Citoinclusão de capa leucocitária e medula óssea de cães: padronização da técnica / Cell block of canine buffy coat and bone marrow in paraffin blocks: technique standardization

A técnica de citoinclusão é amplamente utilizada e reconhecida por profissionais da área da saúde, em particular médicos patologistas, porém as informações sobre a aplicação desse método em medicina veterinária ainda são raras. Análises citológicas de medula óssea e da capa leucocitária (porção do sangue formada por concentrados de leucócitos) são amplamente utilizadas no diagnóstico de patologias de origem neoplásica e não neoplásica e de agentes infecciosos. Embora a importância do uso da técnica seja amplamente reconhecida, não há registro da utilização de amostras citológicas de medula óssea e capa leucocitária na confecção de citoinclusões em blocos de parafina, como meio de diagnóstico no segmento médico veterinário. Assim, este trabalho tem como objetivo elaborar um protocolo de citoinclusão em parafina para amostras citológicas de medula óssea e capa leucocitária de cães. Foram submetidas à técnica de citoinclusão 110 amostras de capa leucocitária e 44 de medula óssea de cães portadores ou não de enfermidade sistêmica, sendo que em 68% destas, tanto para a capa leucocitária quanto para a medula óssea, as amostras se mostraram viáveis. A utilização do álcool 95% como fixador e de etapas no processamento histológico de 20 minutos (álcool absoluto, xilol e parafina, três banhos cada) foi crucial para a qualidade dos cortes histológicos e para a análise microscópica dos espécimes corados pela hematoxilina-eosina. A separação mecânica da capa leucocitária e a centrifugação do aspirado de medula óssea foram eficientes e de baixo custo no preparo das citoinclusões. Ressalta-se a importância na padronização da técnica de citoinclusão, em particular para amostras de capa leucocitária e medula óssea, visando à obtenção de espécimes de qualidade independentemente das limitações de equipamentos.(AU)

The cell block technique is widely used and recognized by health professionals, but lacks in information regarding the specific contribution of this method to veterinary medicine. The cytology of bone marrow and buffy coat (cellular portion of the hole blood) are widely used in the diagnosis of neoplastic and non-neoplastic diseases, and also for the detection of infectious agents. Although the importance of these samples is widely recognized, there is no information about the use of buffy coat and bone marrow samples in the cell block procedure among the research material used for this paper. This work aims for the cell block standardization for canine buffy coat and bone marrow samples. We collected 110 buffy coat samples and 44 bone marrow samples for the cell block preparation, and 68.2% of buffy coat and bone marrow proved to be viable at the end of the procedure. The 95% ethanol fixatives along with the 20 minute processing steps (absolute ethanol, xilol and paraffin, 3 of each) were crucial for the quality of the material both in microtomy and optical microscopy. Mechanical separation of the buffy coat proved to be easy and cheap and was used to compose the cell block technique. In this research we emphasized the importance of cell block standardization in order to develop and easy, inexpensive and reproducible method, regardless of any of the professionals' limitations.(AU)

Emprego do cell block de agarose como método complementar no diagnóstico citológico de tumores mamários caninos

The breast tumors are common neoplasms in several species, with high incidence in dogs. The high frequency and aggressiveness of these cases justifies the search for rapid, low cost and less invasive diagnostic methods, seeking for surgical approach and appropriate therapy. This study evaluated the appropriateness of the use of the agarose cell block technique as a diagnostic tool to complement traditional smears in the diagnosis of these processes. Therefore, it was obtained 51 samples from 30 dogs with breast tumors that underwent tumoral excision at the HOVET-UMESP, comparing the results obtained from smears, cell blocks, alone and in association (smears cell blocks-1), with the histopathologic diagnosis. The best results were obtained with the association of smears and cell block analysis, reducing the false negative results and increasing the cyto-histological correlation, reinforcing the importance of the use of cytology in routine veterinary oncology.

Os tumores mamários são neoplasias comuns em diversas espécies, sendo os processos oncológicos de maior incidência em cães. A elevada frequência e agressividade desses processos justificam a busca de métodos diagnósticos e prognósticos rápidos, de custo reduzido e menor invasividade, visando a uma abordagem cirúrgica e terapêutica adequada. O presente estudo avaliou a adequação da utilização da técnica de cell block de agarose como método diagnóstico complementar aos esfregaços tradicionais no diagnóstico desses processos. Para tanto, foram obtidas 51 amostras citológicas de tumores mamários de 30 cadelas que passaram por excisão tumoral no HOVET-UMESP, comparando-se os resultados obtidos a partir dos esfregaços, de cell blocks, e de sua associação (esfregaços cell blocks-1) com o diagnóstico histopatológico. Os melhores resultados foram obtidos mediante a associação dos métodos, reduzindo os resultados falso-negativos e elevando a correlação cito-histológica, reforçando a importância da citologia na rotina oncológica veterinária.

