterns. LAB isolates presented some beneficial aspects besides the production of bacteriocins, but the presence of virulence genes and resistance to antibiotics is a problem when using these isolates as starter or bioconservative cultures in foods. Considering the inhibitory potential of these strains, an alternative would be the use of their bacteriocins after semi-purification or purification procedures. Fresh sausage was prepared and inoculated with different combinations of L. curvatus 12 (bacteriocinogenic BAL), L. sakei ATCC 15521 (non bacteriocinogenic BAL), L. monocytogenes, nisin and partially purified bacteriocin produced by L. curvatus 12 and stored at 7 ° C for 10 days. Microbiological analyzes were performed on days 1, 4, 7 and 10 and physical-chemical analyzes (control) on days 1 and 10. In general, LAB counts did not show significant differences between treatments and throughout the storage period (p> 0.05). The counts of L. monocytogenes in fresh sausage inoculated with the pathogen and the bacteriocinogenic LAB varied from 1.0 to 2.0 log CFU/g, being significantly different from the sausage inoculated with only L. monocytogenes (p < 0.05). Nisin and partially purified bacteriocin also determined a reduction in the counts of L. monocytogenes when compared to the treatment that was inoculated only the pathogen, ranging from 1.0 to 3.0 log CFU/g (p> 0.05). These results indicate that the bacteriocinogenic LAB was able to determine a significant reduction in the count of L. monocytogenes in fresh sausage stored at 7 ° C.

Resistência bacteriana e ação das bacteriocinas de Lactobacillus spp em Staphylococcus aureus isolados de mastite bovina / Bacterial resistance and bacteriocins action in Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis

Staphylococcus aureus is the major pathogen causing intramammary infections in dairy cattle worldwide. Among the factors that contribute to its spread and infectious potential is the ability to overcome the mechanisms of antimicrobials activity. The present work investigated the antimicrobial resistance pattern and sensibility to bacteriocins produced by strains of Lactobacillus spp of 30 isolates of S. aureus from mastitis. From this, 29 are beta-lactamase producers. Eight isolates (26.6 percent) showed resistance to at least four antibiotics being considered multiresistent. All of them were mecA-positive. Otherwise, all isolates tested showed sensibility to at least one of the four bacteriocin producer strains. Due to the significant depletion of the efficacy of antimicrobials, pathogen growth inhibition by bacteriocins seems an alternative of biological control in infectious processes.(AU)

Improved adsorption-desorption extraction applied to the partial characterization of the antilisterial bacteriocin produced by Carnobacterium maltaromaticum C2

Bacteriocins are ribosomally produced peptides useful for food biopreservation. An improved adsorption-desorption process is proposed for the partial purification of the bacteriocin produced by the fish isolate Carnobacterium maltaromaticum C2. Analyzis of extract by SDS-PAGE indicated this method may offer an alternative to improve the yield of purification of bacteriocins.

Evaluation of bacteriocin-producing Lactobacillus sakei 1 against Listeria monocytogenes 1/2a growth and haemolytic activity

Bacteriocin-producing Lactobacillus sakei 1 was cultivated in Brain-Heart Infusion broth (24 h at 25ºC). The culture supernatant was neutralized, filter sterilized and used to test the activity of bacteriocin against Listeria monocytogenes 1/2a, at 8ºC and 15ºC. Non-bacteriocinogenic Lactobacillus sakei ATCC 15521 was used as a negative control. L. monocytogenes 1/2a was inoculated in culture supernatant medium from L. sakei 1 and L. sakei ATCC 15521 and the listerial populations were determined after 0, 5 and 10 days. The bacteriocin production was quantified as arbitrary units per mL (AU/mL) using agar antagonism test. Additionally, to investigate if L. monocytogenes virulence pattern could be changed after bactericion exposure, the ability of L. monocytogenes to cause haemolysis in sheep red blood cells was determined, before and after exposure to bacteriocin at 8ºC. In the presence of the antimicrobial peptide, at 8ºC, L. monocytogenes population decreased, but growth of resistant cells was observed. At 15ºC, there was no difference between test and control. Furthermore, the haemolytic activity of L. monocytogenes 1/2a was not altered by exposure to L. sakei 1 bacteriocin, which suggests no change in its virulence pattern.

