Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária.

Effect of follicular diameter, time of first cleavage and H3K4 methylation on embryo production rates of Bos indicus cattle / Efeito do diâmetro folicular, momento da primeira clivagem e metilação da H3K4 na produção embrionária de vacas Bos indicus

This study aimed investigate the relationship between epigenetics, follicular diameter and cleavage speed, by evaluating the developmental potential and occurence of H3K4 monomethylation of early-, intermediate- and late-cleaving Bos indicus embryos from in vitro fertilized oocytes originating from follicles up to 2 mm in diameter or between 4 and 8 mm in diameter. Oocytes (n = 699) from small follicles (? 2 mm) and 639 oocytes from large follicles (4-8 mm) were punched from 1,982 Bos indicus slaughterhouse ovaries. After maturation and in vitro fertilization (IVF), the cultured embryos were separated into early (? 28 h post-IVF), intermediate (> 28 h and ? 34 h post-IVF) and late (> 34 h and ? 54 h post-IVF) cleavage groups. Blastocysts were subjected to an immunofluorescence assessment for H3K4me investigation. The blastocyst rate for large follicles (36.3%) was higher than that for small follicles (22.9%, P 0.05). In addition, blastocyst rates for early and intermediate cleavage groups (45.3% and 33.8%, respectively) were higher than that for late cleavage group (13.5%, P 0.05). The blastocysts from all groups displayed H3K4me staining by immunofluorescence, particularly intense in what seemed to be trophectoderm cells and weak or absent in cells seemingly from the inner cell mass. For the first time for indicus embryos, data from this study demonstrate that higher blastocyst embryorates are obtained from embryos that cleave within 34 h after fertilization and from those produced fromfollicles of 4-8 mm in diameter, indicating a greater ability of these embryos to develop to the stage ofembryonic preimplantation. This is the first article demonstrating the occurrence of H3K4me in cattleembryos; its presence in all the evaluated blastocysts suggests that this histone modification plays a keyrole in maintaining embryo viability at preimplantation stage.(AU)

Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre a epigenética, o diâmetro folicular e a velocidade de clivagem, avaliando o potencial de desenvolvimento e a ocorrência de monometilação da H3K4 em embriões Bos indicus de clivagem precoce, intermediária e tardia produzidos a partir de oócitos fertilizados in vitro oriundos de folículos de até 2 mm de diâmetro ou entre 4 e 8 mm de diâmetro. Oócitos (n = 699) de folículos pequenos (? 2 mm) e 639 oócitos de folículos grandes (4-8 mm) foram puncionados de 1982 ovários de vacas Bos indicus de abatedouro. Após a maturação e fertilização in vitro (FIV), os embriões cultivados foram separados nos grupos de clivagem precoce (? 28 h pós-FIV), intermediária (> 28 h e ? 34 h pós-FIV) e tardia (> 34 h e ? 54 h pós-FIV). Os blastocistos foram submetidos à imunofluorescência para investigação de H3K4me. A taxa de blastocisto para embriões provenientes de folículos grandes (36,3%) foi maior que de folículos pequenos (22,9%; p 0,05). Ainda, as taxas de blastocisto para os grupos de clivagem precoce e intermediária (45,3% e 33,8%, respectivamente) foram maiores que para o grupo de clivagem tardia (13,5%; p 0,05). Blastocistos de todos os grupos mostraram marcação para H3K4me à imunofluorescência, particularmente intensa no que pareciam ser células do trofectoderma e fraca ou ausente em células semelhantes às da massa massa celular interna. Pela primeira vez em embriões indicus, os dados deste estudo demonstram que maiores taxas deblastocisto são obtidas de embriões que clivam em até 34 h pós-fertilização e dos oriundos de folículos de 4 a 8 mm de diâmetro, indicando uma maior habilidade desses embriões de se desenvolverem até o estágio de pré-implantação embrionária. (AU)

QUALIDADE DE OÓCITOS DE VACAS LEITEIRAS E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES A PARTIR DE OÓCITOS MATURADOS IN VITRO COM MELATONINA

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos aspirados de vacas leiteiras sobre a taxa de clivagem (TC), a produção e a qualidade de embriões. Adicionalmente, objetivou-se estabelecer uma associação entre qualidade oocitária e grupamento genético, considerando as variáveis fisiológicas e ambientais obtidas durante o experimento. Os oócitos foram obtidos em 52 sessões de ovum pick-up (OPU) realizadas no verão e na primavera, em três fazendas. Em cada sessão de OPU as variáveis climáticas (temperatura e umidade do ar) e os parâmetros fisiológicos das vacas (frequência respiratória, temperatura retal e superficial, produção de leite e dias em leite DEL) foram aferidos. No total foram realizadas 29 sessões de aspiração em vacas Holandês (H; n = 15, fazenda 1) e 23 sessões em vacas mestiças Holandês x Zebu (HZ; n = 16, fazenda 2; n = 7, fazenda 3). Os oócitos obtidos foram classificados de acordo com sua qualidade em excelentes, bons, regulares, desnudos e degenerados. Oócitos obtidos no verão, exceto degenerados, foram distribuídos a um de três tratamentos: 0 mol/L (controle), 10-6 ou 10-4 mol/L de melatonina na MIV. A TC foi avaliada no dia 3 (D3) após a fertilização in vitro (FIV) e a produção de embriões no D8. A qualidade dos blastocistos foi avaliada pela contagem do número de células e de células apoptóticas. O índice temperatura-umidade (ITU) foi de 79,0 ± 1.4 na fazenda 1; 77,7 ± 3,2 na fazenda 2 e 68,5 ± 1,8 na fazenda 3. As variáveis fisiológicas não diferiram (P > 0,05) entre os grupamentos genéticos (frequência respiratória - movimentos/minuto): H = 74,2 ± 10,5 e HZ = 53,4 ± 6,9; temperatura retal (°C): H = 38,3 ± 0,3 e HZ = 38,3 ± 0,2; temperatura superficial (°C): H = 36,6 ± 1,4 e HZ = 36,9 ± 0,9). O grupamento genético influenciou a qualidade oocitária (P < 0,05). As proporções de oócitos grau 1 (H = 3,2 ± 1,2; HZ = 27,6 ± 4,6; P < 0,0001) e grau 2 (H = 1,6 ± 0,6; HZ = 12,9 ± 2,2; P < 0,0001) foram menores e a proporção de degenerados foi maior (H = 5,2 ± 1,5; HZ = 1,7 ± 0,6; P 0,05) nas vacas Holandesas. A frequência respiratória foi negativamente (P < 0,05) associada a oócitos grau 1 e positivamente associada a oócitos grau 2. DEL foi positivamente associado (P < 0.05) a oócitos grau 1 e negativamente associado a oócitos degenerados. A proporção de oócitos viáveis (graus 1 e 2) foi menor (P < 0,0001) nas vacas Holandesas do que em mestiças. Umidade do ar e frequência respiratória foram negativamente associadas (P < 0,01) a oócitos bons. A interação (P = 0,03) entre os efeitos de fazenda e tratamento sobre a taxa de clivagem foi observada, sendo que somente na fazenda 1, a concentração 10-4 mol/L aumentou (P < 0,09) a TC (70,0 ± 17,0%) comparada ao controle (22,0 ± 15,6%) e somente na fazenda 2, a TC foi aumentada (P < 0,09) pela melatonina na concentração 10-6 mol/L (50,0 ± 20,3%) comparada ao controle (20,0 ± 13,5%). Em conclusão, os parâmetros fisiológicos não diferiram entre os grupamentos genéticos, mas vacas mestiças produziram oócitos de qualidade superior em relação às Holandesas. A adição de melatonina ao meio de MIV pode ser uma estratégia para aumentar a taxa de clivagem dos embriões produzidos de vacas leiteiras lactantes durante o verão. Porém, a dose a ser adicionada difere de acordo com o grupamento genético, sendo maior para vacas Holandesas do que para vacas mestiças HZ.