Emprego do cell block de agarose como método complementar no diagnóstico citológico de tumores mamários caninos

The breast tumors are common neoplasms in several species, with high incidence in dogs. The high frequency and aggressiveness of these cases justifies the search for rapid, low cost and less invasive diagnostic methods, seeking for surgical approach and appropriate therapy. This study evaluated the appropriateness of the use of the agarose cell block technique as a diagnostic tool to complement traditional smears in the diagnosis of these processes. Therefore, it was obtained 51 samples from 30 dogs with breast tumors that underwent tumoral excision at the HOVET-UMESP, comparing the results obtained from smears, cell blocks, alone and in association (smears cell blocks-1), with the histopathologic diagnosis. The best results were obtained with the association of smears and cell block analysis, reducing the false negative results and increasing the cyto-histological correlation, reinforcing the importance of the use of cytology in routine veterinary oncology.

Os tumores mamários são neoplasias comuns em diversas espécies, sendo os processos oncológicos de maior incidência em cães. A elevada frequência e agressividade desses processos justificam a busca de métodos diagnósticos e prognósticos rápidos, de custo reduzido e menor invasividade, visando a uma abordagem cirúrgica e terapêutica adequada. O presente estudo avaliou a adequação da utilização da técnica de cell block de agarose como método diagnóstico complementar aos esfregaços tradicionais no diagnóstico desses processos. Para tanto, foram obtidas 51 amostras citológicas de tumores mamários de 30 cadelas que passaram por excisão tumoral no HOVET-UMESP, comparando-se os resultados obtidos a partir dos esfregaços, de cell blocks, e de sua associação (esfregaços cell blocks-1) com o diagnóstico histopatológico. Os melhores resultados foram obtidos mediante a associação dos métodos, reduzindo os resultados falso-negativos e elevando a correlação cito-histológica, reforçando a importância da citologia na rotina oncológica veterinária.

Emprego do cell block de agarose como método complementar no diagnóstico citológico de tumores mamários caninos

The breast tumors are common neoplasms in several species, with high incidence in dogs. The high frequency and aggressiveness of these cases justifies the search for rapid, low cost and less invasive diagnostic methods, seeking for surgical approach and appropriate therapy. This study evaluated the appropriateness of the use of the agarose cell block technique as a diagnostic tool to complement traditional smears in the diagnosis of these processes. Therefore, it was obtained 51 samples from 30 dogs with breast tumors that underwent tumoral excision at the HOVET-UMESP, comparing the results obtained from smears, cell blocks, alone and in association (smears cell blocks-1), with the histopathologic diagnosis. The best results were obtained with the association of smears and cell block analysis, reducing the false negative results and increasing the cyto-histological correlation, reinforcing the importance of the use of cytology in routine veterinary oncology.

Os tumores mamários são neoplasias comuns em diversas espécies, sendo os processos oncológicos de maior incidência em cães. A elevada frequência e agressividade desses processos justificam a busca de métodos diagnósticos e prognósticos rápidos, de custo reduzido e menor invasividade, visando a uma abordagem cirúrgica e terapêutica adequada. O presente estudo avaliou a adequação da utilização da técnica de cell block de agarose como método diagnóstico complementar aos esfregaços tradicionais no diagnóstico desses processos. Para tanto, foram obtidas 51 amostras citológicas de tumores mamários de 30 cadelas que passaram por excisão tumoral no HOVET-UMESP, comparando-se os resultados obtidos a partir dos esfregaços, de cell blocks, e de sua associação (esfregaços cell blocks-1) com o diagnóstico histopatológico. Os melhores resultados foram obtidos mediante a associação dos métodos, reduzindo os resultados falso-negativos e elevando a correlação cito-histológica, reforçando a importância da citologia na rotina oncológica veterinária.

Imunofenotipagem do linfoma canino pela técnica da imunocitoquímica (cell block).