Lactobacillus sakei 1 produtor de bacteriocina foi cultivado em caldo Infusão Cérebro-Coração por 24h a 25ºC. O sobrenadante da cultura foi neutralizado, esterilizado por filtração e usado para testar a atividade da bacteriocina frente a Listeria monocytogenes 1/2a, a 8ºC e 15ºC. Lactobacillus sakei ATCC 15521 não bacteriocinogênico, foi utilizado como controle negativo. L. monocytogenes 1/2a foi inoculada no sobrenadante da cultura de L.sakei 1 e L. sakei ATCC 15521 e as populações listeriais foram determinadas após 0, 5 e 10 dias. A produção de bacteriocina foi quantificada como unidades arbitrárias por mL (UA/mL), utilizando-se o teste de antagonismo em ágar. Adicionalmente, para investigar se o padrão de virulência de L. monocytogenes poderia ter mudado após exposição à bacteriocina, foi avaliada a habilidade de L. monocytogenes em causar hemólise em hemáceas de carneiro, antes e após exposição à bacteriocina a 8ºC. Na presença do peptídeo antimicrobiano, a 8ºC, a população de L. monocytogenes foi reduzida, mas o desenvolvimento de células resistentes foi observado. A 15ºC, não houve diferença entre os grupos controle e teste. Além disso, a atividade hemolítica de L. monocytogenes 1/2a não foi alterada pela exposição à bacteriocina de L. sakei, 1/2a não foi alterada pela exposição à bacteriocina de L. sakei, o que sugere que não houve mudança em seu padrão de virulência.

Bacteria of fecal origin in mangrove oysters (Crassostrea rhizophorae) in the Cocó River estuary, Ceará State, Brazil

This study was aimed at evaluating the microbiological quality of mangrove oysters (Crassostrea rhizophorae), collected at a natural oyster bed in the estuary of Cocó river (Fortaleza, Ceará, Brazil). MPN values were used for estimating the total (TC) and fecal (FC) coliforms and Enterococcus spp. TC and FC MPN values in the whole muscle and intervalve liquid ranged from 1.8 to >1,600/g and from 1.8 to 920/g, respectively. The MPN estimates for Enterococcus spp. were between 3.0 and >1,100/g. No correlation was found between the physico-chemical parameters (temperature, salinity and pH) of the surrounding water and the bacteriological contamination levels found in the tested oysters. The only correlation found was between TC and FC values. Enterococcus spp. strains were isolated and subjected to biochemical tests for species identification. The capacity of those strains for production of a bacteriocin-like inhibitory substance was tested using the Escherichia coli strain ATCC 25922 as a testing organism. Only one, E. faecalis, out of 121 Enterococcus strains tested, presented the inhibitory activity.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica da ostra de mangue (Crassostrea rhizophorae) originária de um criadouro natural no estuário do Rio Cocó, Fortaleza, Ceará, Brasil. Para isso, foram realizadas as estimativas do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes Totais (CT) e de Fecais (CF) e de Enterococcus spp. Os valores encontrados para CT e CF no músculo (com líquido intervalvar) variaram de 1,8 a >1.600 e 1,8 a 920 por grama, respectivamente. O valor do NMP de Enterococcus spp. variou de 3,0 a >1.100/g. Não houve correlação entre os parâmetros físico-químicos (temperatura, salinidade e pH) da água na área do criadouro e os níveis de contaminação encontrados nas ostras. Somente houve correlação entre os valores de CT e CF. Cepas de Enterococcus spp. foram isoladas e submetidas a testes bioquímicos para identificação das espécies e, posteriormente, foram testadas para verificar a produção de substância inibitória semelhante à bacteriocina utilizando a cepa-teste Escherichia coli ATCC 25922. De um total de 121 cepas de Enterococcus spp. testadas apenas uma, E. faecalis, apresentou atividade inibitória.

