A L-arginina na produção in vitro de embriões bovinos: perspectivas para o futuro / L-arginine in the in vitro production of bovine embryos: perspectives for the future

A L-arginina (L-arg) é o principal precursor da síntese do NO, contudo, é precursora também da síntese de creatina, agmatina, ureia, síntese proteica, L-ornitina, poliaminas, L-prolina e L-glutamato. Nesta breve revisão, vamos falar de alguns resultados que estão sendo obtidos sobre o papel da L-arg na capacitação de espermatozoides bovinos e seu impacto na produção in vitro de embriões. Estudos in vitro mostraram que a adição de L-arg ao meio de capacitação espermática está associada a um aumento na produção de NO, que se correlaciona com aumento da motilidade e vigor, integridade da membrana plasmática e acrossomal, atividade mitocondrial, capacitação espermática, peroxidação lipídica, bem como com a produção de blastocistos. Além disso, a adição da L-arg ao meio de capacitação in vitro, altera o perfil de proteínas importantes ligadas ao processo de capacitação, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial. Estes efeitos da L-arg são GMPc dependentes e independentes. Na maturação in vitro, entretanto, embora já tenham sido encontrados bons resultados com o uso do L-arg, mais estudos são necessários para determinar a concentração ideal a ser adicionada ao meio de maturação in vitro e seu impacto na produção de blastocistos. Visto que a pré-capacitação de espermatozoides induzida pela heparina em presença de L-arg foi o método mais eficiente na produção in vitro de embriões, sugerimos sua utilização. Mais pesquisas sobre o metabolismo da L-arg no espermatozoide e CCOs de bovinos durante eventos ligados à fertilização são necessários para se identificar novas vias que atuem nestas etapas in vitro visando o aumento da percentagem e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

L-arginine (L-arg) is the main source of NO synthesis; however, it is also a precursor of the synthesis of creatine, agmatine, urea, protein synthesis, L-ornithine, polyamines, L-proline, and Lglutamate. In this brief review, we will discuss some results obtained previously about the role of L-arg in the capacitation of bovine sperm and its impact on in vitro embryo production. In vitro studies have shown that the addition of L-arg to the sperm capacitation medium is associated with an increase in NO production, which in controlled levels is related to an increased motility and vigor, plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, sperm capacitation, peroxidation lipids, as well as with the blastocyst production. Furthermore, the addition of L-arg to the in vitro capacitation medium alters the profile of important proteins linked to the capacitation process, fertilization, and early embryonic development. These effects of L-arg are cGMP dependent and independent. In in vitro maturation, however, although good results have already been found with the use of L-arg, further studies are needed to determine the ideal concentration to be added to the in vitro maturation medium and its impact on the production of blastocysts. Since heparin-induced pre-capacitation of spermatozoa in the presence of L-arg was the most efficient method for in vitro embryo production, we suggest its use. More research on L-arg metabolism in bovine sperm and OCCs during events related to fertilization is needed to identify new pathways that act in these in vitro steps aiming to increase the percentage and quality of bovine embryos produced in vitro.

The variable success of in vitro maturation: can we do better?

The efficiency of in vitro assisted reproductive technologies, consisting of the transfer of embryos obtained in vitro through in vitro maturation, in vitro fertilization and early embryo culture is still limited. The quality of the oocytes is pivotal for assisted reproductive efficiency and the maturation of the oocyte represents the first key limiting step of the in vitro embryo production system. At the time of removal from the antral follicles, the oocyte is still completing the final growth and differentiation steps, needed to provide the so-called developmental competence, i.e. the machinery required to sustain fertilization and embryo development. In mono-ovular species only one oocyte per cycle is available for procreation, therefore the current assisted reproduction techniques strive to overcome this natural boundary. However, the success is still limited and overall the effectiveness does not exceed the efficiency achieved in millions of years of mammalian evolution. One of the problems lies in the intrinsic heterogeneity of the oocytes that are subjected to in vitro maturation and in the lack of dedicated in vitro approaches to finalize the differentiation process. In this review we will try to overview some of the salient aspects of current practices by emphasizing the most critical and fundamental features in oocyte differentiation that should be carefully considered for improving current techniques

The variable success of in vitro maturation: can we do better?

The efficiency of in vitro assisted reproductive technologies, consisting of the transfer of embryos obtained in vitro through in vitro maturation, in vitro fertilization and early embryo culture is still limited. The quality of the oocytes is pivotal for assisted reproductive efficiency and the maturation of the oocyte represents the first key limiting step of the in vitro embryo production system. At the time of removal from the antral follicles, the oocyte is still completing the final growth and differentiation steps, needed to provide the so-called developmental competence, i.e. the machinery required to sustain fertilization and embryo development. In mono-ovular species only one oocyte per cycle is available for procreation, therefore the current assisted reproduction techniques strive to overcome this natural boundary. However, the success is still limited and overall the effectiveness does not exceed the efficiency achieved in millions of years of mammalian evolution. One of the problems lies in the intrinsic heterogeneity of the oocytes that are subjected to in vitro maturation and in the lack of dedicated in vitro approaches to finalize the differentiation process. In this review we will try to overview some of the salient aspects of current practices by emphasizing the most critical and fundamental features in oocyte differentiation that should be carefully considered for improving current techniques(AU)

Participação da via L-arg/NO/GMPc na capacitação in vitro e seu impacto no perfil proteômico de espermatozoides bovinos