O linfoma canino é uma das neoplasias hematopoiéticas mais freqüentes na rotina do médico veterinário. Os animais podem apresentar diferentes formas clínicas, estadio e sub-estadio. Considerada uma doença heterogênea, o linfoma é classificado a partir do seu imunofenótipo para em seguida ser sub-classificado. Conhecer o imunofenótipo é importante para o diagnóstico, para o prognóstico e tratamento. A imunofenotipagem na maioria dos casos é realizada pela imunohistoquímica (IHQ), através de um fragmento de tecido obtido pela biopsia. Para a realização da biópsia os pacientes precisam ser submetidos a cirurgia porém nem sempre apresentam condições clínicas. A busca por um diagnóstico precoce, pouco invasivo, e com menor custo tem sido motivada em diversas doenças. Uma modalidade ainda pouco explorada na medicina veterinária é a realização do cell block (CB), técnica que permite a emblocagem do material de origem citológica para a realização de exames complementares, incluindo a imunocitoquímica (ICQ). O objetivo deste trabalho foi realizar a imunofenotipagem do linfoma canino através ICQ pela técnica do CB. Foram utilizadas 54 amostras de cães com linfoma de diferentes apresentações clínicas. As amostras da ICQ foram comparadas com as amostras de IHQ provenientes do mesmo tecido. A ICQ pela técnica do CB apresentou uma acurácia de 87,04%, e o valor de Kappa de 0,6986 (p. <0,001). Na análise específica por classe, as classificações de células T ou B tiveram altos valores de Kappa, acurácia, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Não foram identificados animais do imunofenótipo não T não B (nulo). A utilização do cell block foi considerada uma técnica válida para realização da imunofenotipagem do linfoma canino e auxílio diagnóstico. O CB poderá ser implantado na rotina diagnóstica oferecendo informação prognóstica e melhorando o diagnóstico definitivo de uma maneira rápida, simples, econômica e eficaz.

Canine lymphoma is one of the most frequent hematopoietic neoplasms in veterinary routine. Animals may have different clinical presentations, stage and sub-stage. Lymphoma is considered a heterogeneous disease, classified by immunophenotype and then sub-classified. Immunophenotype knowledge is important for diagnosis and prognosis. Immunophenotyping, in most cases, is done by means of immunohistochemistry (IHC), using a tissue fragment obtained from biopsy. Patients are often in poor condition to undergo surgery, so it is not always possible to obtain a tissue sample for biopsy. The search for an early, less invasive, and low-cost diagnosis has been motivated in several pathologies. A modality not yet explored in veterinary medicine is the cell block (CB), a technique that allows a re-embedding of material of cytological origin for complementary exams, including immunocytochemistry (ICQ). The objective of this study was to perform immunophenotyping of canine lymphoma through ICQ using CB technique. Fifty-four samples from dogs with different clinical presentations were used. ICQ samples were compared with IHC samples from the same tissue. ICQ from CB technique had 87.04% accuracy, and Kappa value of 0.6986 (p<0.001). In class-specific analysis, such as T, B or mixed cell classification, ICQ had high values of Kappa, accuracy, sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value. No animals of the non-T non-B immunophenotype (null) were identified. Cell block was designed for canine lymphoma immunophenotyping and to aid in diagnosis. CB can be implemented in the diagnostic routine, providing prognostic information and improving definitive diagnosis in a fast, simple, inexpensive and effective way.

COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES TÉCNICAS DE AVALIAÇÃO DE MEDULA ÓSSEA PARA O DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

ANTUNES, T.R. Comparação entre diferentes técnicas de avaliação de medula óssea para o diagnóstico parasitológico de leishmaniose visceral canina. 2016. 61p. Dissertação de Mestrado Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil, 2016. O objetivo com este estudo foi comparar as técnicas de citologia aspirativa, biopsia e citobloco para identificação e quantificação parasitológica de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em medula óssea de cães. Amostras de tecido medular de 26 animais, em diferentes estágios clínico-laboratorial da doença, foram estudadas obedecendo os mesmos critérios de investigação nas técnicas de citologia aspirativa, biopsia e citobloco. O menor número de campos para a confirmação parasitológica foi constatado no esfregaço direto obtido por citologia aspirativa. O estágio clínico-laboratorial não influenciou no número de campos necessários para a primeira visualização do agente em nenhuma das técnicas (p>0,05) e menor intensidade parasitária foi observada nas lâminas de citobloco. As técnicas de citologia aspirativa e biopsia concordaram na estimativa do coeficiente de infectividade no tecido estudado (p<0,05). Apesar da técnica de citobloco permitir a concentração de células e melhor reaproveitamento de amostras, não demonstrou ser um método adequado para rápida identificação e quantificação parasitológica na leishmaniose visceral canina. Considerando suas vantagens, a citologia aspirativa foi o melhor método para detecção microscópica