Isolation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from meat and meat products and its spectrum of inhibitory activity

A total of 285 samples of meat and meat products were evaluated for the presence of bacteriocin-producing lactic acid bacteria by the "sandwich" test. From 174 of these samples, 813 strains of lactic acid bacteria were isolated. They were able to inhibit the growth of Staphylococcus aureus CTC 33 and/or Listeria innocua Lin 11. When evaluated by the well-diffusion assay, 128 of these strains inhibited the growth of the indicator strains. The inhibitory spectra of activity of the isolates were evaluated against a range of Gram-positive and Gram-negative test organisms. S. aureus was the most sensitive indicator tested, whereas Enterococcus faecalis and Lactobacillus plantarum were the most resistant ones. All the compounds produced by the lactic acid bacteria were fully or partially inactivated by some of the proteolytic enzymes, which indicates their proteinaceous nature. The antimicrobial activity of the bacteriocins produced by the lactic acid bacteria isolated in this work could act as a potential barrier to inhibit the growth of spoilage bacteria and foodborne pathogens.

Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do "sanduíche". A partir de 174 destas amostras, 813 linhagens de bactérias lácticas com atividade inibitória sobre Staphylococcus aureus CTC 033 e/ou Listeria innocua Lin 11 foram isoladas. Quando examinadas pelo método de antagonismo simultâneo em poços, 128 destas linhagens inibiram o crescimento dos microrganismos indicadores. O espectro de atividade das linhagens isoladas foi avaliado com diversos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. De um modo geral, S. aureus foi o microrganismo indicador mais sensível, enquanto Enterococcus faecalis e Lactobacillus plantarum foram os mais resistentes. Todos os compostos antimicrobianos produzidos pelas bactérias lácticas testadas foram completa ou parcialmente inativados por enzimas proteolíticas, o que indica sua natureza protéica. A atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas linhagens de bactérias lácticas isoladas neste trabalho pode atuar como uma barreira potencial para inibir o crescimento de bactérias deterioradoras e patogênicas de origem alimentar.

Isolation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from meat and meat products and its spectrum of inhibitory activity

A total of 285 samples of meat and meat products were evaluated for the presence of bacteriocin-producing lactic acid bacteria by the "sandwich" test. From 174 of these samples, 813 strains of lactic acid bacteria were isolated. They were able to inhibit the growth of Staphylococcus aureus CTC 33 and/or Listeria innocua Lin 11. When evaluated by the well-diffusion assay, 128 of these strains inhibited the growth of the indicator strains. The inhibitory spectra of activity of the isolates were evaluated against a range of Gram-positive and Gram-negative test organisms. S. aureus was the most sensitive indicator tested, whereas Enterococcus faecalis and Lactobacillus plantarum were the most resistant ones. All the compounds produced by the lactic acid bacteria were fully or partially inactivated by some of the proteolytic enzymes, which indicates their proteinaceous nature. The antimicrobial activity of the bacteriocins produced by the lactic acid bacteria isolated in this work could act as a potential barrier to inhibit the growth of spoilage bacteria and foodborne pathogens.

Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do "sanduíche". A partir de 174 destas amostras, 813 linhagens de bactérias lácticas com atividade inibitória sobre Staphylococcus aureus CTC 033 e/ou Listeria innocua Lin 11 foram isoladas. Quando examinadas pelo método de antagonismo simultâneo em poços, 128 destas linhagens inibiram o crescimento dos microrganismos indicadores. O espectro de atividade das linhagens isoladas foi avaliado com diversos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. De um modo geral, S. aureus foi o microrganismo indicador mais sensível, enquanto Enterococcus faecalis e Lactobacillus plantarum foram os mais resistentes. Todos os compostos antimicrobianos produzidos pelas bactérias lácticas testadas foram completa ou parcialmente inativados por enzimas proteolíticas, o que indica sua natureza protéica. A atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas linhagens de bactérias lácticas isoladas neste trabalho pode atuar como uma barreira potencial para inibir o crescimento de bactérias deterioradoras e patogênicas de origem alimentar.

