Identification and Characterization of the ATG8, a Marker of Eimeria tenella Autophagy / Identificação e Caracterização do ATG8, um marcador de autofagia em Eimeria tenella

Autophagy plays an important role in maintaining cell homeostasis through degradation of denatured proteins and other biological macromolecules. In recent years, many researchers focus on mechanism of autophagy in apicomplexan parasites, but little was known about this process in avian coccidia. In our present study. The cloning, sequencing and characterization of autophagy-related gene (Etatg8) were investigated by quantitative real-time PCR (RT-qPCR), western blotting (WB), indirect immunofluorescence assays (IFAs) and transmission electron microscopy (TEM), respectively. The results have shown 375-bp ORF of Etatg8, encoding a protein of 124 amino acids in E. tenella, the protein structure and properties are similar to other apicomplexan parasites. RT-qPCR revealed Etatg8 gene expression during four developmental stages in E. tenella, but their transcriptional levels were significantly higher at the unsporulated oocysts stage. WB and IFA showed that EtATG8 was lipidated to bind the autophagosome membrane under starvation or rapamycin conditions, and aggregated in the cytoplasm of sporozoites and merozoites, however, the process of autophagosome membrane production can be inhibited by 3-methyladenine. In conclusion, we found that E. tenella has a conserved autophagy mechanism like other apicomplexan parasites, and EtATG8 can be used as a marker for future research on autophagy targeting avian coccidia.(AU)

A autofagia desempenha um papel importante na manutenção da homeostase celular através da degradação de proteínas desnaturadas e outras macromoléculas biológicas. Nos últimos anos, muitos pesquisadores se concentraram no mecanismo da autofagia em parasitas apicomplexos, mas pouco se sabe sobre esse processo na coccidia aviária. No presente estudo, a clonagem, sequenciamento e caracterização de gene relacionado à autofagia Etatg8 foram investigados pela PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR), mancha ocidental (WB), ensaios indiretos de imunofluorescência (IFAs) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), respectivamente. Os resultados mostraram que o gene Etatg8 de E. tenella possui uma ORF de 375 bp, codificando uma proteína de 124 aminoácidos com estrutura e propriedades semelhantes à de outros apicomplexos. RT-qPCR revelou que Etatg8 é expresso durante os quatro estágios de desenvolvimento de E. tenella. Entretanto, seus níveis transcricionais foram significativamente mais elevados na fase de oocisto não esporulados. Os ensaios de manchas ocidental (WB) e de imunofluorescência (IFA) mostraram que a proteína EtATG8 foi lipidada para ligar-se à membrana do autofagossomo sob condições de deficiência nutritiva (em presença de rapamicina) e se agregar no citoplasma de esporozoítas e merozoítas. No entanto, o processo de produção de membrana do autofagossomo pode ser inibido por um inibidor de autofagia (3-meetiladeninatiladenina, 3-MA). Em conclusão, foi demonstrado que E. tenella tem um mecanismo de autofagia conservado, semelhante ao de outros parasitas apicomplexos, e que EtATG8 pode ser usado como um marcador para futuras pesquisas sobre autofagia direcionada à coccidiose aviária.(AU)

Pathological features of cloned calves that died in the neonatal period / Aspectos patológicos de bezerros clonados com óbito no período neonatal

Somatic-cell nuclear transfer is a cloning technique that enables the creation of a viable embryo from a donor adult to produce a genetically identical individual. This technique opens numerous potential possibilities for medicine and animal reproduction. However, several reports have documented cloning-related issues. Embryo and fetal losses remain significantly higher than in other techniques, and there is a high incidence of dystocia and hydrops, which decreases efficiency and increases costs. Animals delivered at term often exhibit a syndrome known as macrosomia and experience difficulties in adapting to life outside the uterus, and death is a common outcome. In the present study, 41 cloned calves that died in the neonatal period were subjected to gross and histopathological examination. Most important gross lesions were found in the liver (enlargement, congestion, yellowish color), kidneys (brownish color at surface and cut, and cysts), lungs (atelectasis, parenchymal consolidation, and secretions in bronchi and bronchioles), and heart (concentric and eccentric hypertrophy, hematic cysts, persistence of ductus arteriosus). Primary microscopic findings were seen in the liver, kidneys, and lungs from neonatal calves. In the liver, 85% of the animals exhibited hepatic degeneration. The presence of a brownish pigment within the cortical tubules of the kidneys was found in approximately 90% of the samples; the presence of this pigment has not been previously reported in cloned calves. In the lungs, a large number of animals exhibiting lesions characteristic of pneumonia (55%). These changes were the pivotal causes of death, mainly due to problems in adapting to life outside the uterus and opportunistic infections in the neonatal period. Further investigation focusing on pathological anatomical changes is necessary to map these abnormalities in cloned animals.(AU)

A transferência nuclear de células somáticas ou clonagem é uma técnica que permite produzir um indivíduo geneticamente igual a um outro indivíduo adulto. Esta técnica abre inúmeras possibilidades para a medicina e para a reprodução animal. Porém, existem inúmeros relatos de problemas associados à clonagem. A taxa de perda nos períodos embrionário e fetal ainda é muito alta quando comparada a outras biotécnicas; além disso, há uma maior incidência de hidropsias e distocias, diminuindo a eficiência e aumentando o custo da técnica. Os animais que vem a termo frequentemente apresentam uma síndrome chamada de macrossomia, e apresentam dificuldades de adaptação à vida extrauterina e, por isso, o óbito é um desfecho comum. No presente trabalho realizou-se necropsia e coleta de fragmentos de órgãos para avaliação histopatológica de 41 bezerros com óbito neonatal. As lesões macroscópicas mais importantes foram encontradas no fígado (hepatomegalia, congestão e coloração amarelada), rins (coloração amarronzada na superfície e ao corte, e cistos), pulmões (atelectasia, parênquima consolidado, e secreções nos brônquios e bronquíolos), e coração (hipertrofia concêntrica e excêntrica, cistos hemáticos e persistência de ducto arterioso). As principais alterações microscópicas observadas foram presença de pigmento acastanhado no interior dos túbulos corticais renais (aproximadamente 90% dos animais), degeneração hepática (85% das amostras avaliadas) e lesões características de pneumonia (55% dos animais). A pigmentação acastanhada no interior dos túbulos corticais é uma alteração que ainda não havia sido relatada anteriormente em animais clonados. As alterações observadas nestes órgãos foram determinantes para o óbito, e devem ter ocorrido sobretudo devido a problemas na adaptação ao ambiente extrauterino e em decorrência de infecções adquiridas no período neonatal. Os achados encontrados no presente trabalho denotam a necessidade de investigação anatomopatológica detalhada de animais clonados inviáveis, na tentativa de mapear as anormalidades apresentadas por eles.(AU)

Pathological features of cloned calves that died in the neonatal period / Aspectos patológicos de bezerros clonados com óbito no período neonatal

Somatic-cell nuclear transfer is a cloning technique that enables the creation of a viable embryo from a donor adult to produce a genetically identical individual. This technique opens numerous potential possibilities for medicine and animal reproduction. However, several reports have documented cloning-related issues. Embryo and fetal losses remain significantly higher than in other techniques, and there is a high incidence of dystocia and hydrops, which decreases efficiency and increases costs. Animals delivered at term often exhibit a syndrome known as macrosomia and experience difficulties in adapting to life outside the uterus, and death is a common outcome. In the present study, 41 cloned calves that died in the neonatal period were subjected to gross and histopathological examination. Most important gross lesions were found in the liver (enlargement, congestion, yellowish color), kidneys (brownish color at surface and cut, and cysts), lungs (atelectasis, parenchymal consolidation, and secretions in bronchi and bronchioles), and heart (concentric and eccentric hypertrophy, hematic cysts, persistence of ductus arteriosus). Primary microscopic findings were seen in the liver, kidneys, and lungs from neonatal calves. In the liver, 85% of the animals exhibited hepatic degeneration. The presence of a brownish pigment within the cortical tubules of the kidneys was found in approximately 90% of the samples; the presence of this pigment has not been previously reported in cloned calves. In the lungs, a large number of animals exhibiting lesions characteristic of pneumonia (55%). These changes were the pivotal causes of death, mainly due to problems in adapting to life outside the uterus and opportunistic infections in the neonatal period. Further investigation focusing on pathological anatomical changes is necessary to map these abnormalities in cloned animals.(AU)