The objective of this study was to evaluate the effect of the addition of melatonin to the in vitro maturation (IVM) medium of bovine oocytes aspirated from dairy cows on cleavage rate (CR), embryo production and quality. Additionally, we aimed to establish an association between oocyte quality and genetic groups, considering the physiological and environmental variables recorded throughout the trial. Oocytes were obtained in 52 ovum pick-up (OPU) sections performed during summer and spring in three farms. In each OPU section, environmental variables (temperature and relative humidity) and physiological parameters of cows (respiratory frequency, rectal and superficial temperature, milk production and days in milk DIM) were obtained. Overall, 29 OPU sections were performed in Holstein cows (H; n = 15, farm 1) and 23 aspirations were performed in crossbred Holstein x Zebu - HZ (n = 16, farm 2; n = 7, farm 3). Oocytes obtained were classified according to its quality in excellent, good, regular, denuded and degenerate. Oocytes obtained during summer, except degenerate, were distributed to one of three treatments: 0 mol/L (control), 10-6 mol/L or 10-4 mol/L of melatonin in IVM. CR was evaluated on day 3 (D3) after in vitro fertilization (IVF), and embryo production on day 8 (D8). Quality of blastocysts was evaluated through count of embryo cell number and apoptotic cell number. The temperature-humidity index (THI) was 79.0 ± 1.4 on farm 1; 77.7 ± 3.2 on farm 2; and 68.5 ± 1.8 on farm 3. Physiological variables did no differ (P > 0.05) between genetic groups (respiratory frequency movements/minute): H = 74.2 ± 10.5; HZ = 53.4 ± 6.9; rectal temperature (°C) H = 38.3 ± 0.3; HZ = 38.3 ± 0.2; superficial temperature H = 36.6 ± 1.4; HZ = 36.9 ± 0.9). Genetic group influenced oocyte quality (P < 0.05). The proportions of grade 1 (H = 3.2 ± 1.2; HZ = 27.6 ± 4.6; P < 0.0001) and grade 2 (H = 1.6 ± 0.6; HZ = 12.9 ± 2.2; P < 0.0001) oocytes were lower and the proportion of degenerate (H = 5.2 ± 1.5; HZ = 1.7 ± 0.6; P = 0.05) was greater in Holstein cows. The covariate respiratory frequency was significative (P < 0.05) and negatively associated to grade 1 oocytes and positively associated to grade 2 oocytes. DIM was significative (P < 0.05) and positively associated to grade 1 oocytes and negatively associated to degenerate oocytes. The proportion of viable oocytes (grade 1 and 2) was lower (P < 0.0001) in Holstein than in HZ-crossbred. Relative humidity and respiratory frequency were significative (P < 0.01) and negatively associated to good oocytes. An interaction (P = 0.03) between the effects of farm and treatment regarding CR was observed. Only on farm 1, the concentration 10-4 mol/L increased (P <0.09) the CR (70.0 ± 17.0%) compared to control (22.0 ± 15.6%), and only on farm 2, CR was increased (P < 0.09) by melatonin in the concentration 10-6 mol/L (50.0 ± 20.3%) compared to control (20.0 ± 13.5%). In conclusion, physiological parameters did not differ between genetic groups, but HZ crossbreds cows produced greater quality oocytes in comparison to Holstein. The addition of melatonin to the IVM medium may be a strategy to increase CR of embryos produced from lactating dairy cows during summer. However, the dose to be added differs according to genetic group, and it is greater from Holstein than crossbred HZ cows.

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS SUPLEMENTADA COM ANTIOXIDANTES: EFEITOS NO DESENVOLVIMENTO EMBRI-ONÁRIO E NA TAXA DE PRENHEZ

No primeiro experimento foram utilizados oócitos de ovários de abatedouro distribuídos em seis grupos: 1) Maturação e Cultivo in vitro sem adição de antioxidantes (Ct-Ct); 2) Maturação com 2 M de quercetina (Qc-Ct); 3) Cultivo com 2 M de quercetina (Ct-Qc); 4) Maturação e Cultivo com 2 M de quercetina (Qc-Qc); 5) Maturação com 100 M de cisteamina e Cultivo com de 2 M de quercetina (Cis-Qc) e 6) Maturação com cisteamina (Cis-Ct). Com base no primeiro experimento, os oócitos provenientes de Ovum pick up foram avaliados nos grupos Cis-Qc e Cis-Ct. Os resultados do experimento 1 e 2 para os grupos Cis-Qc e Cis-Ct foram confrontados. A análise estatística considerou significância de 5% nas avaliações. O percentual médio de desenvolvimento dos embriões foi similar entre os grupos Qc-Ct, Ct-Qc, Cis-Qc e Cis-Ct (49,55±5.1), porém superiores aos grupos Ct-Ct e Qc-Qc (42,4±6.1). A taxa média de blastocistos eclodidos foi similar entre os grupos Ct-Ct, Qc-Ct, CisQc e Cis-Ct (60,9±6.3), e estes superior grupo Qc-Qc (54,7±9.7). Para o número médio de células dos blastocistos o grupo Cis-Ct (145±25) foi superior os grupos Cis-Qc, Ct-Ct e Qc-Ct (128±25) e estes superiores os grupos Ct-Qc e Qc-Qc (109±32). No experimento 2 a taxa de clivagem não diferiu entre Cis-Ct (88,8±3.9) e Cis-Qc (87,7±4.5). Mas o percentual de blastocistos foi superior para Cis-Qc (64,6±9.8) em relação a Cis-Ct (56,4±3.6). Enquanto a taxa de prenhez do grupo 2 Cis-Ct (45,1±2.5) foi superior ao Cis-Qc (38,5±3.5). O percentual de blastocisto do experimento 2 (56,4±3.6 e 64,6±9.8%) foram superiores aos do experimento 1 (48,9±3.6 e 52,2±5.1%) para os grupos Cis-Ct e Cis-Qc, respectivamente. Em conclusão, a produção in vitro de embriões suplementada com antioxidante dependendo do grupo foi positiva, mas este benefício não foi confirmado na taxa de prenhez com o uso da quercetina no cultivo in vitro