Bacteria of fecal origin in mangrove oysters (Crassostrea rhizophorae) in the Cocó River estuary, Ceará State, Brazil

This study was aimed at evaluating the microbiological quality of mangrove oysters (Crassostrea rhizophorae), collected at a natural oyster bed in the estuary of Cocó river (Fortaleza, Ceará, Brazil). MPN values were used for estimating the total (TC) and fecal (FC) coliforms and Enterococcus spp. TC and FC MPN values in the whole muscle and intervalve liquid ranged from 1.8 to >1,600/g and from 1.8 to 920/g, respectively. The MPN estimates for Enterococcus spp. were between 3.0 and >1,100/g. No correlation was found between the physico-chemical parameters (temperature, salinity and pH) of the surrounding water and the bacteriological contamination levels found in the tested oysters. The only correlation found was between TC and FC values. Enterococcus spp. strains were isolated and subjected to biochemical tests for species identification. The capacity of those strains for production of a bacteriocin-like inhibitory substance was tested using the Escherichia coli strain ATCC 25922 as a testing organism. Only one, E. faecalis, out of 121 Enterococcus strains tested, presented the inhibitory activity.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica da ostra de mangue (Crassostrea rhizophorae) originária de um criadouro natural no estuário do Rio Cocó, Fortaleza, Ceará, Brasil. Para isso, foram realizadas as estimativas do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes Totais (CT) e de Fecais (CF) e de Enterococcus spp. Os valores encontrados para CT e CF no músculo (com líquido intervalvar) variaram de 1,8 a >1.600 e 1,8 a 920 por grama, respectivamente. O valor do NMP de Enterococcus spp. variou de 3,0 a >1.100/g. Não houve correlação entre os parâmetros físico-químicos (temperatura, salinidade e pH) da água na área do criadouro e os níveis de contaminação encontrados nas ostras. Somente houve correlação entre os valores de CT e CF. Cepas de Enterococcus spp. foram isoladas e submetidas a testes bioquímicos para identificação das espécies e, posteriormente, foram testadas para verificar a produção de substância inibitória semelhante à bacteriocina utilizando a cepa-teste Escherichia coli ATCC 25922. De um total de 121 cepas de Enterococcus spp. testadas apenas uma, E. faecalis, apresentou atividade inibitória.

Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas isoladas de queijo de baixa umidade frente a Staphylococcus aureus ATCC6538 e Listeria monocytogenes ATCC7644 / Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from cheese, low moisture against Staphylococcus aureus ATCC6538 and Listeria monocytogenes ATCC7644

Há uma crescente preocupação na indústria de alimentos com o desenvolvimento de métodos para o controle de microrganismos indesejáveis na tentativa de satisfazer os consumidores que estão mais exigentes e atentos aos conservadores contidos nos alimentos. As bactérias láticas (BAL) despertam interesse devido ao seu potencial de utilização no biocontrole em alimentos, pois podem exercer atividade inibitória frente a outras bactérias. No presente trabalho o isolamento de BAL foi realizado em 60 amostras de queijo de baixa umidade. Das 66 linhagens isoladas, 10 foram identificadas baseando-se na coloração de Gran, reação com KOH, teste de catalase e fermentação de 49 carboidratos (API 50 CH). Nove cepas tiveram atividade inibitória comprovada pela produção de bacteriocina e foram identificadas como Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei PI, Lactobacillus plantarum PI, Lactobacillus brevis PICI, Lactobacillus brevis PIC2, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei P2Cl, Lactobacillusparacasei subsp. paracasei P3C I, Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei P3C2, Lactobacillus, plantarum P3Cl, Lactobacillus plantarum P3C2. Foi observado que as BAL isoladas e identificadas apresentaram significativa atividade inibitória frente a L. monocytogenes ATCC 7644 e a S. aureus ATCC 6538, conferindo-lhes vantagem competitiva de grande relevância para futuras aplicações em alimentos. (AU)

Food quality and safety raise increasing concerns among consumers, but the use of chemical preservatives to prevent spoilage and/or growth of microbial pathogens is also seen with preoccupation. Biopreservation approaches using lactic acid bacteria (BAL) and/or their metabolites is an importantalternative to improve food safety. BAL can synthesize and excrete antimicrobial peptides denominated bacteriocins. Current research on BAL are conducted aiming to broad their application as natural food preservatives. In this work the isolation of BAL was realized in 60 samples of cheese of low humidity. Of the 66 isolates, 10 were identified basing on the Gram staining, reaction with KOH, catalase test andfermentation of 49 carboidratos (API 50 CH). Nine strains had inhibitory activity proven for the bacteriocin production and they were identified as Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei P1, Lactobacillus plantarum P1, Lactobacilius brevis P1C1, Lactobacillus brevis P1C2, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei P2C1, Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei P3C1, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei P3C2, Lactobacillus, plantarum P3C1, Lactobacilius plantarum P3C2. Ali BAL that produced bacteriocin displayed significant inhibitory activity against L. monocytogenes ATCC 7644 and S. aureus ATCC 6538, and this property is of great interest for future applications in foods. (AU)