A transferência nuclear de células somáticas ou clonagem é uma técnica que permite produzir um indivíduo geneticamente igual a um outro indivíduo adulto. Esta técnica abre inúmeras possibilidades para a medicina e para a reprodução animal. Porém, existem inúmeros relatos de problemas associados à clonagem. A taxa de perda nos períodos embrionário e fetal ainda é muito alta quando comparada a outras biotécnicas; além disso, há uma maior incidência de hidropsias e distocias, diminuindo a eficiência e aumentando o custo da técnica. Os animais que vem a termo frequentemente apresentam uma síndrome chamada de macrossomia, e apresentam dificuldades de adaptação à vida extrauterina e, por isso, o óbito é um desfecho comum. No presente trabalho realizou-se necropsia e coleta de fragmentos de órgãos para avaliação histopatológica de 41 bezerros com óbito neonatal. As lesões macroscópicas mais importantes foram encontradas no fígado (hepatomegalia, congestão e coloração amarelada), rins (coloração amarronzada na superfície e ao corte, e cistos), pulmões (atelectasia, parênquima consolidado, e secreções nos brônquios e bronquíolos), e coração (hipertrofia concêntrica e excêntrica, cistos hemáticos e persistência de ducto arterioso). As principais alterações microscópicas observadas foram presença de pigmento acastanhado no interior dos túbulos corticais renais (aproximadamente 90% dos animais), degeneração hepática (85% das amostras avaliadas) e lesões características de pneumonia (55% dos animais). A pigmentação acastanhada no interior dos túbulos corticais é uma alteração que ainda não havia sido relatada anteriormente em animais clonados. As alterações observadas nestes órgãos foram determinantes para o óbito, e devem ter ocorrido sobretudo devido a problemas na adaptação ao ambiente extrauterino e em decorrência de infecções adquiridas no período neonatal. Os achados encontrados no presente trabalho denotam a necessidade de investigação anatomopatológica detalhada de animais clonados inviáveis, na tentativa de mapear as anormalidades apresentadas por eles.(AU)

Rooting competence of mini-cuttings of Cabralea canjerana clones in different seasons / Enraizamento de miniestacas de clones de Cabralea canjerana em diferentes estações do ano

The objectives of this research were to evaluate the rooting competence of mini-cuttings throughout the four seasons and to estimate the adventitious rooting time of canjerana clones. A clonal mini-garden was established with 11 clones in a closed hydroponic system. Evaluations were performed throughout the four seasons for the number of mini-cuttings produced per mini-stump, percentage of survival and rooting of mini-cuttings, number of roots, average root length, and number of rooted mini-cuttings per mini-stump. Data were submitted to analysis of variance and means were compared. A rooting curve was estimated for clones 10SM05, 12SMI25, and 12SMI43 that exhibited high competence for adventitious rooting. Our results indicated that canjerana clones can be selected for adventitious rooting competence of mini-cuttings during different seasons, and that canjerana mini-cuttings should be cultivated for 63 days in a rooting chamber.(AU)

Os objetivos deste trabalho foram avaliar a competência ao enraizamento de miniestacas ao longo das quatro estações do ano e determinar o tempo de enraizamento adventício de clones de canjerana. O minijardim clonal foi estabelecido com 11 clones em um sistema fechado de cultivo. Foram realizadas avaliações do número total de miniestacas produzidas por minicepa, da percentagem de sobrevivência e de enraizamento das miniestacas, do número de raízes, do comprimento médio das raízes e contabilizado o número de miniestacas enraizadas por minicepa, ao longo das quatro estações do ano. Os dados foram submetidos à análise de variância e realizado teste de comparação de médias. Também foi elaborada a curva de enraizamento para os clones 10SM05, 12SMI25 e 12SMI43, com alta competência ao enraizamento adventício. Clones de canjerana podem ser selecionados para a competência ao enraizamento adventício das miniestacas nas diferentes estações do ano. Miniestacas de canjerana devem ser cultivadas em câmara úmida por 63 dias para o enraizamento.(AU)

Use of homologous recombination in yeast to create chimeric bovine viral diarrhea virus cDNA clones

The open reading frame of a Brazilian bovine viral diarrhea virus (BVDV) strain, IBSP4ncp, was recombined with the untranslated regions of the reference NADL strain by homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae, resulting in chimeric full-length cDNA clones of BVDV (chi-NADL/IBSP4ncp/2 and chi-NADL/IBSP4ncp/3). The recombinant clones were successfully recovered, resulting in viable viruses, having the kinetics of replication, focus size, and morphology similar to those of the parental virus, IBSP4ncp. In addition, the chimeric viruses remained stable for at least 10 passages in cell culture, maintaining their replication efficiency unaltered. Nucleotide sequencing revealed a few point mutations; nevertheless, the phenotype of the rescued viruses was nearly identical to that of the parental virus in all experiments. Thus, genetic stability of the chimeric clones and their phenotypic similarity to the parental virus confirm the ability of the yeast-based homologous recombination to maintain characteristics of the parental virus from which the recombinant viruses were derived. The data also support possible use of the yeast system for the manipulation of the BVDV genome.(AU)

ADAPTAÇÃO RESPIRATÓRIA NEONATAL: AVALIAÇÃO CLÍNICA, HEMOGASOMÉTRICA E DO ESTRESSE OXIDATIVO DE BEZERROS RECÉM-NASCIDOS PROVENIENTES DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL, FERTILIZAÇÃO IN VITRO E CLONAGEM ANIMAL

O sucesso da adaptação neonatal ocorre com o estabelecimento da função respiratória. Fisiologicamente, o neonato passa do ambiente hipóxico uterino para a hiperoxia do ar respirado após o nascimento. Assim, são produzidos radicais livres provenientes do oxigênio que estão relacionados ao aparecimento do estresse oxidativo, condição associada com diversas enfermidades. Bezerros originados por Fertilização In Vitro (FIV) e Clonagem Animal (CA) podem apresentar problemas ao nascimento e, devido ao seu alto valor genético e econômico, requerem do Médico Veterinário diagnóstico precoce e terapia eficaz em caso de má-adaptação neonatal. O objetivo deste trabalho foi comparar a influência de três métodos de concepção (Inseminação Artificial - IA, FIV e CA) sobre o status oxidativo, função pulmonar e adaptação pós-natal de recém-nascidos da espécie bovina. Para isso, foram utilizados 20 bezerros hígidos provenientes de IA, 15 neonatos originados por FIV e 15 recém-nascidos oriundos de CA. Todos os 50 animais foram monitorados do nascimento até 48 horas de vida, com avaliações realizadas com zero, seis, 12, 24 e 48 horas de vida. Nesses momentos, foram realizados: exame físico, hemogasometria (mensuração de pH, pressões parciais de oxigênio e de gás carbônico, bicarbonato, saturação de oxigênio, dióxido de carbono total e excesso de base) e verificação dos biomarcadores do status oxidativo (determinação das atividades enzimáticas da Superóxido Dismutase - SOD, Catalase e Glutationa Peroxidase GSH-Px, e das concentrações de Glutationa Total e Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico no sangue periférico por espectrofotometria). Ao nascimento também foram avaliados o Escore Apgar e medidas de comprimento de coluna e amplitude respiratória. Foi demonstrado que bezerros clonados possuem maior peroxidação lipídica causada pelo aumento da produção de radicais livres associado à diminuição da atividade da SOD. Além disso, os neonatos FIV tiveram maior atividade das enzimas antioxidantes Catalase e GSH-Px, seja por maior produção de peróxido de hidrogênio ou por resposta enzimática mais eficiente. Os bezerros do Grupo IA mostraram maiores valores para o Grupo Tióis Reduzidos (relacionado à glutationa reduzida). Os clones apresentaram acidose pós-parto mais acentuada do que a acidose mista fisiológica esperada para neonatos, o que ficou evidente pela diminuição de HCO3 e BE e aumento do TCO2 quando comparado aos demais grupos. Esse distúrbio refletiu-se na diminuição do escore Apgar e no aumento das frequências cardíaca e respiratória. Desta forma, o Grupo CA apresentou pior adaptação respiratória neonatal do que os outros grupos, e, por este motivo, necessita de acompanhamento intensivo, monitoramento através da realização de exames clínico e hemogasométrico repetidos e tratamento precoce apropriado, de maneira a assegurar a saúde desses animais.