In the first experiment we used oocytes from ovaries of slaughterhouse distributed in six groups: 1) Maturation and cultivation without the addition of antioxidants (Ct-Ct); 2) Maturation with 2 M of quercetin (Qc-Ct); 3) Cultivation with 2 M of quercetin (Ct-Qc); 4) Maturation and cultivation with 2 M of quercetin (Qc-Qc); 5) Maturation with 100 M of cysteamine and cultivation with of 2 M of quercetin (CisQc) and 6) Maturation with cysteamine (Cis-Ct). Based in experiment 1, the oocytes of Ovum pick up (OPU) were evaluated in Cis-and Cis-Qc CT. for experiment 3 were assessed the results of experiment 1 and 2 for groups Cis-and Cis-Ct Qc. Statistical analysis significance of 5% was considered in reviews. The percentage of embryos was superior to Qc-Ct, Ct-Qc, Cis-and Cis-Ct Qc (49,55±5.1), about Ct-Ct and QcQc (42.4±6.1). The hatching rate was similar to Ct-Ct, Qc-Ct, Cis-and Cis-Ct Qc (60,9±6.3), however the Group Qc-Qc (54,7±9.7). Had the lowest rate of hatching, followed by the Ct-Qc (57.3 ± 11.0). The number of cells in the embryos of the Group Cis-Ct (145±25) was superior to the Cis-Qc groups, Ct-Ct and Qc-Ct (media 128 ± 25). The embryos of Ct-Qc groups and Qc-Qc (media 109 ± 32) had the fewest cell. The rate of cleavage in the oocytes OPU did not differ between Cis-Ct (88.8±3.9) and Cis-Qc (87.7 ± 4.5). But the percentae of blastocyst was superior to Cis-Qc (64.6 ± 9.8) for the Cis-Ct (56.4 ± 3.6). However, the rate of pregnancy blastocyst Cis group- 4 Ct (45.1±2.5) were higher than those of Cis-Qc (38.5±3.5). The percentage of blastocyst OPU oocytes (56.4 ± 3.6 and 64.6 ± 9.8%) were higher than those of slaughterhouse (48.9 ± 3.6 and 52.2 ± 5.1%) independent of the groups evaluated (Cis-and Cis-Qc Ct), respectively. In conclusion, the in vitro production of embryos supplemented with antioxidant depending on the Group was positive, but this benefit has not been confirmed pregnant rate with the use of quercetin on in vitro cultivation.

FATORES QUE INFLUENCIAM A PRODUÇÃO COMERCIAL DE EMBRIÕES IN VITRO

O Brasil responde por quase 70% da produção mundial de embriões in vitro. A técnica de OPU-PIVE apresenta vantagens em relação aos outros programas de reprodução, pois proporciona um avanço acelerado do melhoramento genético do rebanho nacional, gerando animais superiores, além de possibilitar o uso de fêmeas de idades variadas, em qualquer fase do ciclo estral, inclusive as que possuem problemas reprodutivos adquiridos. Aliado ao uso de sêmen sexado, apresenta benefícios, principalmente para os produtores de leite, pois conseguem ter uma maior proporção de fêmeas no rebanho, tornando o uso da PIVE viável em larga escala. Porém, a técnica apresenta variabilidade na produção de blastocistos e na taxa de prenhez. Dessa forma, verificar e demonstrar os fatores que influenciam nos resultados obtidos por um laboratório comercial se mostra necessário, pois estas empresas englobam diferentes variáveis como: raças, localidades, manejos, sazonalidades e assim retratam a realidade do campo. Com isso, o presente estudo objetivou verificar os fatores que influenciam a produção de embrião in vitro (PIVE) e a taxa de prenhez utilizando dados de um Laboratório comercial. Para análise de PIVE, dados do ano de 2014 a 2016, referentes à 776 sessões de aspiração folicular guiada por ultrassom (OPU) de fêmeas bovinas adultas doadoras de oócitos para fins comerciais das raças Nelore (n=83), Girolando (n=73), Brangus (n=49), Holandesa (n=10) e Senepol (n=10), procedentes de diferentes localidades, foram avaliados. Foram analisadas a influência de cinco variáveis: raça da doadora, frequência de aspiração por doadora, tipo de sêmen (sexado vs convencional), sazonalidade (primavera/verão vs outono/inverno) e grupo genético da doadora (Bos taurus taurus, Bos taurus indicus e cruzamento) sobre as taxas de: oócitos viáveis, clivagem e produção de blastocisto. A produção de embriões in vitro seguiu os protocolos já estabelecidos pelo Laboratório. Já para análise da taxa de prenhez, dados de 20.297 inovulações realizadas entre novembro de 2009 e abril de 2016 foram avaliados. A influência de cinco variáveis: sazonalidade (primavera/verão vs outono/inverno), tipo de sêmen (sexado vs convencional), estádio embrionário, raça da doadora e da receptora sobre a taxa de prenhez, foram analisadas. A produção in vitro dos embriões foi realizada por apenas um técnico de laboratório e as inovulações por dois técnicos igualmente capacitados. A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o programa computacional Statistical Analysis System for Windows (SAS Inst., Inc., Cary, NC) empregando-se o Teste Qui-quadrado a um nível de 5% de significância (p<0,05). A raça Girolando apresentou maior taxa de blastocistos quando comparada com as demais raças. Doadoras aspiradas entre 9 e 17 vezes resultaram em maior taxa de clivagem e de blastocistos em comparação as aspiradas de 2 a 8 vezes (p=0,0001). Ao avaliar as taxas de clivagem e de blastocisto de acordo com o tipo de sêmen, estas foram maiores quando utilizado o sêmen sexado em comparação ao sêmen convencional. A sazonalidade influenciou a taxa de oócitos viáveis, sendo melhor na primavera/verão (p=0,0001), no entanto, sem afetar a taxa de clivagem e de blastocisto. Quando comparado o grupo genético das doadoras, obteve-se uma superioridade do Bos indicus, representado pela raça Nelore, para taxa de oócitos viáveis e blastocisto, enquanto que o Bos taurus apresentou os menores valores. Para as análises dos dados de inovulações, obtivemos: superioridade na taxa de prenhez no período primavera/verão quando comparada com outono/inverno, independente da raça da doadora assim como quando utilizado o sêmen convencional nas fertilizações in vitro. Ao transferir embriões em estádio de blastocisto expandido, blastocisto eclodido e blastocisto a taxa de prenhez é maior (p=0,0046). As doadoras das raças Brangus, Bonsmara e Gir apresentaram as maiores taxas e as Holandesas e Senepol as menores (p<0,0001). As receptoras com maior taxa de prenhez são das raças Bonsmara, Angus e Nelore. Ao agrupar a raça com a sazonalidade de inovulação, doadoras da raça Nelore e Brangus tem maiores taxas de prenhez na primavera/verão, enquanto que as raças leiteiras Holandesa e Gir se expressam melhor no outono/inverno. Para as receptoras, seguiu o mesmo padrão, as raças Nelore e europeu de corte apresentaram maiores taxas na primavera/verão e Holandesa, no outono/inverno. Concluímos com a realização deste estudo retrospectivo que: na PIVE, as doadoras da raça Girolando seguida pelas da raça Nelore exibiram o melhor desempenho na produção de blastocistos; esta produção aliada ao sêmen sexado demonstram que pode ser utilizado com sucesso em programa comercial, sobretudo na raça Girolando. A campo, as maiores taxas de prenhez se concentram na estação primavera/verão; os embriões em estádio mais avançado de desenvolvimento resultam em mais prenhez; o uso de sêmen convencional se mostrou superior que o sexado; e a raça da doadora e receptora é fator preponderante nos resultados. Desta forma, torna-se possível a obtenção de resultados satisfatórios comercialmente com a adaptação do laboratório às variáveis analisadas.