Screening for antimicrobial activity among bacteria isolated from the Amazon Basin

Bacteria producing antimicrobial activity were identified among 86 isolates from aquatic environments of Brazilian Amazon Basin. Antimicrobial activity against at least one indicator strain was detected for 59 isolates (68.6%). Inhibitory activity was mostly against Gram-positive bacteria, such as Listeria monocytogenes and Bacillus cereus. The antimicrobial substances produced by 19 strains that showed higher inhibitory activity were partially characterized. These antimicrobial substances showed thermal resistance for up to 100°C and partial resistance to proteolytic treatment. Some antimicrobials were partially resistant to pronase E at 2 mg ml-1 or to treatment with trichloroacetic acid. Detection of antimicrobial activity on polyacrylamide gels revealed that the molecular weight of the compounds was lower than 14 kDa. Several strains showed antibacterial activity, which in some cases appear to be related to antimicrobial peptides. The potential of these microorganisms to produce useful antimicrobial compounds is great and must be better explored.

Bactérias produtoras de atividade antimicrobiana foram identificadas entre 86 isolados de ambientes aquáticos da Bacia Amazônica. Destes, 59 isolados (68.6%) apresentaram atividade antimicrobiana contra pelo menos uma bactéria indicadora. A atividade inibitória foi principalmente observada contra bactérias Gram-positivas, como Listeria monocytogenes e Bacillus cereus. As substâncias antimicrobianas produzidas por 19 linhagens que demonstraram maior atividade inibitória foram parcialmente caracterizadas, apresentando resistência térmica até 100°C e resistência parcial ao tratamento proteolítico. Algumas substâncias foram parcialmente inativadas somente quando tratadas com ácido tricloroacético ou com pronase E na concentração de 2 mg ml-1. A detecção da atividade antimicrobiana em géis de poliacrilamida mostrou que os compostos apresentaram peso molecular inferior à 14 kDa. Várias linhagens apresentaram atividade antibacteriana, que em alguns casos estaria relacionada com peptídios antimicrobianos. O potencial destes microrganismos para produzir substâncias antimicrobianas é grande e merece ser mais explorado.

Detecção de bacteriocinas produzidas por bactérias fitopatogênicas dos gêneros Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas

Detection of bacteriocin production was studied under distinct conditions using strains of plant pathogenic bacteria from the genera Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas. 58.06%, 79.31% and 40.00% of producing strains were found respectivelly in the three groups of bacteria using the 523 medium which was the best for the detection of bacteriocin production. Increasing agar concentrations added to the medium up to 1,5% improved the detection. The amount of medium added to the Petri dishes did not affect bacteriocin production. The longest incubation time (72h.) improved the detection of haloe production. Ultra-violet irradiation in low dosages seems to improve the visualization of haloe prodution but this is dependent on the tested strains.

A detecção da produção de bacteriocinas foi estudada em diferentes condições, utilizando-se linhagens de bactérias fitopatogênicas dos gêneros Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas. Obtiveram-se, respectivamente, 58,06%, 71,31% e 40,00% de linhagens produtoras no meio 523, que foi o mais indicado para detecção dessa produção. Uma maior concentração de ágar adicionada ao meio (1,5%) produziu melhores resultados mas, a quantidade de meio nas placas não influenciou a detecção de bacteriocinas. O maior tempo de incubação utilizado (72 h.) facilitou detecção de halos de produção de bacteriocinas. Irradiação com luz ultra-violeta em baixas doses parece facilitar a liberação de bacteriocinas, mas isso varia com a linhagem empregada.

Detecção de bacteriocinas produzidas por bactérias fitopatogênicas dos gêneros Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas

Detection of bacteriocin production was studied under distinct conditions using strains of plant pathogenic bacteria from the genera Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas. 58.06%, 79.31% and 40.00% of producing strains were found respectivelly in the three groups of bacteria using the 523 medium which was the best for the detection of bacteriocin production. Increasing agar concentrations added to the medium up to 1,5% improved the detection. The amount of medium added to the Petri dishes did not affect bacteriocin production. The longest incubation time (72h.) improved the detection of haloe production. Ultra-violet irradiation in low dosages seems to improve the visualization of haloe prodution but this is dependent on the tested strains.