The success of neonatal adaptation is directly related to the establishment of respiratory function that allows efficient gas exchange. Physiologically, the neonate abruptly passes from the hypoxic uterine environment to the hyperoxic air breathed after birth. With this, free radicals are produced from oxygen that may be related to the appearance of oxidative stress, a condition that has been associated with several diseases. Calves produced by In Vitro Fertilization (FIV) and Animal Cloning (CA) present some problems at birth, and due to their high genetic and economic value, require the Veterinarian to diagnose early and effective therapy in case of neonatal maladaptation. The objective of this study was to compare the influence of the three conception methods (Artificial Insemination - IA, FIV and CA) on oxidative status, postnatal adaptation and lung function of newborns of the bovine species. For this, 20 healthy calves from IA (Control Group), 15 neonates originated by FIV and 15 newborns from CA were used. All 50 animals were monitored from birth to 48 hours of life, with evaluations performed at 0, 6, 12, 24 and 48 hours of life. At these moments, physical examination, hemogasometry (pH measurement, partial pressures of oxygen and carbon dioxide, bicarbonate, oxygen saturation, total carbon dioxide and base excess) were carried out and verification of biomarkers of oxidative status (determination of activities enzymes of Superoxide Dismutase - SOD, Catalase and Glutathione Peroxidase GSH-Px, and Total Glutathione and Thiobarbituric Acid Substances in peripheral blood by colorimetric method). At birth, Apgar score and measurements of column length and respiratory amplitude were also performed. As results, it was obtained that cloned calves have higher production of free radicals by lipid peroxidation and that this factor was associated with a lower amount of SOD in this group. In addition, FIV neonates obtained higher concentrations of antioxidant enzymes with respect to Catalase and GSH-Px, either by higher production of hydrogen peroxide or by more efficient enzymatic response. Control Group calves showed higher values for reduced glutathione. In addition, the clones presented a more pronounced postpartum acidosis than the expected physiological acidosis expected for neonates, especially with regard to the metabolic component, which was evidenced by the changes in HCO3, TCO2 and BE when compared to the other groups. This disorder may have reflected Apgar score and heart and respiratory rates. Intensive follow-up of these infants is suggested for early diagnosis of respiratory maladaptation and correct treatment.

Comparação da imunolocalização de receptores de progesterona em placentas de bovinos normais e clonados / Comparison of the imunolocalization of progesterone receptors in placentas of bovine normal and cloned

A progesterona é um hormônio fundamental na manutenção da gestação nos mamíferos. Em bovinos clonados, perdas gestacionais significativas ocorrem devido à deficiência placentária. Tendo em vista esse problema, o objetivo do trabalho foi analisar em diferentes idades gestacionais a imunolocalização para receptores de progesterona em placentas de animais não clonados e clonados. Tecidos placentomais de bovinos não clonados foram obtidos da linha de abate no Matadouro Mantiqueira, enquanto os tecidos placentomais dos animais clonados com idades gestacionais de 68, 135, 225 e 270 dias de gestação foram obtidos em empresas especializadas em clonagem animal. Os tecidos foram processados e embebidos em paraplast para localização de receptores de progesterona, utilizando-se a técnica de imuno-histoquímica pelo anticorpo monoclonal (Progesterone receptor SER 294). Pela imuno-histoquímica, comparando-se a concentração de receptores de progesterona na placenta de animais clonados com as de animais não clonados, em diferentes idades gestacionais, observou-se que as células dos placentomas dos animais clonados apresentaram uma marcação mais intensa de receptor de progesterona nas idades de 135 e 270 dias de gestação em relação aos não clonados. Tal fato sugere que a presença de progesterona no final da gestação pode ser mais uma das possíveis causas de gestações prolongadas.(AU)

To progesterone is a fundamental hormone in the maintenance of the gestation in the mammals. In bovine they cloned, losses gestational significant, occur due to the placental deficiency. Having in mind that problem, the objective of the work was analyze in different gestational ages to immune stained for receivers of progesterone in placentas of normal animals and cloned. Placentomal tissues of bovine normal were obtained of the line of counts on in the Slaughterhouse Mantiqueira, while the placentomal tissues of the animals cloned with gestational ages of 68, 135, 225 and 270 days of gestation were obtained in companies specialized in animal cloning. The fabrics were prosecuted and absorbed in paraplast for progesterone receivers location, utilizing itself to technical of immunohistochemistry by the antibody monoclonal (Progesterone receiver BE 294). By the immunohistochemistry comparing the progesterone receivers concentration in the placenta of animals cloned, with the of animals done not manipulate, in different gestational ages we observe that the cells of the placentomal tissues of the animals manipulated (cloned) presented a more intense marking of receiver of progesterone in the ages of 135 and 270 days of gestation regarding the done not manipulate. Suggesting that the presence of progesterone in the end of the gestation can be more one of the possible cause of gestations prolonged.(AU)

Comparação da imunolocalização de receptores de progesterona em placentas de bovinos normais e clonados / Comparison of the imunolocalization of progesterone receptors in placentas of bovine normal and cloned

A progesterona é um hormônio fundamental na manutenção da gestação nos mamíferos. Em bovinos clonados, perdas gestacionais significativas ocorrem devido à deficiência placentária. Tendo em vista esse problema, o objetivo do trabalho foi analisar em diferentes idades gestacionais a imunolocalização para receptores de progesterona em placentas de animais não clonados e clonados. Tecidos placentomais de bovinos não clonados foram obtidos da linha de abate no Matadouro Mantiqueira, enquanto os tecidos placentomais dos animais clonados com idades gestacionais de 68, 135, 225 e 270 dias de gestação foram obtidos em empresas especializadas em clonagem animal. Os tecidos foram processados e embebidos em paraplast para localização de receptores de progesterona, utilizando-se a técnica de imuno-histoquímica pelo anticorpo monoclonal (Progesterone receptor SER 294). Pela imuno-histoquímica, comparando-se a concentração de receptores de progesterona na placenta de animais clonados com as de animais não clonados, em diferentes idades gestacionais, observou-se que as células dos placentomas dos animais clonados apresentaram uma marcação mais intensa de receptor de progesterona nas idades de 135 e 270 dias de gestação em relação aos não clonados. Tal fato sugere que a presença de progesterona no final da gestação pode ser mais uma das possíveis causas de gestações prolongadas.

To progesterone is a fundamental hormone in the maintenance of the gestation in the mammals. In bovine they cloned, losses gestational significant, occur due to the placental deficiency. Having in mind that problem, the objective of the work was analyze in different gestational ages to immune stained for receivers of progesterone in placentas of normal animals and cloned. Placentomal tissues of bovine normal were obtained of the line of counts on in the Slaughterhouse Mantiqueira, while the placentomal tissues of the animals cloned with gestational ages of 68, 135, 225 and 270 days of gestation were obtained in companies specialized in animal cloning. The fabrics were prosecuted and absorbed in paraplast for progesterone receivers location, utilizing itself to technical of immunohistochemistry by the antibody monoclonal (Progesterone receiver BE 294). By the immunohistochemistry comparing the progesterone receivers concentration in the placenta of animals cloned, with the of animals done not manipulate, in different gestational ages we observe that the cells of the placentomal tissues of the animals manipulated (cloned) presented a more intense marking of receiver of progesterone in the ages of 135 and 270 days of gestation regarding the done not manipulate. Suggesting that the presence of progesterone in the end of the gestation can be more one of the possible cause of gestations prolonged.

ESTUDO COMPARATIVO DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E VASCULARES DO ÚTERO DURANTE A PRENHEZ PRECOCE DE EMBRIÕES DE CLONES BOVINOS PRODUZIDOS POR SCNT EM TRÊS DIFERENTES APRESENTAÇÕES GESTACIONAIS