Brazil accounts for almost 70% of the worldwide production of in vitro embryos. The OPU-IVP (ovum pick-up/in vitro production) technique has advantages over other breeding programs, since it provides an accelerated advance of the genetic improvement of the national herd, generating superior animals, besides allowing the use of females of different ages, at any stage of the estrous cycle, including those with acquired reproductive problems. Combined with the use of sexed semen, it has benefits, especially for dairy farmers, since they can have a higher proportion of females in the herd, making the use of IVP viable on a large scale. However, the technique presents variability in the production of blastocysts and in the pregnancy rate. Thus, to verify and demonstrate the factors that influence the results obtained by a commercial laboratory is necessary, since these companies include different variables such as: breeds, localities, management, seasonality and thus portray the reality of the field. Thus, the present study aimed to verify the factors that influence in vitro embryo production (IVP) and the pregnancy rate using data from a commercial laboratory. For analysis of IVP, data from the year 2014 to 2016, referring to the 776 ultrasound guided follicular aspiration (OPU) sessions of oocyte donor adult females for commercial purposes of the Nelore (n=83), Girolando (n=73), Brangus (n = 49), Holstein (n=10) and Senepol (n=10) from different localities were evaluated. The influence of five variables: donor breed, donor aspiration frequency, semen type (sexado vs conventional), seasonality (spring/summer vs. autumn/winter) and donor genetic group (Bos taurus taurus, Bos taurus indicus and crossover) on the rates of: viable oocytes, cleavage and blastocyst production. In vitro embryo production followed the protocols already established by the Laboratory. As for the analysis of the pregnancy rate, data from 20,297 innovations carried out between November 2009 and April 2016 were evaluated. The influence of five variables: seasonality (spring/summer vs. autumn/winter), type of semen (sexed vs conventional), embryonic stage, donor and recipient breed on pregnancy rate were analyzed. The in vitro production of the embryos was performed by only one laboratory technician and the innovations by two equally trained technicians. Statistical analysis of the data was performed using the Statistical Analysis System for Windows (SAS Inst., Inc., Cary, NC) software using the chi-square test at a 5% level of significance (p<0.05). The Girolando breed had a higher blastocyst rate when compared to the other breeds. Donors aspirated between 9 and 17 times resulted in a higher rate of cleavage and of blastocysts compared to those aspirated 2 to 8 times (p=0.0001). When evaluating the rates of cleavage and blastocyst according to the type of semen, these were higher when using semen sexed compared to conventional semen. Seasonality influenced the rate of viable oocytes, being better in spring / summer (p=0.0001), however, without affecting the rate of cleavage and blastocyst. When comparing the genetic group of the donors, a superiority of the Bos indicus, represented by the Nelore breed, was obtained for viable oocytes and blastocyst rates, while Bos taurus presented the lowest values. For the analysis of the data of innovations, we obtained: superiority in the pregnancy rate in the spring/summer period when compared to autumn/winter, regardless of the breed of the donor as well as when the conventional semen was used in the in vitro fertilizations. When transferring embryos in expanded blastocyst stage, blastocyst and blastocyst the pregnancy rate is higher (p=0.0046). Donors from the Brangus, Bonsmara and Gir breeds had the highest rates and the lowest Holstein and Senepol breeds (p <0.0001). The recipients with the highest pregnancy rate are Bonsmara, Angus and Nelore. By grouping the breed with seasonality of innovation, Nelore and Brangus donors have higher pregnancy rates in the spring/summer, while the Holstein and Gir dairy breeds express themselves better in the fall/winter. For the recipients, it followed the same pattern, the Nelore and European breeds showed higher rates in spring/summer and Holstein in autumn/winter. We conclude with the accomplishment of this retrospective study that: in the IVP, the Girolando donors followed by the Nelore breed showed the best performance in the production of blastocysts; this production associate to sexed semen demonstrates that it can be used successfully in a commercial program, especially in the Girolando breed. In the field, the highest pregnancy rates are concentrated in the spring/summer season; embryos at a more advanced stage of development result in more pregnancy; the use of conventional semen was superior to sexed; and the donor and recipient breed is a preponderant factor in the results. In this way, it is possible to obtain satisfactory results with the adequacy of the database to the analyzed variables.

Criopreservação de sêmen bovino com antioxidantes: avaliações funcionais e fecundação in vitro

O objetivo deste trabalho foi avaliar a adição de antioxidantes no processo de criopreservação de sêmen bovino, a partir de testes complementares (motilidade e vigor espermáticos pós criopreservação, teste de termorresitência rápido, integridade de membranas plasmática e acrossomal, estresse oxidativo e morfologia espermática) e na fecundação in vitro (FIV). Para tanto, o ejaculado de nove animais foram divido em quatro frações, correspondente a cada tratamento, sendo estes: grupo controle sêmen diluído com extensor Tris gema; grupo vitamina sêmen diluído em Tris gema acrescido de 2,5 mM/mL de vitamina C; grupo glutationa sêmen diluído em Tris gema acrescido de 2,5 mM/mL de glutationa reduzida e o grupo associado sêmen diluído em Tris gema acrescido de vitamina C e glutationa reduzida com metade das concentrações (1.25mM/mL). Posteriormente o sêmen foi envasado em palhetas francesas e submetidas a criopreservação utilizando equipamento automatizado TK-3000®. Para FIV, ovários de abatedouros foram aspirados para obtenção dos oócitos grau I e II. Estes foram submetidos à maturação in vitro (MIV), seguida de fertilização in vitro (FIV) onde cada gota contendo os oócitos maturados, foi adicionada o sêmen capacitado correspondente a cada tratamento. A taxa de fecundação foi atribuída de embriões divididos em dois ou mais blastômeros. Houve diferença estatística (P< 0,05) na motilidade espermática para o grupo associado, contudo para vigor espermático os grupos não diferiram, o mesmo ocorreu para integridade de membrana plasmática e acrossomal. O grupo associado apresentou maior percentual de células com estresse oxidativo (P< 0,05) e menores percentuais de defeitos espermáticos maiores. O grupo glutationa apresentou maior taxa de fecundação (P< 0,05). Dessa forma, concluiu-se que a associação da vitamina C e glutationa reduzida favoreceu a motilidade espermática pós descongelação, porém os antioxidantes não apresentaram efeito preventivo quanto aos danos estruturais sofridos pelas membranas plasmáticas. E que associação dos antioxidantes proporciona maior estresse oxidativo e o uso de glutationa reduzida garante maior capacidade fecundante.

The aim of this study was to evaluate the addition of antioxidants in cryopreservation process of bovine semen, from complementary tests (stamina and sperm motility post thawing, quick thermos-resistance test, acrosomal and plasma membranes integrity, oxidative stress and sperm morphology) and in in vitro fertilization (IVF). Therefore, the ejaculate from nine animals was divided in four fractions, corresponding to one treatment each, these being: control group semen diluted in Tris yolk; vitamin group semen diluted in Tris yolk plus 2.5 mM/mL of vitamin C; glutathione group semen diluted in Tris yolk plus 2.5 mM/mL of reduced glutathione and associated group semen diluted in Tris yolk plus half of the concentration (1.25 mM/mL), later the semen was packed into french straws and submitted to cryopreservation through an automatized equipment, TK 3000®. For IVF, ovaries from slaughterhouses were aspirated to obtain oocytes grades I and II. These were submitted to in vitro maturation (IVM) followed by IVF; where each drop containing the matured oocytes, was combined with the capacitated semen, corresponding to each treatment. Fertilization rate was assigned to embryos divided into two or more blastomeres. There was statistical difference (P< 0.05) for sperm motility for the associated group, however the groups didnt differ for sperm stamina, the same occurred to acrosomal and plasma membranes integrity. The associated group showed higher percentage of cells with oxidative stress (P< 0.05) and smaller percentage for major sperm defects. Glutathione group showed higher fertilization rate (P< 0.05). Therefore, we can conclude that the association of vitamin C and reduced glutathione favored sperm motility post thawing, however, the antioxidants didnt show a preventive effect about the structural damage suffered by plasma membranes. And that the association of the antioxidants provides higher oxidative stress and the use of reduced glutathione guarantees increased fertilizing capacity.