A detecção da produção de bacteriocinas foi estudada em diferentes condições, utilizando-se linhagens de bactérias fitopatogênicas dos gêneros Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas. Obtiveram-se, respectivamente, 58,06%, 71,31% e 40,00% de linhagens produtoras no meio 523, que foi o mais indicado para detecção dessa produção. Uma maior concentração de ágar adicionada ao meio (1,5%) produziu melhores resultados mas, a quantidade de meio nas placas não influenciou a detecção de bacteriocinas. O maior tempo de incubação utilizado (72 h.) facilitou detecção de halos de produção de bacteriocinas. Irradiação com luz ultra-violeta em baixas doses parece facilitar a liberação de bacteriocinas, mas isso varia com a linhagem empregada.

Influence of bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum BN in the shelf-life of refrigerated bovine meat

Sugar cane molasses is a cheap by-product of the sugar cane industry. This product was used for growth and production of bacteriocins by Lactobacillus plantarum BN and evaluated for its potential application in the extension of the shelf-life of raw meat. Bovine meat cubes were dipped in the filtered and neutralized supernatant of the fermented broth (Treatment A) and stored at 5ºC. Counts of psychrotrophic and mesophilic aerobic microorganisms, pH determination and total acidity were performed on meat cubes after 0, 3, 6, 9, 12 and 15 days. These determinations were also done in cubes dipped in a 6% lactic acid solution (treatment B) and distilled water (treatment C). After 3 days, the counts of psychrotrophic microorganisms in cubes submitted to treatment A, B and C increased 0.38, 1.42 and 2.04 log cycles, respectively. The same happened with mesophilic microorganisms (0.31, 0.33 and 1.04 log cycles increases, respectively). On the sixth day, the psychrotrophic population in samples submitted to treatments A and B were 2.07 and 0.64 log cycles, respectively, lower than in the control samples (treatment C). Mesophilic microorganisms in these samples were 1.58 and 1.12 log cycles, respectively, lower than the controls. On the sixth day, only samples submitted to treatment A presented lower counts than those recommended by ICMSF as quality standards for raw meat ( 10(7) CFU/g). After nine days of storage under refrigeration, samples submitted to treatment A still maintained acceptable quality. From the twelfth day on, all samples exceeded the microbial quality limits. These results indicate that dipping of raw meat in filtered sugar cane molasses containing bacteriocins produced by L. plantarum BN may be an interesting technological option to extend the shelf life of refrigerated bovine meat.

Melaço de cana de açúcar é um sub-produto barato da indústria açucareira. Esse produto foi empregado para o crescimento e produção de bacteriocina de Lactobacillus plantarum BN e avaliado quando a sua aplicação potencial no aumento da vida útil de carne crua. Cubos de carne bovina foram imersos por 5 minutos no sobrenadante filtrado e neutralizado dessa cultura (Tratamento A) e mantidos a 5ºC. Contagens de microrganismos psicrotróficos e mesófilos, determinação de pH e de acidez total foram realizadas nas amostras após 0, 3, 6, 9, 12 e 15 dias. Essas determinações foram também feitas em amostras mergulhadas por 5 minutos em solução de ácido lático a 6% (tratamento B) e em água destilada (tratamento C). Após 3 dias em refrigeração, as contagens de microrganismos psicrotróficos nas amostras submetidas ao tratamento A aumentaram 0,38 ciclos log, enquanto aquelas submetidas aos tratamentos B e C aumentaram muito mais (1,42 and 2,04 ciclos log, respectivamente). O mesmo aconteceu com os microrganismos mesófilos (0,31, 0,33 and 1,04 ciclos log, respectivamente). No sexto dia, as contagens de psicrotróficos nas amostras submetidas aos tratamentos A e B foram 2,07 e 0,64 ciclos log, respectivamente, mais baixas que nas amostras controle (tratamento C). As contagens de mesófilos nessas amostras foram 1,58 e 1,12 ciclos log, respectivamente, mais baixas que nos controles. No sexto dia, somente as amostras submetidas ao tratamento A apresentaram contagens inferiores a aquelas consideradas pelo ICMSF como padrão de qualidade ( 10(7) UFC/g). Após 9 dias, somente as amostras tratadas com a bacteriocina apresentaram qualidade aceitável. A partir do 12º dia, todas as amostras de carne estavam fora dos padrões de qualidade. Esses resultados indicam que a imersão da carne bovina em caldo de melaço de cana de açúcar pode ser um interessante recurso tecnológico para aumentar a vida útil desse produto em refrigeração.

