Resumo
A resistência anti-helmíntica tem dificultado o controle de nematoides gastrintestinais em pequenos ruminantes. Dessa forma, novas alternativas de controle estão sendo estudadas, como o nanoencapsulamento de compostos bioativos, na tentativa de maximizar a eficácia parasitária desses compostos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade ovicida, larvicida e adulticida de nanoemulsões de carvona produzida por diferentes métodos de homogeneização sobre Haemonchus contortus. Três nanoemulsões de R-carvona foram preparadas usando dois equipamentos de homogeneização (ultra homogeneizador e sonicador) e com e sem revestimento de alginato de sódio: nanoemulsões de R-carvona sem revestimento homogeneizada em sonicador (NSR-son) e homogeneizadas em ultra homogeneizador (NSR- ultra) e R-carvona com revestimento de alginato de sódio (NCR-ultra). Foi realizada a análise de estabilidade, eficiência de encapsulamento e caracterizações físico-químicas das nanoemulsões. Os efeitos das nanoemulsões foi avaliado sobre H. contortus multirresistente no teste de eclosão de ovos (TEO), teste de desenvolvimento larvar (TDL) e teste de motilidade em adultos (TMA). As alterações na cutícula induzidas em H. contortus adultos foram avaliadas por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal de varredura a laser. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e comparados pelo teste Tukey (P<0,05). A concentração efetiva para inibir 50% da eclosão dos ovos e do desenvolvimento larvar (CE50) foi calculada no programa SPSS 17.0. NSR-ultra e NCR-ultra, foram mais estáveis frente à sedimentação e cremeação, respectivamente. Os tamanhos de partículas foram de 281,1 nm (NSR-son), 152,7 nm (NSR-ultra) e 557,8 nm (NCR-ultra) e os potenciais zeta de -15 mV (NSR-son), -10,8 mV (NSR-ultra) e -24,2 mV (NCR-ultra). A eficiência de encapsulamento foi de 99,84±0,01%. A microscopia eletrônica de varredura nas nanoemulsões detectou aumento no tamanho, distribuição não uniforme das partículas e presença de estruturas esféricas agregadas a rede polimérica. No TEO, as CE50 de NSR-son, NSR-ultra e NCR-ultra foram de 0,19 mg/mL, 0,02 mg/mL e 0,17 mg/mL, respectivamente. No TDL foram de 0,29 mg/mL, 0,31 mg/mL e 0,95 mg/mL para NSR-son, NSR-ultra e NCR- ultra, respectivamente. A inibição da motilidade de adultos foi de 100%, após 12h de exposição a NSR-ultra e NCR-ultra, enquanto que para NSR-son foi de 79,16%. A microscopia confocal e de varredura detectaram alterações na cápsula bucal e danos cuticulares. Conclui-se que as nanoemulsões de R-carvona com e sem revestimento de alginato de sódio produzidas por diferentes métodos de homogeneização causaram alterações morfológicas e inibiram a eclosão dos ovos, o desenvolvimento larvar e a motilidade de H. contortus adulto, sendo promissoras para controle de infecções por nematoides gastrintestinais em pequenos ruminantes após avaliações futuras no que se refere à segurança toxicológica desses produtos assim como a comprovação da eficácia anti-helmíntica in vivo.
Anthelmintic resistance has made it difficult to control gastrointestinal nematodes in small ruminants. Thus, new control alternatives are being studied, such as the nanoencapsulation of bioactive compounds, in an attempt to maximize the parasitic efficacy of these compounds. This work aimed to evaluate the ovicidal, larvicidal and adulticidal activity of carvone nanoemulsions produced by different homogenization methods on Haemonchus contortus. Three R-carvone nanoemulsions were prepared using two homogenization equipment (ultra homogenizer and sonicator) and with and without sodium alginate coating: uncoated R-carvone nanoemulsions homogenized in sonicator (UNAlg-son) and homogenized in ultra homogenizer (UNAlg-ultra) and sodium alginate coated R-carvone (CNAlg-ultra). Stability analysis, encapsulation efficiency and physicochemical characterizations of the nanoemulsions were performed. The of the nanoemulsions were evaluated on multidrug resistant H. contortus in the egg hatch test (EHT), larval development test (LDT) and adult worm motility test (AWMT). Changes in cuticle induced in adult H. contortus were evaluated by means of scanning electron microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy. The results were submitted to analysis of variance (ANOVA) and compared using the Tukey test (P<0.05). The effective concentration to inhibit 50% of egg hatching and larval development (EC50) was calculated using the SPSS 17.0 program. UNAlg-ultra and CNAlg-ultra were more stable against sedimentation and creamation, respectively. The particle sizes were 281.1 nm (UNAlg-son), 152.7 nm (UNAlg-ultra) and 557.8 nm (CNAlg-ultra) and the zeta potentials were -15 mV (UNAlg-son), - 10.8 mV (NSR-ultra) and -24.2 mV (CNAlg-ultra). The encapsulation efficiency was 99.84±0.01%. Scanning electron microscopy of the nanoemulsions detected an increase in size, non-uniform distribution of particles and presence of spherical structures aggregated to the polymeric network. In EHT, the EC50 of UNAlg-son, UNAlg-ultra and CNAlg-ultra were 0.19 mg/mL, 0.02 mg/mL and 0.17 mg/mL, respectively. In LDT they were 0.29 mg/mL, 0.31 mg/mL and 0.95 mg/mL for UNAlg- son, UNAlg-ultra and CNAlg-ultra, respectively. The adult motility inhibition was 100% after 12h of exposure to UNAlg-ultra and CNAlg-ultra, while for UNAlg-son it was 79.16%. Confocal and scanning microscopy detected changes in the buccal capsule and cuticular damage. It is concluded that R-carvone nanoemulsions with and without sodium alginate coating produced by different homogenization methods caused morphological changes and inhibited egg hatching, larval development and adult motility of H. contortus, being promising for control of infections by gastrointestinal nematodes in small ruminants after further evaluations regarding the toxicological safety of these products as well as proof of anthelmintic efficacy in vivo.