A clonagem por transferência de núcleo de células somáticas (SCNT) em bovinos é uma biotécnica ineficiente, porém é uma ferramenta muito importante para pesquisas em biologia do desenvolvimento. Estudos prévios em nosso laboratório identificaram três fenótipos gestacionais de clones bovinos produzidos por SCNT: (1) gestação normal (CNG) - presença do embrião (EP), vesícula embrionária (VE) e corpo lúteo ativo (CL); (2) gestação anembrionada (CAG) - presença da VE e CL ativo e ausência de EP; (3) receptoras com CL ativo persistente sem a presença de EP e VE (CPCL). Vacas doadoras de embriões foram sincronizadas pelo protocolo de super-ovulação (SOV) e inseminadas artificialmente, os embriões obtidos após sete dias da ovulação foram transferidos para receptoras que ao ficarem gestantes formaram o grupo controle (GC). O objetivou do estudo foi investigar as características morfovasculares do útero nestes quatro fenótipos gestacionais. A hipótese central foi que as características morfovasculares do útero são moduladas diferentemente nos três fenótipos gestacionais de embriões clonados por SCNT e gestação controle. Vacas Nelores foram sincronizadas e utilizadas como receptoras de embriões. Coletas de sangue para análise de progesterona e exames ultrassonográficos nos modos B e Doppler para análise da morfologia e vascularização uterina foram realizados a cada dois dias a partir do dia 6 até o dia 30 pós-ovulação. Entre os dias 31 e 36, as receptoras foram abatidas e o útero coletado para análises in situ. A simetria entre cornos, o grau de desenvolvimento de carúnculas e da VE foram mensurados e amostras endometriais coletadas para quantificação relativa do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seu receptor do tipo 2 (VEGF-R2) por western-blotting. No total foram realizadas 212 sincronizações do ciclo estral, das quais 79 receptoras receberam embriões de clones por SCNT e 49 receberam embriões produzidos in vivo. Aos 25 dias pós-ovulação as taxas de concepção por grupo foram: CNG = 15,1% (12/79), CAG = 2,5% (2/79), CPCL = 8,8% (7/79) e CG = 24,4% (10/49). Duas receptoras da raça Tabapuã (Bos taurus indicus) do fenótipo do grupo CAG provindas de outro experimento foram incluídas nas análises. Algumas receptoras foram excluídas do experimento devido a perdas gestacionais ocorridas antes do momento do abate, restando para as análises sete receptoras no grupo CNG, três no CAG, quatro no CPCL e nove no CG. Somente o grupo CG apresentou diferença de perfusão vascular entre os cornos uterinos ipso e contralateral (P<0,05). Em relação ao corno ipsolateral, os grupos CG e CNG apresentaram maior perfusão vascular em relação ao grupo CPCL do dia 24 ao 30 (P<0,05). Porém, com a média dos escores da perfusão vascular endometrial de ambos os cornos, o grupo CNG apresentou maiores valores em relação aos grupos CAG e CPCL nos dias 24 e 30. Os índices de resistência vascular (RI) nas artérias uterinas confirmaram os dados subjetivos de diferença de perfusão vascular entre cornos, o corno ipsolateral do grupo CG apresentou menor RI em relação ao contralateral nos dias 22, 24, 28 e 30 (P<0,05) e os grupos CNG e CPCL não apresentaram diferença entre cornos (P>0,05). Entre os grupos, o RI no CG e CAG foi menor que no CPCL no dia 30 (P<0,05). A concentração de progesterona (P4) sanguínea foi menor no grupo CPCL em relação aos grupos CG e CNG nos dias 18 e 26 (P<0,05). A P4 atingiu valores próximos de 8 ng/ml a partir do dia 22 nos grupos CG e CNG, sendo que no grupo CPCL os valores foram inferiores à 6 ng/ml a partir do dia 14. As análises in situ revelaram maior frequência de assimetria de cornos uterinos no grupo CG em relação aos grupos CNG, CAG e CPCL; o grupo CNG obteve maior frequência de ocorrência de carúnculas e VE desenvolvidas nos dois cornos uterinos em relação aos grupos CAG e CPCL (P<0,05), não diferindo do grupo CG (P>0,05). O comprimento dos embriões do grupo CNG foi maior que dos embriões do grupo CG (P<0,05), entre os dias 28 e 34. Não foi detectada diferença de abundância relativa das proteínas VEGF e VEGF-R2 entre os quatro grupos estudados, porém quando os grupos de gestações normais (CG e CNG) foram comparados com os grupos de gestações alteradas (CAG e CPCL) foi detectada maior abundância relativa para o fragmento de 75 kDa da proteína do VEGF-R2 no grupo de gestações alteradas. A hipótese central do estudo, que afirma que as alterações morfovasculares do útero gestante durante o primeiro mês são moduladas em diferentes graus de forma dependente à qualidade de desenvolvimento do concepto foi confirmada. Por fim, este estudo proporcionou um melhor entendimento da fisiologia endócrina, morfológica e vascular das gestações normais e alteradas de embriões clonados por SCNT durante o primeiro mês gestacional, fornecendo base para novos estudos sobre o desenvolvimento e manutenção da gestação inicial em bovinos.

Cloning by nuclear transfer of somatic cells (SCNT) in cattle is an inefficient biotechnique. However, it is a very important tool for research in developmental biology. Previous studies from our lab have identified three gestational phenotypes of bovine clones: (1) Clone normal gestation (CNG) presence of embryo (EP = embryo proper), embryonic vesicle (EV) and corpus luteum (CL); (2) Clone anembryonic gestation (CAG) - presence of EV and CL and no EP; (3) Recipient presenting only a persistent CL (CPCL). Embryo donor cows were synchronized by superovulation protocol (SOV) and artificially inseminated, embryos obtained after seven days of ovulation were transferred to the control group (CG). This study aimed to investigate whether modulation of the morphological and vascular abnormalities of the uterus by the presence of the cloned conceptus is different between the three gestational clone phenotypes and control. The central hypothesis was that the morphovascular characteristics of the uterus are modulated differently in the three gestational phenotypes of embryos cloned by SCNT and control gestation. Nellore cows were synchronized and used as embryo recipients. Blood collections for progesterone analysis and ultrasound examinations in B and Doppler modes for analysis of uterine morphology and vascularization were performed every two days from day 6 to day 30. Between 31 -36 days, the recipients were slaughtered and the uteri were collected for in situ analyzes. The symmetry between horns, the degree of caruncle and EV development were measured and endometrial samples were collected for relative quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor type 2 (VEGF-R2) by western blotting. A total of 212 estrous cycle synchronizations were performed, 79 recipients cows received clone embryos by SCNT and 49 embryos produced in vivo. At 25 days after ovulation the conception rates by group were: CNG = 15.1% (12/79), CAG = 2.5% (2/79), CPCL = 8.8% (7/79), and CG = 24.4% (10/49). Two pregnant cows Tabapuã (Bos taurus indicus) of CAG phenotype from another experiment were included in the analyzes. Some recipients were excluded from the experiment due to gestational losses occurring before the time of slaughter, remaining seven recipients in CNG group, three in CAG, four in CPCL and nine in CG. Only the CG group had a difference in vascular perfusion between the ipso and contralateral uterine horns (P<0.05). In relation to the ipsilateral horn, the CG and CNG groups presented higher vascular perfusion compared to the CPCL group from day 24 to 30 (P<0.05). However, with the average of endometrial vascular perfusion scores of both uterine horns, the CNG group presented higher values in compared to the CAG and CPCL groups on days 24 and 30. The vascular resistance index (RI) of the uterine arteries confirmed the subjective data of vascular perfusion between horns. The ipsilateral horn of the CG group presented lower RI in compared to the contralateral on days 22, 24, 28 and 30 (P<0, 05) and the CNG and CPCL groups did not show this difference between horns (P>0.05). Among groups, the RI in CG and CAG was lower than in the CPCL on day 30 (P<0.05). The blood progesterone (P4) concentration was lower in the CPCL group than in the CG and CNG groups on days 18 and 26 (P<0.05). P4 reached values close to 8 ng/ml after day 22 in the CG and CNG groups, and in the CPCL group the values were lower than 6 ng/ml after day 14. In situ analyzes revealed a higher frequency of uterine horn asymmetry in the CG group compared to the CNG, CAG and CPCL groups; the CNG group had a higher frequency of caruncles and EV development in the two uterine horns compared to the CAG and CPCL groups (P<0.05), not differing from the CG group (P>0.05). The length of the embryos of the CNG group was higher than that of the embryos of the CG group (P<0.05) between days 28 to 34. No difference was detected in the relative abundance of VEGF and VEGF-R2 proteins among the four groups, but when the normal gestation groups (CG and CNG) were compared with the altered pregnancies groups (CAG and CPCL) a greater relative abundance was detected for the 75 kDa fragment of the VEGF-R2 protein in the group of altered pregnancies. The central hypothesis of the study, which states that the morphovascular changes of the pregnant uterus during the first month are modulated in different degrees depending on the quality of development of the concept was confirmed. Finally, this study provided a better understanding of the endocrine, morphological and vascular physiology of normal and altered embryos of cloning by SCNT during the first gestational month, providing a basis for new studies on the development and maintenance of initial gestation in cattle.