A L-arginina (L-arg) tem sido utilizada nos estudos em reprodução animal por ser precursora da síntese de óxido nítrico (NO). O NO por sua vez desempenha um papel importante em espermatozoides, nas vias de sinalização que levam à fosforilação de proteínas, evento necessário à capacitação espermática. Entretanto faltam estudos moleculares que caracterizem as proteínas relacionadas a esse processo e que justifiquem os efeitos positivos do NO observado em estudos anteriores na capacitação espermática in vitro em bovinos. Portanto, esse estudo teve por objetivo principal caracterizar o proteoma dos espermatozoides bovinos após a capacitação in vitro com adição de L-arg. Além disso, objetivou-se elucidar se os efeitos da L-arg durante a capacitação espermática de bovinos são relacionados à ativação da via NO/GMPc/PKG1. Em um primeiro estudo, objetivou-se caracterizar as proteínas, pela espectrometria de massas, de espermatozoides capacitados in vitro com L-arg ou não (controle) e relacionar esses achados com a qualidade espermática, avaliada pela integridade de membrana, atividade mitocondrial, motilidade/vigor espermático e percentual de capacitação. No segundo estudo, objetivou-se elucidar se o tratamento L-arg/NO durante a capacitação espermática in vitro de bovinos, tem ação pela via NO/GMPc/PKG1. Para isso, os espermatozoides foram tratados com L-arg, Rp-8-Br-PET-cGMPS (RP, inibidor seletivo da PKG1) ou o PTIO (quelante do NO), e o GMPc foi avaliado pelo ensaio de ELISA. Em ambos os estudos, os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste SNK com 5% de probabilidade. No primeiro estudo, todas as características de qualidade avaliadas foram melhores no grupo com L-arg em relação ao controle (P<0,05). Além disso, 367 proteínas foram encontradas, das quais 40 foram diferencialmente expressas entre o grupo com L-arg e o controle, e uma (AKAP3) foi expressa exclusivamente no grupo com L-arg (P<0,05). No segundo estudo, efeitos negativos foram encontrados nos espermatozoides tratados com PTIO e RP em relação ao controle na capacitação espermática (P<0,05), enquanto que na motilidade/vigor, o tratamento com PTIO teve a menor taxa em relação ao controle e demais tratamentos (P<0,05). Na dosagem do GMPc intracelular, observou-se que a concentração foi menor nos tratamentos PTIO e L-arg + PTIO, mas foi mais alto nos tratamentos RP e L-arg + RP em relação ao controle e à L-arg (P<0,05). Com esses resultados, podemos concluir que em bovinos: 1) o sistema L-arg/NO tem um papel importante sobre a qualidade espermática e capacitação espermática, mas independente da via GMPc/PKG1; e 2) foi observado um padrão diferencial de expressão de proteínas entre tratamento e controle, que pode estar diretamente ligado aos mecanismos moleculares envolvidos na ação da L-arg sobre a capacitação in vitro em bovinos.

L-arginine (L-arg) has been used in animal reproduction studies as a precursor of the synthesis of nitric oxide (NO). NO plays an important role in spermatozoa, in the signaling pathways that lead to protein phosphorylation, a necessary event for sperm capacitation. However, molecular studies that characterize the proteins related to this process and that justify the positive effects of NO observed in previous studies on in vitro sperm capacitation in cattle are lacking. Therefore, this study aimed to characterize the bovine sperm proteome after the in vitro capacitation with addition of L-arg. In addition, we aimed to elucidate whether the effects of L-arg during bovine sperm capacitation are related to NO/cGMP/PKG1 pathway activation. In a first study, the objective was to characterize the proteins by mass spectrometry of capacitated sperm in vitro with L-arg (treatment) or not (control) and to relate these findings with the sperm quality, evaluated by membrane integrity, mitochondrial activity, sperm motility/vigor and percentage of capacitation. In the second study, the objective was to elucidate whether the L-arg/NO treatment during the in vitro sperm capacitation of cattle, acts via NO/cGMP/PKG1 signaling pathway. For this, sperm were treated with L-arg, Rp-8-Br-PET-cGMPS (RP, selective inhibitor of PKG1) or PTIO (NO chelator) were used, and cGMP was evaluated by ELISA assay. In both studies, the data were submitted to analysis of variance and the means compared by the SNK test with 5% probability. In the first study, all the quality characteristics evaluated were better in the L-arg group compared to the control (P<0.05). In addition, 367 proteins were found, of which 40 were differentially expressed between L-arg group and control, and one (AKAP3) was expressed exclusively in the L-arg group (P<0.05). In the second study, negative effects were found in the sperm treated with PTIO and RP compared to the control in the sperm capacitation (P<0.05), whereas in the motility/vigor, the treatment with PTIO had the lowest rate compared to the control and other treatments (P<0.05). In the intracellular cGMP measurement, it was observed that the concentration was lower in the PTIO and L-arg + PTIO treatments, but was higher in the RP and L-arg + RP treatments compared to the control and L-arg (P<0.05). With these results, we can conclude that in bovines: 1) the L-arg/NO system plays an important role on sperm quality and sperm capacitation, but independent of the cGMP/PKG1 signaling pathway; and 2) a differential protein expression pattern was observed between treatment and control, which may be directly related to the molecular mechanisms involved in the action of L-arg on in vitro sperm capacitation in cattle.