Resumo
O controle de nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes é realizado convencionalmente com a administração de anti-helmínticos sintéticos e semissintéticos. Entretanto, o uso inadequado de determinado anti-helmíntico, seleciona indivíduos que possuem a capacidade de sobreviver a esse quimioterápico tornando essencial a busca por métodos alternativos. Os produtos derivados de plantas têm sido amplamente investigados quanto ao seu potencial anti-helmíntico sobre Haemonchus contortus. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos dos óleos essenciais de quimiotipos carvona (CV) e citral (CT) de Lippia alba sobre H. contortus. A caracterização química foi feita por meio de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG/MS). O efeito anti-helmíntico dos óleos essenciais foi avaliado no teste de eclosão de ovos (TEO) e teste de motilidade de nematoides adultos (TMA), utilizando um isolado de H. contortus multirresistente, Kokstad. Foi realizada microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) dos ovos e adultos de H. contortus e microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos adultos após tratamento com os óleos para observações qualitativas de seus efeitos. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e comparados pelo teste Tukey (P>0,05). A concentração inibitória de 50% (CE50) para o TEO foi calculada a partir do programa SPSS 17.0 program for Windows. Os resultados demonstraram a existência de dois quimiotipos, CV e CT do óleo essencial de L. alba (La). O quimiotipo CV do óleo essencial de L. alba (LaCV) apresentou 70,2% de CV e o quimiotipo CT do óleo essencial de L. alba (LaCT) estava constituído por 20,40% e 29,49% de neral e geranial, respectivamente. No TEO, a CE50 de LaCV e LaCT foi de 0,2 e 0,3mg/mL, respectivamente. No TMA, após 12h de exposição ao LaCV e LaCT, 100% dos nematoides adultos estavam imóveis. A MCVL evidenciou alterações na motilidade da larva dentro do ovo provocada por LaCV, enquanto que LaCT impediu a formação da larva. Nos adultos expostos aos dois óleos foram observadas aparentes alterações na porção anterior, em nível de esôfago. Na MEV foram observadas alterações morfológicas na porção anterior, cápsula bocal e na porção medial. Conclui-se que os dois óleos essenciais de L. alba causaram aparentes alterações morfológicas e inibiram a eclosão de ovos, assim como a motilidade de nematoides adultos de H. contortus. Porém é importante avaliar o efeito in vivo, para identificar níveis seguros de eficácia e toxicidade antes de confirmar sua utilização como antihelmíntico.
The control of gastrointestinal nematodes in small ruminants is carried out conventionally with the administration of synthetic and semi-synthetic anthelmintics. However, the inappropriate use of a certain anthelmintic, selects individuals who have the capacity to survive this chemotherapy, making the search for alternative methods essential. Plant derived products have been extensively investigated for their anthelmintic potential on H. contortus. The aim of the present study was to evaluate the effects of the essential oils of Lippia alba chemotypes carvone (CV) and citral (CT) on H. contortus. Chemical characterization was done by means of gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG/MS). The anthelmintic effect of essential oils was assessed in the egg hatch test (EHT) and adult nematode motility test (ANMT), using a multidrug-resistant H. contortus isolate, Kokstad. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of eggs and adults of H. contortus and scanning electron microscopy (SEM) of adults was performed after treatment with oils for qualitative observations of their effects. The results were submitted to analysis of variance (ANOVA) and compared by the Tukey test (P> 0.05). The 50% inhibitory concentration (EC50) for EHT was calculated using the SPSS 17.0 program for Windows. The results demonstrated the existence of two chemotypes, CV and CT of the essential oil of L. alba (La). The chemotype CV of the essential oil of L. alba (LaCV) presented 70.2% of CV and the chemotype CT of the essential oil of L. alba (LaCT) was constituted by 20.40% and 29.49% of neral and geranial, respectively. In the EHT, the EC50 of LaCV and LaCT was 0.2 and 0.3 mg/mL, respectively. In ANMT, after 12h of exposure to LaCV and LaCT, 100% of adult nematodes were immobile. CLSM showed changes in the larval motility inside the egg caused by LaCV, while LaCT promoted changes in the larva formation. In adults exposed to both oils, apparent changes were observed in the anterior portion, at the level of the esophagus. In SEM, morphological changes were observed in the anterior portion, mouthpiece and medial portion. It is concluded that the two oils of L. alba, chemotypes CV and CT, caused apparent morphological changes and inhibited the hatching of eggs, as well as the motility of adult H. contortus nematodes. However, it is important to evaluate the effect in vivo to identify safe levels of efficacy and toxicity before confirming its use as an anthelmintic.