Identification of the bacterial community responsible for traditional fermentation during sour cassava starch, cachaça and minas cheese production using culture-independent 16s rRNA gene sequence analysis

We used a cultivation-independent, clone library-based 16S rRNA gene sequence analysis to identify bacterial communities present during traditional fermentation in sour cassava starch, cachaça and cheese production in Brazil. Partial 16S rRNA gene clone sequences from sour cassava starch samples collected on day five of the fermentation process indicated that Leuconostoc citreum was the most prevalent species, representing 47.6% of the clones. After 27 days of fermentation, clones (GenBank accession numbers GQ999786 and GQ999788) related to unculturable bacteria were the most prevalent, representing 43.8% of the clones from the bacterial community analyzed. The clone represented by the sequence GQ999786 was the most prevalent at the end of the fermentation period. The majority of clones obtained from cachaça samples during the fermentation of sugar cane juice were from the genus Lactobacillus. Lactobacillus nagelli was the most prevalent at the beginning of the fermentation process, representing 76.9% of the clones analyzed. After 21 days, Lactobacillus harbinensis was the most prevalent species, representing 75% of the total clones. At the end of the fermentation period, Lactobacillus buchneri was the most prevalent species, representing 57.9% of the total clones. In the Minas cheese samples, Lactococcus lactis was the most prevalent species after seven days of ripening. After 60 days of ripening, Streptococcus salivarius was the most prevalent species. Our data show that these three fermentation processes are conducted by a succession of bacterial species, of which lactic acid bacteria are the most prevalent.

Aspectos morfológicos, vasculares e endócrinos de prenhezes produzidas por técnicas de reprodução assistida em bovinos

Perdas embrionárias e alterações gestacionais são frequentemente observadas em prenhezes de embriões bovinos manipulados in vitro. Sabe-se que tais anormalidades são resultantes de alterações epigenéticas ocasionadas pela manipulação dos gametas e/ou do embrião durante as técnicas de reprodução assistida (ARTs), com destaque para as técnicas de fecundação in vitro (FIV) e da clonagem por transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Tais alterações resultam em distúrbios no desenvolvimento do concepto em algum momento crítico entre a fertilização e o parto, fornecendo bons modelos de estudos sobre a fisiopatologia de perdas embrionárias e dos distúrbios de desenvolvimento. Caracterizam-se como momentos críticos após a transferência do embrião (TE) o desenvolvimento embrionário no útero, o reconhecimento materno da gestação, a placentação e o desenvolvimento da placenta e do feto, os quais tem de ser transpassados sem nenhuma falha, permitindo um desenvolvimento normal do concepto até o termo. Sendo assim, o presente trabalho abordou três fases distintas do amplo período gestacional em prenhezes por ARTs. O Estudo 1 foi realizado durante o período peri-reconhecimento materno da gestação e objetivou descrever a abundância de expressão de genes estimulados pelo interferon tau (ISGs) de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) maternas em gestações oriundas de ARTs no primeiro mês de gestação; o Estudo 2 compreendeu os primeiros 35 dias de gestação e objetivou descrever as mudanças morfológicas e vasculares do complexo útero-concepto-ovário e o estímulo à expressão de ISGs em PBMCs em gestações de conceptos clonados por SCNT com diferentes fenótipos de desenvolvimento, sendo esses denominados gestação anembrionada e CL persistente; e o Estudo 3 foi conduzido durante o período pré-parto e objetivou descrever as alterações na produção de esteroides sexuais e corticosteroides em gestações produzidas por ARTs. Três hipóteses foram testadas: (1) Gestações de conceptos clonados por SCNT apresentam uma baixa e mais tardia estimulação de ISGs em PBMCs maternas quando comparadas com gestações de conceptos produzidos por FIV e IA; (2) O concepto clonado por SCNT apresenta um menor estímulo sobre mudanças morfológicas e vasculares do complexo útero-ovário e ISGs em PBMCs maternas durante os primeiros 35 dias de gestação, quando comparado com conceptos oriundos de IA; e (3) Gestações de embriões oriundos de ARTs apresentam alterações na dinâmica esteroidogênica no pré-parto quando comparados com gestações de IA. No estudo 1 foram coletadas amostras de sangue de gestações produzidas por inseminação artificial (IA), FIV e clonagem por SCNT, nos dias 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e 31 pós-ovulação e foi realizada mensuração da abundância de transcritos de ISGs (OAS1 e ISG15) em PBMCs maternas. No estudo 2, gestações produzidas por IA e clonagem por SCNT, foram submetidas a escaneamentos ultrassonográficos dos ovários, útero e concepto a cada 3 dias do dia 14 ao 35 (dia 0 = ovulação) e amostras de sangue foram coletadas nos dias 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e 31 para mensuração da abundância de transcritos de ISGs (OAS1 e ISG15) em PBMCs maternas. No estudo 3, foram coletadas amostras de sangue no último mês em gestações naturais, oriundas de FIV e de clonagem por SCNT para análise hormonal de 10 esteroides utilizando o método de espectrometria de massas multi-hormonal de alta resolução LC-MS/MS. O primeiro estudo mostrou semelhanças na expressão de genes estimulados pelo IFNT em gestações oriundas de ARTs e produzidas por IA. Entretanto, a estimulação nas gestações oriundas de ARTs aparentou ser quatro dias mais prolongada, sugerindo uma maior funcionalidade do trofectoderma em conceptos oriundos de ARTs. O segundo estudo demonstrou um aumento na expressão de ISGs em PBMCs maternas tanto em gestações de conceptos normais quanto em anormais, justificando a manutenção da função luteal mesmo na ausência de detecção do concepto por ultrasonografia. No terceiro estudo, demonstrou-se alterações na esteroidogênese nas gestações de embriões FIV e clonados no último mês de gestação, sendo essas compatíveis com a hiperativação da enzima aromatase durante todo o último mês de gestações oriundas de FIV e hiperativação das enzimas P450C11 e P450C21 trinta dias antes do parto em gestações oriundas de clonagem por SCNT. O presente estudo concluiu que conceptos oriundos de FIV e clonagem por SCNT apresentam um prolongamento no estímulo de ISGs pelo IFNT, conceptos clonados anormalos apresentam estímulo de ISGs, o que justifica a manutenção da função luteal, e, por fim, a cascata esteroidonênica que culmina com o parto apresenta-se alterada em gestações oriundas de FIV e clonagem por SCNT.

Pregnancy losses and gestational abnormalities are frequently observed in pregnancies from in vitro produced embryos in bovines. It is known that these abnormalities are due to epigenetic changes from the manipulation of gametes and/or embryo during the use of assisted reproduction techniques (ARTs), especially for the in vitro fertilization (IFV) and cloning by somatic cells nuclear transfer (SCNT). These changes results in disturbances of conceptus development in any critical stage between the fertilization and parturition, which provides good models for the study of physiopathology of embryo losses and disturbances of development. Critical stages after the embryo transfer (ET) to the uterus are characterized as the maternal recognition of pregnancy, placentation, and fetal-placental development, which needs to be surpassed without failures, in order to develop a normal conceptus until term. Therefore, the present work approached three distinct phases of the wide gestational period in pregnancies from ARTs. The Study 1 was conducted during the maternal peri-recongnition of pregnancy period and aimed to describe the expression of interferon stimulated genes (ISGs) in maternal peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in pregnancies derived of ARTs; the Study 2 comprise the first 35 days of pregnancy and aimed to describe morphological and vascular changes of the complex uterus-ovaries-conceptus, as well as the expression of ISGs in maternal PBMCs in pregnancies of conceptus cloned by SCNT with different phenotypes of development, denominated as anembryonic gestation and persistent CL; the Study 3 was conducted during the pre-partum period and aimed to describe changes in the production of sexual steroids and corticosteroids during the last month of pregnancies derived of ARTs. Three hypothesis were tested: (1) Pregnancies of conceptus cloned by SCNT presented a decrease and delay in the stimulation of ISGs in maternal PBMCs when compared with conceptuses produced by IFV and AI; (2) Stimulus from the conceptus for changes in the morphology and vasculature of the the uterus-ovarian complex, detected by ultrasonography in B and Doppler modes, and the stimulation of ISGs in maternal PBMCs during the first 35 days of pregnancy of conceptus cloned by SCNT are less intense when compared with conceptus derived from AI; and (3) Pregnancies derived of ARTs present changes in the steroidogenic dynamics in the pre-partum, when compared with pregnancies derived from AI. In Study 1 blood samples were collected from pregnancies produced by AI, IVF, and cloning by SCNT, at days 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, and 31 post-ovulation for the measurement of abundance of transcripts of ISGs (OAS1 and ISG15) in maternal PBMCs. In Study 2, pregnancies derived of AI and cloning by SCNT, were submitted to ultrasonographic scans for the evaluation and description of morphological and vascular changes in ovaries, uterus, and conceptus every 3 days from day 14 to 35 (day 0 = ovulation) and blood samples were collected on days 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e 31 for the measurement of the abundance of transcripts of ISGs (OAS1 and ISG15) in maternal PBMCs. In Study 3, blood samples were collected during the last month of pregnancies naturally conceived, derived of IVF, and cloned by SCNT for the analysis of 10 steroids using the method of mass spectrometry high resolution LC-MS/MS. The first study showed similarities in the ISGs expression stimulation in pregnancies derived of ARTs and AI. However, the stimulation in the ART derived pregnancies was apparently 4 days longer, suggesting a greater placental function in conceptus derived of ARTs. The second study showed an increase in ISG expression in both normal and abnormal conceptus development, which justifies the maintenance of CL in the absence of a conceptus structure detected by ultrasonography. In the third study, was detected changes in the steroidogenesis of pregnancies derived of IFV and cloning by SCNT during the last month of pregnancy, which are compatible with the hyperactivation of the aromatase enzyme during the last month of IFV derived pregnancies, and hyperactivation of the enzymes P450C11 and P450C21 thirty days before parturition in pregnancies derived of cloning by SCNT. The present study concludes that conceptus derived of IFV and cloning by SCNT present a prolonged stimulus of ISGs, cloned conceptus with anomalous development presents a stimulus of ISGs, which justifies the CL function maintenance, and, ultimately, the steroidogenic cascade that culminates with the term is altered in pregnancies derived from IFV and cloning by SCNT.