ANTUNES, T.R. Comparison between different techniques of bone marrow evaluation for parasitological diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis. 2016. 61p. Master dissertation Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Federal University of Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brazil, 2016. The aim of the present study was to compare the aspiration cytology, biopsy and cell block techniques for identification and parasitological quantification of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi in dogs bone marrow. Bone marrow tissue samples from 26 animals, in different clinical-laboratory stages of the disease, were studied according to the same criteria of investigation in the aspiration cytology, biopsy and cell block techniques. The lowest number of fields for the parasitological confirmation was found in the direct smear obtained by aspiration cytology. The clinical-laboratory stage did not influence the number of fields required for the first visualization of the agent in any of the techniques (p>0.05) and less parasitic intensity was observed in the cell block slides. The aspiration cytology and biopsy techniques agreed on the estimation of infectivity coefficient in the tissue studied (p<0.05). Although the cell block technique allows the concentration of cells and better reutilization of samples, it has not been shown to be an adequate method for rapid identification and parasitological quantification in canine visceral leishmaniasis. Considering its advantages, aspiration cytology was the best method for microscopic detection of the parasite and determination of the level of parasite intensity in the tissue studied.

SENSIBILIDADE DA CITOINCLUSÃO PARA O DIAGNÓSTICO DE OSA EM CÃES

O Osteossarcoma (OSA) refere-se ao tumor ósseo mais comum em cães. A citoinclusão compreende o ato de inserir amostras citológicas em blocos de parafina, auxiliando na qualidade do diagnóstico citológico e obtendo espécimes de reserva para serem utilizadas em outras técnicas, incluindo imunoistoquímica. Com o intuito de avaliar a sensibilidade, especificidade e descrição da técnica de citoinclusão no diagnóstico de OSA de ossos longos de cães, 11 cães de oito a 13 anos com diagnóstico de OSA foram submetidos a exames citológicos, histopatológicos e, técnica da citoinclusão. Para a citoinclusão, foi feita a punção do tumor, fixação com 1mL de álcool a 95%, deixado em repouso por cinco minutos na própria seringa e, aspirou-se aproximadamente 9 mL de formol a 10% e manteve-se fixado por mais 24 horas, mantendo a seringa posicionada para cima para decantação das células. Como imunomarcador, utilizou-se a osteopontina. Em razão da maior preservação arquitetural, a avaliação a partir das amostras de citoinclusão, verificou-se parte de relações arquiteturais mais bem estabelecidas do que em amostras de esfregaços, auxiliando na caracterização do processo. Houve concordância da citoinclusão com a histopatologia e marcação imunoistoquímica de osteopontina positiva com alta sensibilidade e especificidade. É possível afirmar, que a técnica de citoinclusão é eficaz, segura para pesquisa de marcadores prognósticos de tumores ósseos em menor espaço de tempo e baixo custo podendo ser utilizada em clínicas e hospitais veterinários, em rotina, obtendo um material possível de ser arquivado, permitindo o uso de outras técnicas como a imunoistoquímica.

Osteosarcoma (OSA) refers to the most common bone tumor in dogs. Cell Block involves the insertion of cytological specimens into paraffin blocks, aiding in the quality of the cytologic diagnosis and obtaining reserve specimens for use in other techniques, including immunohistochemistry. In order to evaluate the sensitivity, specificity and description of the Cell Block technique in the diagnosis of OSA of long dog bones, 11 dogs from 8 to 13 years old with OSA diagnosis were submitted to cytological, histopathological and Cell Block tests. For Cell Block, the tumor was punctured, fixated with 1mL of alcohol at 95%, allowed to stand for five minutes in the syringe itself, and approximately 9 mL of 10% formalin was aspirated and held for a further 24 Hours, keeping the syringe positioned upward for decantation of the cells. As an immunodiner, osteopontin was used. Due to the greater architectural preservation, the evaluation from the Cell Block samples, was verified part of architectural relations more well established than in swab samples, helping in the characterization of the process. There was concordance of the Cell Block with the histopathology and immunohistochemical labeling of positive osteopontin with high sensitivity and specificity. It is possible to affirm that the technique of Cell Block is effective, safe for research of prognostic markers of bone tumors in less time and at low cost, being able to be used in routine veterinary clinics and hospitals, obtaining a possible material to be archived, allowing The use of other techniques such as immunohistochemistry.