AÇÕES DA Binder of SPerm Protein 1 (BSP1) SOBRE A FUNCIONALIDADE DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS: REAÇÃO ACROSSÔMICA, TAXA DE CLIVAGEM E PRODUÇÃO in vitro DE BLASTOCISTOS

A Binder of Sperm Protein 1 (BSP1) é uma proteína produzida pelas vesículas seminais dos animais, que ajuda no processo de fertilização do oócito promovendo a capacitação espermática, mediando a sua ligação com o epitélio do oviduto e aumentando sua motilidade no oviduto. As taxas de reação de acrossoma dos espermatozoides foram determinadas ao serem incubados com BSP1 purificado, e com e sem a presença de heparina, como controles. A porcentagem de reação de acrossoma foi maior (p<0.05) no controle 1 (44.5%) comparado com os tratamentos restantes (BSP1: 10 µg/mL: 24.5%; 20 µg/mL: 25.5%; 40 µg/mL: 26.0%), sendo menor esta taxa (p>0.05) quando os espermatozoides só foram incubados no meio Fert-TALP sem heparina (14.5%). As taxas de clivagem e de blastocistos foram avaliadas nos dias dois e sete respectivamente, depois de fertilizar oócitos em um meio que continha BSP1. Foram recuperados 1274 COCs e incubados durante 18 horas com sêmen ejaculado congelado- descongelado em meio Fert-TALP, que continha: só heparina, 10, 20 ou 40 µg/mL de BSP1. As taxas de clivagem e de blastocistos (34.1 ± 4.4 vs 40.8 ± 5.0%) foram similares (p>0.05) quando se fez a incubação com 10 µg/mL de BSP1 e heparina, respectivamente. Porém, as concentrações de 20 e 40 µg/mL diminuíram a formação de blastocistos (22.4 ± 2.9 e 19.3 ± 4.1%) em relação com a heparina (40.8 ± 5.1%; p < 0.02). Posteriormente foram incubados COCs (n= 2239), com sêmen ejaculado congelado-descongelado que foi selecionado por um gradiente de Percoll® 45%-90% que continha: só heparina, 10, 20 ou 40 µg/mL de BPS1 e foi realizado um controle 2 de Percoll® sem heparina nem BSP1. A taxa de clivagem foi similar (p > 0.05) para a incubação com as concentrações de 10, 20 e 40 µg/mL de BSP1 (67.7±3.0, 68.7±3.5, 75.2±3.8). Porém, estas taxas foram similares quando só foi usada heparina e quando se incubou com 40 µg/mL de BSP1 (78.9±1.7 vs 75.2±3.8%). Para as taxas de blastocistos encontrou-se que foram similares (p > 0.05) quando se fez a seleção com heparina (44.1±4.3%) e com 40 µg/mL de BSP1 (30.0±3.3%). Finalmente, foram recuperados 1213 complexos cumulus-oócitos e incubados com espermatozoides epididimários congelados-descongelados em meio Fert-TALP, que continham: só heparina, sem heparina, e 10, 20 ou 40 µg/mL de BSP1. As taxas de clivagem e de blastocistos foram similares após as incubações com e sem heparina, mas a concentração de 40 µg/mL de BSP1 produziu maiores taxas de clivagem (79.0 ± 1.1%) que o controle 1 (68.5 ± 1.3%; p < 0.05). Quanto às taxas de blastocistos, encontraram-se maiores taxas quando foram usadas as concentrações de 20 e 40 µg/mL de BSP1 (35.6 ± 2.5 e 41.1 ± 2.0%) que com (24.7 ± 3.2; p < 0.05) e sem heparina (27.3 ± 1.6%; p < 0.0003). Em conclusão, a BSP1 adicionada ao meio de fertilização e ao gradiente de Percoll® quando usado o sêmen ejaculado, e ao meio de fertilização quando usados espermatozoides epididimários, permitiu clivagem e desenvolvimento próprio, sem a necessidade do uso de heparina.

The Binder of Sperm Protein 1 (BSP1) is a protein produced by seminal vesicles of animals. It helps into the fertilization process of oocytes, promoting sperm capacitation, mediating the ligation from itself with the oviduct epithelium, and increasing the motility in the oviduct. When spermatozoa with purified BSP1 were incubated, acrosomal reaction rates were determined with and without the presence of heparin, as controls. The percentage of acrosomal reaction was higher (p <0.05) in control 1 (44.5%) compared with the other treatments (BSP1:10 g/mL: 24.5%; 20 g/mL: 25.5%; 40 g/mL: 26.0 %), and lower the rate (p> 0.05) when sperm were incubated only in Fert-TALP medium without heparin (14.5%). Cleavage and blastocyst rates were evaluated on days two and seven respectively, after fertilize oocytes in a medium containing BSP1. 1274 cumulus-oocyte complexes were recovered and incubated for 18 hours with frozen-thawed ejaculated semen in a Fert-TALP medium, containing: only heparin, 10, 20 or 40 g/mL of BSP1. Cleavage and blastocyst rates (34.1 ± 4.4 vs 40.8 ± 5.0%) were similar (p> 0.05) when incubation was made with 10 g/mL of BSP1 and heparin, respectively. However, the concentrations of 20 and 40 g/mL decreased the formation of blastocysts (22.4 ± 2.9 and 19.3 ± 4.1%) compared with heparin (40.8 ± 5.1%, p <0.02). Subsequently, cumulus-oocyte complexes (n = 2239) were incubated with frozen-thawed ejaculated semen. Spermatozoa were selected by a gradient of 45% -90% Percoll® containing: only heparin, 10, 20, 40 g/mL of BSP1 and there was a control 2 of Percoll® without heparin or BSP1. Cleavage rate was similar (p> 0.05) for the incubation with concentrations of 10, 20 and 40 g/mL of BPS1 (67.7 ± 3.0, 68.7 ± 3.5, 75.2 ± 3.8, respectively). However, these rates were similar when it was used just heparin and when oocytes were incubated with 40 g/mL of BSP1 (78.9 ± 1.7 vs 75.2 ± 3.8%). For blastocyst rates was found that they were similar (p> 0.05) when the selection was made with heparin (44.1 ± 4.3%) and 40 g/mL of BSP1 (30.0 ± 3.3%). Finally, 1213 cumulus-oocyte complexes were recovered and incubated with freeze-thawed epididymal semen in Fert-TALP medium, which contained: only heparin, with heparin, and 10, 20 or 40 g/mL of BSP1. Cleavage and blastocyst rates were similar after incubation with and without heparin, but the concentration of 40 g/mL of BSP1 produced higher cleavages rates (79.0 ± 1.1%) than control 1 (68.5 ± 1.3%, p <0.05). About blastocyst rates, there were rates significantly higher when concentrations of 20 and 40 g/mL of BSP1 were used (35.6 ± 2.5 and 41.1 ± 2.0%) than with (24.7 ± 3.2; p <0.05) and without heparin (27.3 ± 1.6%; p <0.0003). In conclusion, BSP1 allowed proper cleavage and development, when the protein was added to the fertilization medium and the Percoll® gradient using ejaculated semen, and to the fertilization medium when used epididymal sperm, without requiring the use of heparin.