Eficiência de um programa de clonagem bovina por SCNT e diferentes tipos de apresentações gestacionais

A clonagem bovina por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) é uma biotécnica ainda pouco eficiente devido aos elevados custos em sua aplicação e às altas perdas gestacionais oriundas de alterações do desenvolvimento embrionário e placentário. Desse modo, o uso comercial da clonagem bovina por SCNT é pouco viável atualmente, sendo aplicada majoritariamente em pesquisa. Nesse contexto, o presente trabalho objetivou estudar a eficiência de um programa de clonagem por SCNT, identificando pontos críticos no desenvolvimento do concepto, assim como detectar diferentes apresentações gestacionais induzidas por esta biotécnica. Para isso, 215 embriões clonados foram transferidos para receptoras de embriões e 30 prenhezes foram confirmadas pela detecção de batimentos cardíacos no concepto por ultrassonografia transretal, totalizando 14.0% de índice de gestação. Em 6.1% das receptoras foi identificado por ultrassonografia sinais das vesículas embrionárias sem presença de batimento cardíaco (gestações anembrionadas) e em 7.4% das receptoras não foram detectados sinais do concepto embora o CL tenha sido mantido por mais de 25 dias pós-ovulação (CLs persistentes). Este estudo mostrou que os maiores índices de perdas gestacionais ocorreram antes do dia 25 (dia 0 = ovulação). Ao analisar as perdas gestacionais após o diagnóstico de gestação (dia 25 a 35), um maior número de perdas ocorreu entre os dias 30 e 40 (26.7%) e entre os dias 40 e 60 (20.0%), não sendo identificada a formação de placentônios nessas prenhezes. Além disso, as receptoras gestantes que desenvolveram placentônios prolongaram a gestação após esses períodos críticos, sendo detectado um novo aumento da frequência de perdas no terço final da gestação. Sendo assim, o presente estudo confirma a baixa eficiência da técnica de clonagem bovina por SCNT e identifica os períodos críticos do desenvolvimento do concepto, sendo eles o período imediato pós-reconhecimento materno da gestação, anteriormente aos 25 dias, o período de completo desenvolvimento placentário e formação de placentônios, entre os dias 30 e 60, e o período de aumento da exigência funcional da placenta devido ao acelerado desenvolvimento do feto no terço final da gestação. Além disso, pela primeira vez na literatura é relatada a ocorrência das apresentações gestacionais aberrantes, as prenhezes anembrionadas e aquelas com CL persistente após a transferência de embriões clonados por SCNT. Novos estudos são necessários para um melhor entendimento da origem e das causas dessas apresentações, as quais podem ser decorrentes de perdas gestacionais precoces ou mau funcionamento de tecidos do concepto como o trofoectoderma e a massa celular interna.

Cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT) in cattle is still an inefficient biotechnique due to the high costs for its application and also to the high pregnancy losses resulted from changes in embryonic and placental development. Thus, the commercial use of the bovine cloning by SCNT is not commercially feasible, being mainly applied for research interests. In this context, the present study investigated the efficiency of a cloning program by SCNT with the objective of to identify the critical periods for conceptuses development and to detect different gestational presentations induced by this biotechnique. Two hundred fifteen embryos were transferred into embryo recipient cows and 30 pregnancies were confirmed by heart beats detection in the embryo by transrectal ultrasonography, totaling 14.0% of pregnancy rate. 6.1% of the recipients were diagnosed presenting embryonic vesicles without the presence of heart beats (anembryonic gestations) and 7.4% of the recipients did not present any signal of the conceptus and the CL kept active for more than 25 days postovulation (persistent CL). This study showed that the higher rates of embryo loss occurred before day 25 (day 0 = ovulation). Analyzing the data of pregnancy losses after diagnosis of pregnancy (days 25 to 35), higher amount of losses occurred between days 30 and 40 (26.7%) and between 40 and 60 (20.0%). Placentomes were not identified in any of these pregnancies. In addition, the recipient in which presented developed placentonios had their pregnancies prolonged. However, a new increase in the frequency of losses was observed in the final three months of gestation. Thus, this study confirms the low efficiency of bovine cloning by SCNT and identified the critical periods for the development of the conceptus, as the period immediately after maternal recognition of pregnancy, before 25 days of pregnancy, the period of full placental development and placentomes development, between days 30 and 60, and the period of placental functional requirements increase due to the rapid development of the fetus, during the last three months of gestation. Also, this work for the first time in the literature reported the occurrence of aberrant gestational presentations, the anembryonic and persistent CL gestations, after embryo transfer of bovine cloned embryos by SCNT. Further studies are necessary to understand the origin and causes of these aberrant gestational presentations, which may be due to early pregnancy loss or malfunction of conceptus tissues as trophoectoderm and inner cell mass.

Provas de função pulmonar para avaliação da capacidade pulmonar e de trocas gasosas em neonatos bovinos

As principais causas de morte perinatal em bezerros estão de alguma forma relacionadas a problemas cardiorrespiratórios. A maior parte de morte de bezerros ocorre justamente no período de até 48h após o nascimento, quando ainda estão sendo feitos os ajustes fisiológicos necessários à vida extrauterina. Com o aumento de animais advindos das técnicas de produção in vitro, também aumentaram os problemas de sobrevivência e sobrevida dos recém nascidos. Este estudo teve como objetivo geral padronizar valores de referência de hemogasometria e espirometria de bezerros a termo, nascidos por parto espontâneo, e prematuros, nascidos por cesariana, da raça Nelore concebidos por inseminação artificial (IA), assim como estabelecer protocolos de cuidados intensivos neonatais aos animais prematuros. Objetivamente, o estudo compreendeu: 1. A avaliação dos valores de pressão invasiva de átrio direito, ventrículo direito, artéria pulmonar e artéria pulmonar ocluída, hemogasometria, espirometria e capnografia de bezerros da raça Nelore, a termo, nascidos por parto espontâneo; 2. A avaliação e padronização da hemogasometria arterial de bezerros raça Nelore, a termo, nascidos de partos espontâneos; 3. A avaliação da pressão invasiva da artéria pulmonar e dos efeitos do sildenafil sobre os valores de pressão de artéria pulmonar em bezerros da raça Nelore, prematuros, nascidos por cesariana; 4. Diferenças hemodinâmicas (utilizando o cateter de Swan- Ganz), na função pulmonar e nas trocas gasosas entre bezerros a termo nascidos por parto espontâneo e prematuros nascidos por cesariana; 5. O estabelecimento de protocolos de cuidados neonatais para bezerros advindos de gestações complicadas com risco de morte neonatal prematura, onde foram realizadas 3 cesarianas em bezerros concebidos por IA e 16 concebidos por transferência nuclear por de células somática (clonagem), sendo estabelecidos protocolos de terapia neonatal com sildenafil, surfactante e oxigenoterapia. Bezerros da raça Nelore a termo nascidos por parto espontâneo estabilizam seus parâmetros de hemogasometria a valores de animais adultos em até 48 horas após o nascimento e têm valores de hemogasometria mais próximos dos valores normais para a espécie, enquanto os bezerros prematuros, nascidos por cesariana, têm valores mais deslocados em relação a normalidade. A padronização da hemogasometria de bezerros da raça Nelore nascidos por eutocia, pode fomentar as pesquisas com animais advindos de técnicas de PIV, assim como aumentar a sobrevida e sobrevivência além de diminuir a mortalidades desses animais. Já o sildenafil não apresenta efeitos adversos significativos quanto a oxigenação dos bezerros em que foi usado, mesmo quando houve alterações não desejadas da PAP. Dessa forma, quando não existe a possibilidade de se aferir a PAP e suspeita-se de hipertensão, o sildenafil é pode ser usado sem maiores consequências para a saúde do paciente.