Antilisterial activity of lactic acid bacteria isolated from vacuum-packaged brazilian meat and meat products

Twenty samples of Brazilian meat and meat products were screened by the agar overlay method for bacteriocin-producing lactic acid bacteria, using Lactobacillus sake ATCC 15521 as indicator strain. Based on Gram staining, KOH reaction, catalase test and fermentation of 49 carbohydrates (API 50 CH), three out of seven isolates with confirmed antagonist properties were identified as Lactobacillus curvatus, one as Leuconostoc mesenteroides and one as Leuconostoc sp. Two isolates could not be properly identified using these tests. The inhibitors produced by these strains were sensitive to proteases. Inhibition due to lytic bacteriophages was ruled out, so the isolates were classified as bacteriocin-producing lactic acid bacteria. Four of them presented antilisterial activity and a potential application as biopreservatives in meat systems.

Vinte amostras de carnes e produtos cárneos brasileiros foram analisadas com a finalidade de se isolar bactérias láticas produtoras de bacteriocina, através do método de antagonismo em ágar, utilizando Lactobacillus sake ATCC 15521 como microrganismo indicador. Baseado na coloração de Gram, reação com KOH, teste de catalase e teste de fermentação de 49 carboidratos (API 50 CH), três das sete cepas com características antagonísticas foram classificadas como Lactobacillus curvatus, uma como Leuconostoc mesenteroides e uma como Leuconostoc sp. Duas cepas não puderam ser identificadas usando apenas estes testes. Os inibidores produzidos por essas cepas mostraram-se sensíveis a proteases. A inibição devido a bacteriófagos líticos foi descartada e assim as culturas foram classificadas como bactérias láticas produtoras de bacteriocina. Quatro cepas apresentaram atividade antilisterial, e conseqüentemente um potencial de utilização como bioconservadores em produtos cárneos.

Characterization of bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains

Bacteriocins produced by fifteen strains of Lactococcus lactis (14 L. lactis subsp. lactis and one L. lactis subsp. cremoris) were heat resistant, sensitive to several proteolytic enzymes and active over a wide range of pH. Their resistance to the heating was greatly influenced by the pH. Only the strain L. lactis subsp. lactis ITAL 383 produced a bacteriocin with a wide activity spectrum, similar to nisin of L. lactis subsp. lactis ATCC 11454. This bacteriocin inhibited closely related species and other Gram-positive microorganisms including Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus, but it was not active against the Gram-negative bacteria tested. The identification of partially purified antimicrobial compounds by SDS-PAGE showed that bacteriocin produced by strain ITAL 383 had the same molecular weight of nisin produced by L. lactis subsp. lactis ATCC 11454.

Bacteriocinas resistentes ao aquecimento produzidas por quinze linhagens de Lactococcus lactis (14 L. lactis subsp. lactis e 1 L. lactis subsp. cremoris) foram sensíveis à enzimas proteolíticas e ativas em uma ampla faixa de pH. A resistência dessas bacteriocinas ao aquecimento foi fortemente influenciada pelo pH do meio. Somente a linhagem L. lactis subsp. lactis ITAL 383 produziu uma bacteriocina com um amplo espectro de atividade, semelhante ao da nisina de L. lactis subsp. lactis ATCC 11454. Esta bacteriocina inibiu as espécies relacionadas e outros microorganismos gram-positivos, inclusive Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus, mas não as bactérias Gram-negativas examinadas. A identificação do composto antimicrobiano parcialmente purificado por SDS-PAGE revelou um peso molecular similar entre a bacteriocina ITAL 383 e a nisina de L. lactis subsp lactis ATCC 11454.