Improving in vitro maturation and cleavage rates of buffalo oocytes

The aim of the present study was to improve in vitro maturation and cleavage rates of buffalo oocytes. Good quality oocytes were divided into two experiments. In Experiment 1 oocytes were cultured for 24 h in a CO2 incubator at 38.5oC either in TCM-199, Hams F-10, MEM or FertiCult medium supplemented with either 10% FCS or 0.3% BSA. Experiment 2 was carried out to investigate the effect of different hormones (either 50 µg/ml eCG, 50 µg/ml FSH or 1 mg/ml E2) added to four of the afore mentioned media enriched with 10% FCS at the same culture conditions. Matured oocytes were fertilized in vitro using frozen thawed semen capacitated with heparin and caffeine. The sperm-oocytes were co-cultured for 22 h in BO or TALP medium. The fertilized oocytes were cultured in either BO or TALP medium for an additional five days at the same culture conditions and checked daily for cleavage. Addition of FCS to all media led to a higher maturation rate, without any significant variation, than BSA did (75.6 vs. 71.3%). Although no influence on the maturation rate was observed, addition of eCG to TCM-199, Hams F-10 or MEM media resulted in a non-significant increase of in vitro maturation rate of buffalo oocytes compared to other hormonal additives to the same media. Furthermore, supplementation of maturation media with eCG resulted in a non-significant higher in vitro maturation rate of buffalo oocytes compared to FSH and E2 (80.4% for eCG supplemented media vs. 74.0% and 73.0% for FSH and E2, respectively). There was a non-significant difference in the cleavage rate of buffalo oocytes matured in TCM-199 supplemented with either sera or hormones and fertilized either in BO or TALP medium. However, the highest non-significant cleavage rate was achieved when oocytes were matured in TCM-199 supplemented with eCG and fertilized in TALP medium (50%). The overall cleavage rate was not significantly greater in TALP than in BO medium (33.7 vs. 15.5%). It could be concluded that supplementation of maturation media with FCS and/or eCG could successfully improve IVM rate of buffalo oocytes. Furthermore, high cleavage rate could be achieved when oocytes were matured in TCM-199 supplemented with FCS and eCG and fertilized in TALP medium.(AU)

Improving in vitro maturation and cleavage rates of buffalo oocytes

The aim of the present study was to improve in vitro maturation and cleavage rates of buffalo oocytes. Good quality oocytes were divided into two experiments. In Experiment 1 oocytes were cultured for 24 h in a CO2 incubator at 38.5oC either in TCM-199, Ham’s F-10, MEM or FertiCult medium supplemented with either 10% FCS or 0.3% BSA. Experiment 2 was carried out to investigate the effect of different hormones (either 50 µg/ml eCG, 50 µg/ml FSH or 1 mg/ml E2) added to four of the afore mentioned media enriched with 10% FCS at the same culture conditions. Matured oocytes were fertilized in vitro using frozen thawed semen capacitated with heparin and caffeine. The sperm-oocytes were co-cultured for 22 h in BO or TALP medium. The fertilized oocytes were cultured in either BO or TALP medium for an additional five days at the same culture conditions and checked daily for cleavage. Addition of FCS to all media led to a higher maturation rate, without any significant variation, than BSA did (75.6 vs. 71.3%). Although no influence on the maturation rate was observed, addition of eCG to TCM-199, Ham’s F-10 or MEM media resulted in a non-significant increase of in vitro maturation rate of buffalo oocytes compared to other hormonal additives to the same media. Furthermore, supplementation of maturation media with eCG resulted in a non-significant higher in vitro maturation rate of buffalo oocytes compared to FSH and E2 (80.4% for eCG supplemented media vs. 74.0% and 73.0% for FSH and E2, respectively). There was a non-significant difference in the cleavage rate of buffalo oocytes matured in TCM-199 supplemented with either sera or hormones and fertilized either in BO or TALP medium. However, the highest non-significant cleavage rate was achieved when oocytes were matured in TCM-199 supplemented with eCG and fertilized in TALP medium (50%). The overall cleavage rate was not significantly greater in TALP than in BO medium (33.7 vs. 15.5%). It could be concluded that supplementation of maturation media with FCS and/or eCG could successfully improve IVM rate of buffalo oocytes. Furthermore, high cleavage rate could be achieved when oocytes were matured in TCM-199 supplemented with FCS and eCG and fertilized in TALP medium.

Identification of a mutation in the spike protein cleavage site in Brazilian strains of wild-type bovine coronavirus

The spike (S) protein of coronaviruses, a type I membrane glycoprotein, is primarily responsible for entry into susceptible cells by binding with specific receptors on cells and mediating subsequent virus-cell fusion. The bovine coronavirus (BCoV) S protein is cleaved into two subunits, the N-terminal S1 and the C-terminal S2. The proteolytic cleavage site of S protein is highly conserved among BCoV strains and is located between amino acids 763 and 768 (KRRSRR). This study describes a single mutation in the S protein cleavage site of three Brazilian strains of BCoV detected in diarrheic fecal samples from calves naturally infected. The sequenced PCR products revealed that amino acid sequence of the cleavage site of our strains was KRRSSR, indicating a mutation at amino acid position 767 (R FONT FACE=Symbol>® /FONT> S). This amino acid substitution occurred due to a single nucleotide substitution in the sequence of DNA corresponding to the proteolytic cleavage site, CGT to AGT. This is the first description of this nucleotide mutation (C to A), which resulted in the substitution of arginine to serine in the S cleavage site. In this study we speculated the probable effects of this mutation in the proteolytic cleavage site using the murine hepatitis coronavirus (MHV) as a comparative model.

A proteína da espícula (S), uma glicoproteína de membrana do tipo I, é primariamente responsável pela entrada do vírus em células susceptíveis por meio da interação inicial com receptores celulares específicos e subseqüente mediação da fusão vírus-célula. A proteína S do coronavírus bovino (BCoV) é clivada em duas subunidades: a S1, na região N-terminal e a S2, na região C-terminal. O sítio de clivagem proteolítica da proteína S é altamente conservado entre as estirpes de BCoV e está situado entre os aminoácidos 763-768 (KRRSRR). Este estudo descreve uma mutação no sítio de clivagem da proteína S de três estirpes do BCoV detectadas em amostras fecais diarréicas de bezerros naturalmente infectados no Brasil. O seqüenciamento dos produtos de PCR identificou a seqüência de aminoácidos KRRSSR no sítio de clivagem de nossas amostras, indicando uma mutação na posição 767 (R->S). Esta mutação ocorreu devido a uma única substituição de nucleotídeo no sítio de clivagem proteolítica, alterando o códon CGT para AGT. Esta é a primeira descrição desta mutação de nucleotídeo (C para A), que resultou na substituição do aminoácido arginina por serina no sítio de clivagem da proteína S. Neste estudo também são sugeridos os prováveis efeitos desta mutação no sitio de clivagem proteolítica utilizando o coronavírus da hepatite dos camundongos (MHV) como um modelo comparativo.