The main causes of perinatal death in cattle are frequently related to cardiorespiratory distress. A great number of losses are placed during the first 48h after birth, when important physiological adjustments to the extra-uterine life are still in progress. Recent increase of offspring derived from assisted reproductive in vitro biotechnologies resulted in diminished survival rates of the newborn. The present study aimed to obtain standard values of hemodynamic evaluation, blood gas and spirometry of Nelore calves conceived by artificial insemination (AI) born at term, spontaneously, or from premature calves born by cesarean delivery, as well as to establish protocols of neonatal intensive care focusing on premature animals. Objectively, the study comprised: 1. The evaluation of invasive pressure values from right atrium, right ventricle, pulmonary artery and pulmonary wedge pressure, blood gas, spirometry and capnography of Nelore calves born spontaneously; 2. Evaluation and standardization of arterial blood gas of Nelore calves born at term spontaneously; 3. Evaluation of invasive pressure of pulmonary artery (PAP) and effects of sildenafil administration on its values from Nelore premature calves born by cesarean; 4. The comparison of hemodynamic, blood gas and spirometry of calves born at term spontaneously or premature calves born by cesarean delivery, during the first 30 days of life; 5. The establishment of neonatal care protocols focusing on complicated pregnancies at risk of premature neonatal death, when 3 cesarean sections of calves conceived by AI and 16 conceived by nuclear transfer of somatic cells (cloning) were monitored, and therefore protocols involving neonatal therapy with sildenafil, surfactant and oxygen therapy were established. Nelore calves born at term spontaneously have their blood gas stabilized in values similar to adult cattle until 48 hours after birth, and present a blood gas profile more similar to the expected for the species, whereas premature calves born from cesarean delivery present values different from normality. The standardization of blood gas of Nelore calves born at term from eutocic deliveries may promote better perinatal survival rates in offspring derived from in vitro production. The treatment with sildenafil does not present adverse effects related to the oxygen levels of calves even when adverse alterations were observed in PAP. Therefore, whenever hypertension is suspected and measurement of PAP is impaired, the sildenafil treatment may be used without major consequences to the patient health.

Construção e manipulação de clone infeccioso de uma amostra brasileira do vírus da diarreia viral bovina / Construction and manipulation of infectious clone from a brazilian bovine viral diarrhea virus isolate

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um patógeno de bovinos distribuído mundialmente, associado com importantes perdas econômicas. As maiores perdas devem-se aos problemas reprodutivos causados pela infecção, e pela capacidade do vírus de causar persistência após infecção fetal no terço inicial da gestação. Para entender melhor a biologia desse vírus, sistemas de genética reversa foram desenvolvidos e tem permitido a elucidação de vários aspectos da replicação viral, interação vírus hospedeiro, resposta imune e patogenia da infecção fetal. O presente estudo relata a construção, caracterização e manipulação de um clone infeccioso, a partir da cepa brasileira não-citopática IBSP4-ncp. O clone de DNA recombinante foi construído pela técnica de recombinação homóloga em levedura, utilizando um vetor de baixo número de cópias, construído a partir de três fragmentos genômicos, que compreendiam a fase aberta de leitura (open reading frame, ORF) do vírus. As duas regiões não traduzidas (5 e 3 UTR) foram substituídas pelas respectivas UTRs da cepa de referência NADL. O vetor construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK para recuperação de vírus infecciosos. Os vírus recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncp#2 e #3) foram mantidos por 10 passagens em cultivo celular e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus parental IBSP-4. A análise do genoma por sequenciamento revelou cinco mutações pontuais no gene Npro, com trocas de aminoácidos, provavelmente refletindo uma adaptação do vírus às UTRs heterólogas. O clone infeccioso construído CIpBSC_ IBSP4-ncp#2, foi então utilizado para a construção de um vírus recombinante expressando o gene repórter Gaussia luciferase (Gluc). O gene repórter foi inserido entre os genes Npro e Core do vírus. Para o processamento da proteína repórter, uma sequência ligante foi adicionada anteriormente ao gene, e a sequência da protease do vírus da Febre Aftosa (FMDV2Apro) foi inserida após o gene. O vetor recombinante construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK. Vírus recombinantes infecciosos foram recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 e #4) e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus obtido do clone infecioso. O gene repórter Gluc foi corretamente expresso e processado pelo vírus recombinante durante 15 passagens em cultivo celular. Com os resultados obtidos nestes estudos, conclui-se que o clone infeccioso construído pode ser facilmente manipulado e é capaz de carrear em seu genoma, e expressar de forma estável, genes heterólogos com até 555 pares de base, que parecem não interferir com sua capacidade replicativa. Dessa forma, o clone obtido pode ser muito útil para manipulação genética visando estudar diferentes aspectos da biologia do BVDV e de suas interações com o hospedeiro, assim como para a produção de cepas vacinais com fenótipo atenuado e/ou com marcadores antigênicos

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a worldwide pathogen associated with important losses to livestock production. Most of these losses come from reproductive disorders and from the ability of the virus to produce persistent infections following in utero infection of the fetus. A number of reverse genetics methodologies have been used for BVDV in order to better understand the biology of the virus, which allowed the elucidation of a number of biological features including virus replication, host-virus interaction, immune response, and the pathogenesis of fetal infection. The present study describes the construction, characterization and manipulation of an infectious clone out of a non-cytophatic Brazilian BVDV strain IBSP4-ncp. The cDNA recombinant clone was constructed by yeast homologous recombination with a low-copy vector, from three genomic fragments comprising the open reading frame (ORF). The two untranslated regions (5 and 3 UTR) were replaced by the respective UTRs of the reference strain NADL. The constructed vector was transcribed in vitro and the resulting RNA was transfected on MDBK cells to rescue infectious virus. The rescued viruses (IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 and #3) were maintained for ten passages in tissue culture and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology similar to those of the parental IBSP-4. Genomic analysis revealed five point mutations in the gene coding for Npro protein, resulting in amino acid changes. These mutations probably reflect an adaptation of the virus to the heterologous UTRs. The infectious clone IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 was further used for the construction of a recombinant virus expressing the Gaussia luciferase (Gluc) reporter gene. The reporter gene was inserted between the Npro and Core genes, being flanked by an upstream linker and a downstream sequence of the Foot and Mouth Disease virus protease (FMDV2Apro) for accurate protein processing. The recombinant vector was in vitro transcribed and the RNA was transfected on MDBK cells. Recombinant infectious viruses were rescued (IC-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 and #4) and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology similar to those of the parental IBSP-4 clone. The Gluc reporter gene was accurately expressed and processed by the recombinant virus during 15 passages in tissue culture. These studies revealed that the infectious clone constructed herein can be easily manipulated and is able to carry in its genome heterologous genes up to 555 base pairs in length in a stable fashion and without interference with its replication efficiency. Thus, the constructed clone may be very useful for genetic manipulation towards studying different aspects of the BVDV biology and its interactions with the host, and for the development of vaccine strains with attenuated phenotype and/or with antigenic markers

Manejo de palhada de cana colhida sem queima, produtividade do canavial e qualidade do caldo

The trash management of the sugarcane with harvest road green sugarcane associate to varieties more adapted can influence the production of stalk and the technological quality. The present work had as objective evaluating the influence of different sugarcane varieties submitted to systems of harvest management of green sugarcane about the production and the technological quality of the sugarcane. The treatments were the systems of trash management of the ratoon harvesting mechanically: straw without triturating/without cultivation (PST/SC); straw without triturating/with disk harrow cultivation (PST/CC); triturated straw/with disk harrow cultivation (PT/CC), cultivated with 18 sugarcane varieties (RB83-5486, RB85-5536, RB85-5546, RB84-5230, SP81-3250, SP80-3280, SP76-112, SP86-155, SP87-344, SP87-365, SP87-396, SP86-042, SP85-3877, SP84-5560, SP88-725, SP88-817, SP83-2847 Q-138). The technological quality of the sugarcane is affected by the varieties and system trash management of ratoon harvesting road green sugarcane. The use of the cultivation of the interlineations with disk harrow compared to the system without cultivation increased the production of stalk and the ton pol per ha, however, it reduced ATR and the pol of the ratoon harvesting road green sugarcane. The straw triturating in the treatments with use of the cultivation of the interlineations with disk harrow is not important in the production and in the stalk quality of the ratoon harvesting road green sugarcane.

O manejo da palhada da cana-de-açúcar com cana colhida sem queima associado a variedades mais adaptadas podem influenciar a produção de colmos e a qualidade do caldo. Assim, desenvolveu-se o presente trabalho com objetivo de avaliar a influência de diferentes variedades de cana-de-açúcar submetida a sistemas de manejo de colheita da cana colhida sem queima sobre a produção e a qualidade do caldo da cana-de-açúcar. Os tratamentos foram os sistemas de manejo da palhada da soqueira colhida mecanicamente: palha sem triturar/sem cultivo (PST/SC); palha sem triturar/com cultivo com escarificador (PST/CC); palha triturada/com cultivo com escarificador (PT/CC), cultivado com 18 variedades de cana-de-açúcar (RB83-5486, RB85-5536, RB85-5546, RB84-5230, SP81-3250, SP80-3280, SP76-112, SP86-155, SP87-344, SP87-365, SP87-396, SP86-042, SP85-3877, SP84-5560, SP88-725, SP88-817, SP83-2847 Q-138). A qualidade do caldo da cana-de-açúcar varia em função das variedades e sistema de manejo da palhada da soqueira da cana colhida sem queima. O uso do cultivo da entrelinha com escarificador comparado ao sistema sem cultivo aumentou a produção de colmos e a tonelada de sacarose aparente por ha, entretanto, reduziu ATR e a sacarose aparente das soqueiras da cana colhida sem queima. A trituração da palhada nos tratamentos com uso do cultivo da entrelinha com escarificador não é importante na produção e na qualidade de colmos das soqueiras da cana colhida sem queima.

Manejo de palhada de cana colhida sem queima, produtividade do canavial e qualidade do caldo

The trash management of the sugarcane with harvest road green sugarcane associate to varieties more adapted can influence the production of stalk and the technological quality. The present work had as objective evaluating the influence of different sugarcane varieties submitted to systems of harvest management of green sugarcane about the production and the technological quality of the sugarcane. The treatments were the systems of trash management of the ratoon harvesting mechanically: straw without triturating/without cultivation (PST/SC); straw without triturating/with disk harrow cultivation (PST/CC); triturated straw/with disk harrow cultivation (PT/CC), cultivated with 18 sugarcane varieties (RB83-5486, RB85-5536, RB85-5546, RB84-5230, SP81-3250, SP80-3280, SP76-112, SP86-155, SP87-344, SP87-365, SP87-396, SP86-042, SP85-3877, SP84-5560, SP88-725, SP88-817, SP83-2847 Q-138). The technological quality of the sugarcane is affected by the varieties and system trash management of ratoon harvesting road green sugarcane. The use of the cultivation of the interlineations with disk harrow compared to the system without cultivation increased the production of stalk and the ton pol per ha, however, it reduced ATR and the pol of the ratoon harvesting road green sugarcane. The straw triturating in the treatments with use of the cultivation of the interlineations with disk harrow is not important in the production and in the stalk quality of the ratoon harvesting road green sugarcane.

O manejo da palhada da cana-de-açúcar com cana colhida sem queima associado a variedades mais adaptadas podem influenciar a produção de colmos e a qualidade do caldo. Assim, desenvolveu-se o presente trabalho com objetivo de avaliar a influência de diferentes variedades de cana-de-açúcar submetida a sistemas de manejo de colheita da cana colhida sem queima sobre a produção e a qualidade do caldo da cana-de-açúcar. Os tratamentos foram os sistemas de manejo da palhada da soqueira colhida mecanicamente: palha sem triturar/sem cultivo (PST/SC); palha sem triturar/com cultivo com escarificador (PST/CC); palha triturada/com cultivo com escarificador (PT/CC), cultivado com 18 variedades de cana-de-açúcar (RB83-5486, RB85-5536, RB85-5546, RB84-5230, SP81-3250, SP80-3280, SP76-112, SP86-155, SP87-344, SP87-365, SP87-396, SP86-042, SP85-3877, SP84-5560, SP88-725, SP88-817, SP83-2847 Q-138). A qualidade do caldo da cana-de-açúcar varia em função das variedades e sistema de manejo da palhada da soqueira da cana colhida sem queima. O uso do cultivo da entrelinha com escarificador comparado ao sistema sem cultivo aumentou a produção de colmos e a tonelada de sacarose aparente por ha, entretanto, reduziu ATR e a sacarose aparente das soqueiras da cana colhida sem queima. A trituração da palhada nos tratamentos com uso do cultivo da entrelinha com escarificador não é importante na produção e na qualidade de colmos das soqueiras da cana colhida sem queima.

Análise de trilha de caracteres forrageiros do capim-elefante (Pennisetum purpureum Schum.)

The main goals of this work was to obtain estimates of phenotype, genotype and residual correlation coefficients and display genotype correlations in direct and indirect effects (path analysis) of height, diameter of stem at the base and number of tillers per meter (explanatory independent variables) on dry matter production (basic dependent variable) of elephantgrass clones in two harvest periods at conditions of northern Rio de Janeiro State, Brazil. Great differences among estimates in two harvest periods were observed, however it could be concluded that height of plants at cutting influenced dry matter production mainly in conditions of high tillering capable clones. Number of tillers per meter and diameter of stem explained better dry matter production potential, acting, respectively, in an direct and inverse way, alternating according to environmental conditions during growth.

Os objetivos deste trabalho consistiram em obter estimativas de coeficientes de correlação fenotípicos, genotípicos e residuais, e avaliar os desdobramentos das correlações genotípicas em efeitos diretos e indiretos (análise de trilha) das variáveis altura média das plantas, diâmetro médio do colmo e número de perfilhos por metro linear (variáveis independentes explicativas) na produção de matéria seca (variável dependente principal) de clones de capim-elefante em dois cortes realizados nas condições edafoclimáticas do norte do Estado do Rio de Janeiro. Houve grande diferença nas estimativas obtidas nos dois cortes, entretanto o estudo permitiu concluir que a altura das plantas no corte exerce influência na produção de matéria seca principalmente nas situações de clones de alta capacidade de perfilhamento. As características número de perfilhos por metro linear e diâmetro de perfilhos foram capazes de explicar melhor o potencial de produção de matéria seca, atuando, respectivamente, de forma direta e inversamente proporcionais sobre a variável básica, alternando-se em função das condições ambientais ocorridas durante o crescimento.

Análise de trilha de caracteres forrageiros do capim-elefante (Pennisetum purpureum Schum.)

The main goals of this work was to obtain estimates of phenotype, genotype and residual correlation coefficients and display genotype correlations in direct and indirect effects (path analysis) of height, diameter of stem at the base and number of tillers per meter (explanatory independent variables) on dry matter production (basic dependent variable) of elephantgrass clones in two harvest periods at conditions of northern Rio de Janeiro State, Brazil. Great differences among estimates in two harvest periods were observed, however it could be concluded that height of plants at cutting influenced dry matter production mainly in conditions of high tillering capable clones. Number of tillers per meter and diameter of stem explained better dry matter production potential, acting, respectively, in an direct and inverse way, alternating according to environmental conditions during growth.

Os objetivos deste trabalho consistiram em obter estimativas de coeficientes de correlação fenotípicos, genotípicos e residuais, e avaliar os desdobramentos das correlações genotípicas em efeitos diretos e indiretos (análise de trilha) das variáveis altura média das plantas, diâmetro médio do colmo e número de perfilhos por metro linear (variáveis independentes explicativas) na produção de matéria seca (variável dependente principal) de clones de capim-elefante em dois cortes realizados nas condições edafoclimáticas do norte do Estado do Rio de Janeiro. Houve grande diferença nas estimativas obtidas nos dois cortes, entretanto o estudo permitiu concluir que a altura das plantas no corte exerce influência na produção de matéria seca principalmente nas situações de clones de alta capacidade de perfilhamento. As características número de perfilhos por metro linear e diâmetro de perfilhos foram capazes de explicar melhor o potencial de produção de matéria seca, atuando, respectivamente, de forma direta e inversamente proporcionais sobre a variável básica, alternando-se em função das condições ambientais ocorridas durante o crescimento.