Altas concentrações de FSH-p na maturação in vitro de oócitos Bos indicus

The aim of this work was to evaluate the efficiency of different concentrations of a commercial FSH-p on the nuclear maturation of Bos indicus oocytes, cleavage and in vitro development of embryos until blastocyst stages. The oocytes were selected and transferred to the maturation medium (TCM 199/25 mM HEPES) supplemented with different concentrations of FSH-p (T1 = 10mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1032" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> ; T2 - 20mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1033" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> ; T3 - 40mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1034" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif">) and after 24 hours of incubation, at 39ºC in a moist 5% CO2 atmosphere. Some of the oocytes were removed and submitted to the analysis of nuclear maturation and the others were placed in the fertilization medium (mDM). After 18 hours of incubation, at the same atmosfhere condition mentioned above, the presumptive zygotes were transferred to the culture medium (KSOM) with a granulosa cells monolayer. The metaphase II, cleavage and blastocyst percentages were, respectively, 81.8/62.0/17.6% (T1), 55.6/64.0/19.5% (T2) and 50.0/65.0/16.3% (T3). The statistic analysis showed that a lower percentage of oocyte (P £ 0.05) treated with 20mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1035" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> and 40mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1036" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> of FSH-p reached the metaphase II stage and that the cleavage and blastocyst rate do not differ among treatments (P ³ 0.05). The results allow to conclude that the addition of 20mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1037" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> and 40mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1038" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> of FSH-p to the culture medium interfere in the nuclear maturation process, however all tested concentrations may be used without apparent damage to the cleavage and subsequent embryonic development.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência de diferentes concentrações de um FSH-p comercial sobre a maturação nuclear de oócitos Bos indicus, clivagem e desenvolvimento in vitro de embriões até estádios de blastocisto. Após seleção e transferência para o meio TCM 199/HEPES suplementado com diferentes concentrações de FSH-p (T1 = 10mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1025" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> ; T2 = 20mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1026" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> ; T3 = 40mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1027" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif">), os oócitos foram incubados, durante 24 horas, a 39ºC em atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Parte dos oócitos foram retirados para análise da maturação nuclear e os demais foram transferidos para o meio de fecundação (mDM). Após 18 horas de incubação nas mesmas condições atmosféricas mencionadas para os oócitos, os presumíveis zigotos foram distribuídos no meio de desenvolvimento embrionário (KSOM) contendo monocamada de células da granulosa. As porcentagens de metáfase II, de clivagem e de blastocisto foram, respectivamente, de 81,8/62,5/17,6% (T1); 55,6/64,0/19,5% (T2) e 50,0/65,0/16,3% (T3). A análise estatística revelou que uma menor porcentagem (P £ 0,05) de oócitos tratados com 20mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1028" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> e 40mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1029" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> de FSH-p alcançou o estádio de metáfase II e que as taxas de clivagem e blastocisto não diferiram (P ³ 0,05) entre os tratamentos. Os resultados permitem concluir que a adição de 20mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1030" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> e 40mg/m img border=0 width=32 height=32 id="_x0000_i1031" src="../../../../img/revistas/cr/v31n4/a14img01.gif"> de FSH-p ao meio de cultura interfere no processo de maturação nuclear, mas todas as concentrações testadas podem ser utilizadas sem prejuízo aparente para a clivagem e o posterior desenvolvimento embrionário.

Selection of Nelore bulls on in vitro production of embryos / Seleção de reprodutores bovinos da raça nelore na produção in vitro de embriões

This study evaluated the bull effect on the cleavage (CR) and blastocyst rate (BLR) by verifying which of these parameters can be used for selection of semen from Nelore bulls by in vitro production (IVP) of embryos. The immature oocytes from slaughterhouse cows ovaries were matured in vitro in TCM 199 medium with 10% estrous cow serum (ECS), 5µg/ml FSH and 5µg/ml LH. After 24 h of culture, the mature oocytes were incubated with frozenthawed semen from 4 Nelore bulls (A, B, C and D), which were submitted to the washing procedure and the sperm concentration adjusted to 5 x 106 cells/ml. The oocytes-sperm incubation lasted 18-21 h and the TALP-IVF supplemented with 30µg/ml heparin was the culture medium used. After this, the oocytes were transferred into microdroplets of Ménezo medium with 10% ECS and bovine oviduct epithelial cells in suspension and were further cultured by 9 days. All the cultures were performed at 38.5C with 5% CO2 in air and the data were analysed by chi-square test. There was no difference (P>0.05) among the bulls regarding to CR (A= 61.2%; B= 61.3%; C= 66.1%; D= 64.1%). In terms off BLR, bull C (4.1%) was significantly different from bulls A (10.6%), B (12.1%) and C (18.8%), which were not different to each other. The results indicated that the selection of bulls for IVP of bovine embryos should be done by using the blastocyst rate as tile goal.

O presente trabalho avaliou o efeito do reprodutor nas taxas de clivagem (TC) e de blastocistos (TBL) com a finalidade de verificar qual desses parâmetros serviria para selecionar o sêmen de reprodutores da raça Nelore para produção in vitro (PIV) de embriões. Oócitos imaturos provenientes de ovários de vacas de abatedouro foram submetidos a maturação in vitro utilizando o meio TCM 199, acrescido de 10% de soro de vaca em estro (SVE),  5µg/ml de FSH e 5µg/ml de LH. Após 24 h de cultura, os oócitos maturos foram incubados com sêmen descongelado de 4 reprodutores da raça Nelore (A, B, C e D), previamente submetidos ao procedimento de lavagem e a concentração espermática ajustada para 5 x 106 células/ml. A incubação dos oócitos-sêmen teve a duração de 18 a 21 h e o meio de cultura utilizado foi o TALP-FIV suplementado com 30µg/ml de heparina. Após este período, os oócitos foram transferidos para placas contendo microgotas de meio Ménezo suplementado com 10% de SVE e células epiteliais do oviduto bovino em suspensão, cobertas com óleo de silicone, permanecendo em cultura por mais 9 dias. Todas as culturas foram realizadas a 38,5ºC em atmosfera com 5% de CO2 e os dados foram analisados pelo Teste do Quíquadrado. Não houve diferença (P>0,05) entre os reprodutores com relação a TC (A= 61,2%; B= 61,3 %; C= 66,1%; D= 64,1%). Com relação a TBL, o reprodutor C (4,1%) foi inferior (P<

Selection of Nelore bulls on in vitro production of embryos / Seleção de reprodutores bovinos da raça nelore na produção in vitro de embriões

This study evaluated the bull effect on the cleavage (CR) and blastocyst rate (BLR) by verifying which of these parameters can be used for selection of semen from Nelore bulls by in vitro production (IVP) of embryos. The immature oocytes from slaughterhouse cows ovaries were matured in vitro in TCM 199 medium with 10% estrous cow serum (ECS), 5µg/ml FSH and 5µg/ml LH. After 24 h of culture, the mature oocytes were incubated with frozenthawed semen from 4 Nelore bulls (A, B, C and D), which were submitted to the washing procedure and the sperm concentration adjusted to 5 x 106 cells/ml. The oocytes-sperm incubation lasted 18-21 h and the TALP-IVF supplemented with 30µg/ml heparin was the culture medium used. After this, the oocytes were transferred into microdroplets of Ménezo medium with 10% ECS and bovine oviduct epithelial cells in suspension and were further cultured by 9 days. All the cultures were performed at 38.5C with 5% CO2 in air and the data were analysed by chi-square test. There was no difference (P>0.05) among the bulls regarding to CR (A= 61.2%; B= 61.3%; C= 66.1%; D= 64.1%). In terms off BLR, bull C (4.1%) was significantly different from bulls A (10.6%), B (12.1%) and C (18.8%), which were not different to each other. The results indicated that the selection of bulls for IVP of bovine embryos should be done by using the blastocyst rate as tile goal.

O presente trabalho avaliou o efeito do reprodutor nas taxas de clivagem (TC) e de blastocistos (TBL) com a finalidade de verificar qual desses parâmetros serviria para selecionar o sêmen de reprodutores da raça Nelore para produção in vitro (PIV) de embriões. Oócitos imaturos provenientes de ovários de vacas de abatedouro foram submetidos a maturação in vitro utilizando o meio TCM 199, acrescido de 10% de soro de vaca em estro (SVE),  5µg/ml de FSH e 5µg/ml de LH. Após 24 h de cultura, os oócitos maturos foram incubados com sêmen descongelado de 4 reprodutores da raça Nelore (A, B, C e D), previamente submetidos ao procedimento de lavagem e a concentração espermática ajustada para 5 x 106 células/ml. A incubação dos oócitos-sêmen teve a duração de 18 a 21 h e o meio de cultura utilizado foi o TALP-FIV suplementado com 30µg/ml de heparina. Após este período, os oócitos foram transferidos para placas contendo microgotas de meio Ménezo suplementado com 10% de SVE e células epiteliais do oviduto bovino em suspensão, cobertas com óleo de silicone, permanecendo em cultura por mais 9 dias. Todas as culturas foram realizadas a 38,5ºC em atmosfera com 5% de CO2 e os dados foram analisados pelo Teste do Quíquadrado. Não houve diferença (P>0,05) entre os reprodutores com relação a TC (A= 61,2%; B= 61,3 %; C= 66,1%; D= 64,1%). Com relação a TBL, o reprodutor C (4,1%) foi inferior (P<

Concentração espermática na fecundação in vitro, com sêmen de touro da raça Guzerá

The aim of this study was to evaluate the effect of different sperm concentrations of Guzera bull semen during in vitro fertilization on the cleavage rate. Oocytes (n=356) obtained from a slaughterhouse ovaries, were in vitro matured and randomly divided into four treatments for in vitro fertilization, according to sperm concentrations: TI (0.5× 10(6) spermatozoa/ml); TII (1.0× 10(6) spermatozoa/ml); TIII (2.0× 10(6) spermatozoa/ml) e TIV (4.0× 10(6) spermatozoa/ml). Frozen semen from one Guzera bull was used for in vitro fertilization. The live sperms were separated by swim up, washed once by centrifugation, and then placed in in vitro fertilization media. The in vitro fertilization was performed in tubes in media with heparin and incubated in 5% CO2, at 39ºC for 20h. Thereafter, the oocytes were washed in Talp Hepes medium and cultured during three days in TCM 199 and bovine oviduct epithelial cells, at the same conditions of in vitro fertilization. From the spermatozoa used at the beginning of swim up, 10.21± 0.98% were recovered, and the motility increased from 67.5± 2.5% to 81.25± 2.4%. The cleavage rates were 31,0% (n=71), 44.7% (n=85), 55.9% (n=127), and 52.0% (n=73) for TI, TII, TIII, and TIV, respectively. The cleavage rate in TI was lower than in TIII and TIV (P 0.05). These results suggest that the best spermatic concentration during the in vitro fertilization, with Guzera bull semen, is above 1.0× 10(6) spermatozoa/ml. Sperm concentration of 0.5× 10(6) spermatozoa/ml was not efficient in this trial.

Estudou-se o efeito de diferentes concentrações espermáticas de sêmen de touro da raça Guzerá, durante a fecundação in vitro, sobre a taxa de clivagem embrionária. Ovócitos (n=356) obtidos de folículos de ovários oriundos de matadouro foram maturados in vitro e divididos aleatoriamente em quatro tratamentos visando a fecundação in vitro, de acordo com as concentrações espermáticas: TI (0,5× 10(6) espermatozóides/ml), TII (1,0× 10(6) espermatozóides/ml), TIII (2,0x10(6) espermatozóides/ml) e TIV (4,0× 10(6) espermatozóides/ml). Utilizou-se sêmen congelado de um único touro da raça Guzerá, preparado pela técnica de swim up, seguida de centrifugação, antes de ser adicionado ao meio de fecundação in vitro. Ao término do período de fecundação, os ovócitos foram cultivados por três dias em TCM 199, com células da tuba uterina, nas mesmas condições da fecundação. Após o swim up, foram recuperados 10,21± 0,98% dos espermatozóides inicialmente colocados e a motilidade aumentou de 67,5± 2,5% para 81,25± 2,4%. A taxa de clivagem foi de 31,0% (n=71), 44,7% (n=85), 55,9% (n=127) e 52,0% (n=73) em TI, TII, TIII e TIV, respectivamente. O TI apresentou taxa de clivagem inferior aos tratamentos TIII e TIV (P 0,05). Os resultados sugerem que as melhores concentrações espermáticas para a fecundação in vitro estão a partir de 1,0× 10(6) espermatozóides/ml, sendo a concentração de 0,5× 10(6) espermatozóides/ml não recomendada para esse processo.

Effect on insulin-like growth factor-1 during in vitro oocyte maturation and in vitro culture of bovine embryos / Efeito do fator de crescimento semelhante à insulina-1 durante a maturação in vitro dos oócitos e cultivo in vitro de embriões bovinos

The effects of insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation (IVM) (experiment I) and on in vitro embryo development (experiment II) of bovine oocytes fertilized in vitro, were evaluated in terms of cleavage (CR), blastocyst (BR) and hatching (HR) rates. For IVM, immature cumulus-oocyte complexes were cultured in TCM-199 medium supplemented with Hepes, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, additives, fetal calf serum (B-199 medium) and gonadotropins (14 U/ml PMSG and 7 U/ml hCG). For embryo development, the oocytes/zygotes were cultured in B-199 medium with bovine oviduct epithelial cells in suspension under silicon oil. Treatments for in vitro culture conditions for both experiments were: 1- B-199 + 200 ng/ml IGF-I; 2- B-199 + 100 ng/ml IGF-I; 3- B-199 + 50 ng/ml IGF-I; 4- B-199 + 10 ng/ml IGF-I; 5- B-199 + 0 ng/ml IGF-I. All cultures were performed at 38.5oC in 5% CO2 in air and the data were analyzed by chi-square test. In experiment I, there were no differences (P>0.05) among treatments for CR, BR or HR. In experiment II, the addition of IGF-I to the embryo culture medium (ECM) resulted in a significant increase in CR while for BR and HR this effect was not observed. The addition of 200 ng/ml IGF-I to ECM increased CR (71.1%) when compared to 100 ng/ml IGF-I (57.6%) or control (56.7%) groups, however, there were no differences when compared to 50 (69.4%) or 10 ng/ml (73.1%) groups. There was no beneficial effect of the addition of IGF-I in the IVM or ECM media on the in vitro development of embryos produced from oocytes matured and fertilized in vitro. (AU)

Avaliaram-se o efeito do IGF-I na maturação in vitro (MIV) (experimento I) e no desenvolvimento embrionário (DE) (experimento II) de oócitos bovinos fecundados in vitro, quanto às taxas de clivagem (TC), de blastocistos (TB) e de eclosão (TE). Para MIV, complexos cumulus-oócitos imaturos foram cultivados em meio TCM-199 suplementado com HEPES, bicarbonato e piruvato de sódio, aditivos, soro fetal bovino (meio B-199) e gonadotrofinas 14U/ml de PMSG e 7U/ml de hCG). Para o desenvolvimento embrionário, os oócitos/zigotos foram cultivados em meio B-199 com células epiteliais do oviduto bovino em suspensão sob óleo de silicone. As condições de cultivo in vitro para ambos os experimentos seguiram os tratamentos: 1- meio B-199 + 200 ng/ml IGF-I; 2- B-199 + 100 ng/ml IGF-I; 3- B-199 + 50 ng/ml IGF-I; 4- B-199 + 10 ng/ml IGF-I; 5- B-199 + 0 ng/ml IGF-I. Todas as culturas foram realizadas a 38,5° C em atmosfera com 5% de CO2 e os dados foram analisados pelo teste do qui-quadrado. No experimento I, não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto às TC, TB e TE, quando o meio de MIV foi suplementado com IGF-I. No experimento II, a adição de IGF-I ao meio de DE resultou em aumento na TC (P<0,05) mas não influenciou a TB e a TE. A adição de 200 ng/ml de IGF-I ao meio DE melhorou a TC (71,1%) quando comparada com a TC dos grupos de 100 ng/ml de IGF-I (57,6%) ou controle (56,7%), entretanto não houve diferença quando comparada com a dos grupos de 50 ng/ml (69,4%) ou 10 ng/ml (73,1%) de IGF-I. Não houve efeito benéfico na adição de 10 a 200 ng/ml de IGF-I nos meios de MIV e de DE com relação ao desenvolvimento de embriões produzidos a partir de oócitos maturados e fecundados in vitro. (AU)