Resumo
ABSTRACT: Streptomyces sampsonii is a kind of biocontrol bacterium with antifungal effects, and chitinase is one of the main antifungal substances. To improve and further study the structure and function of the chitinase gene of S. sampsonii, we amplified the target fragment by PCR, ligated the fragment to the expression vector pET-32a, introduced the resulting plasmid into Escherichia coli BL21 (DE3) and induced expression of the chitinase. Then, the recombinant chitinase was purified by is-labelled protein micro purification kit. A chitinase gene, Sschi61, was cloned from the genome and expressed in a prokaryote. The antifungal effect of the recombinant protein was also studied. Finally, the chitinase gene Sschi61 with a length of 1755 bp was obtained, and the expression of the 82 kDa recombinant chitinase was induced in E. coli by IPTG. The recombinant chitinase could inhibit the black spot pathogen of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). After the hyphae of the pathogen of black spot of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) were soaked with recombinant chitinase, the hyphae cells expanded, broke, and dissolved.
RESUMO: Streptomyces sampsonii é uma espécie de bactéria de biocontrole com efeitos antifúngicos, sendo a quitinase uma das principais substâncias desse tipo. Para melhorar e estudar mais a estrutura e função do gene da quitinase de S. sampsonii, amplificamos o fragmento alvo por PCR, ligamos o fragmento ao vetor de expressão pET-32a, introduzimos o plasmídeo resultante em Escherichia coli BL21 (DE3) e induzimos expressão da quitinase. Em seguida, a quitinase recombinante foi purificada pelo kit de micropurificação de proteína marcada. Um gene da quitinase, Sschi61, foi clonado do genoma e expresso em um procarioto. O efeito antifúngico da proteína recombinante também foi estudado. Finalmente, o gene da quitinase Sschi61 foi obtido, contando comprimento de 1755 pb, e a expressão da quitinase recombinante de 82 kDa foi induzida em E. coli por IPTG. A quitinase recombinante pode inibir o patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). Após as hifas do patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) serem embebidas com quitinase recombinante, as células das hifas se expandiram, quebraram e se dissolveram.
Resumo
Streptomyces sampsonii is a kind of biocontrol bacterium with antifungal effects, and chitinase is one of the main antifungal substances. To improve and further study the structure and function of the chitinase gene of S. sampsonii, we amplified the target fragment by PCR, ligated the fragment to the expression vector pET-32a, introduced the resulting plasmid into Escherichia coli BL21 (DE3) and induced expression of the chitinase. Then, the recombinant chitinase was purified by is-labelled protein micro purification kit. A chitinase gene, Sschi61, was cloned from the genome and expressed in a prokaryote. The antifungal effect of the recombinant protein was also studied. Finally, the chitinase gene Sschi61 with a length of 1755 bp was obtained, and the expression of the 82 kDa recombinant chitinase was induced in E. coli by IPTG. The recombinant chitinase could inhibit the black spot pathogen of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). After the hyphae of the pathogen of black spot of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) were soaked with recombinant chitinase, the hyphae cells expanded, broke, and dissolved.
Streptomyces sampsonii é uma espécie de bactéria de biocontrole com efeitos antifúngicos, sendo a quitinase uma das principais substâncias desse tipo. Para melhorar e estudar mais a estrutura e função do gene da quitinase de S. sampsonii, amplificamos o fragmento alvo por PCR, ligamos o fragmento ao vetor de expressão pET-32a, introduzimos o plasmídeo resultante em Escherichia coli BL21 (DE3) e induzimos expressão da quitinase. Em seguida, a quitinase recombinante foi purificada pelo kit de micropurificação de proteína marcada. Um gene da quitinase, Sschi61, foi clonado do genoma e expresso em um procarioto. O efeito antifúngico da proteína recombinante também foi estudado. Finalmente, o gene da quitinase Sschi61 foi obtido, contando comprimento de 1755 pb, e a expressão da quitinase recombinante de 82 kDa foi induzida em E. coli por IPTG. A quitinase recombinante pode inibir o patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). Após as hifas do patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) serem embebidas com quitinase recombinante, as células das hifas se expandiram, quebraram e se dissolveram.
Assuntos
Streptomyces , Quitinases , Controle Biológico de Vetores , Células Clonais , AntifúngicosResumo
Alpha amylase, catalyzing the hydrolysis of starch is a ubiquitous enzyme with tremendous industrial applications. A 1698 bp gene coding for 565 amino acid amylase was PCR amplified from Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, cloned in pET21a (+) plasmid, expressed in BL21 (DE3) strain of E. coli and characterized. The recombinant enzyme exhibited molecular weight of 63 kDa, optimum pH 8, optimum temperature 70°C, and KM value of 157.7µM. On pilot scale, the purified enzyme efficiently removed up to 95% starch from the cotton fabric indicating its desizing ability at high temperature. 3D model of enzyme built by Raptor-X and validated by Ramachandran plot appeared as a monomer having 31% α-helices, 15% β-sheets, and 52% loops. Docking studies have shown the best binding affinity of enzyme with amylopectin (∆G -10.59). According to our results, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276, and Arg175 constitute the potential active site of enzyme.
A alfa-amilase, que catalisa a hidrólise do amido, é uma enzima ubíqua com imensas aplicações industriais. Um gene de 1698 pb que codifica a amilase de 565 aminoácidos foi amplificado por PCR, a partir de Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, clonado no plasmídeo pET21a (+), expresso na cepa BL21 (DE3) de E. coli e caracterizado. A enzima recombinante exibiu peso molecular de 63 kDa, pH ótimo igual a 8, temperatura ótima de 70° C e valor KM de 157,7 µM. Em escala piloto, a enzima purificada removeu com eficiência até 95% de amido do tecido de algodão, indicando sua capacidade de desengomagem em alta temperatura. O modelo 3D da enzima construída por Raptor-X e validada por Ramachandran plot apareceu como um monômero com 31% de hélices alfa, 15% de folhas beta e 52% de loops. Os estudos de docking mostraram melhor afinidade de ligação da enzima com amilopectina (∆G: - 10,59). De acordo com nossos resultados, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276 e Arg175 constituem o sítio ativo potencial da enzima.
Assuntos
Escherichia coli/genética , Geobacillus , Vetores Genéticos , alfa-Amilases/genéticaResumo
L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.
A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.
Assuntos
Anticarcinógenos/análise , Asparaginase/genética , Leucemia/tratamento farmacológico , Linfoma/tratamento farmacológico , Pyrococcus abyssi/enzimologiaResumo
Abstract Alpha amylase, catalyzing the hydrolysis of starch is a ubiquitous enzyme with tremendous industrial applications. A 1698 bp gene coding for 565 amino acid amylase was PCR amplified from Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, cloned in pET21a (+) plasmid, expressed in BL21 (DE3) strain of E. coli and characterized. The recombinant enzyme exhibited molecular weight of 63 kDa, optimum pH 8, optimum temperature 70°C, and KM value of 157.7µM. On pilot scale, the purified enzyme efficiently removed up to 95% starch from the cotton fabric indicating its desizing ability at high temperature. 3D model of enzyme built by Raptor-X and validated by Ramachandran plot appeared as a monomer having 31% -helices, 15% -sheets, and 52% loops. Docking studies have shown the best binding affinity of enzyme with amylopectin (G -10.59). According to our results, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276, and Arg175 constitute the potential active site of enzyme.
Resumo A alfa-amilase, que catalisa a hidrólise do amido, é uma enzima ubíqua com imensas aplicações industriais. Um gene de 1698 pb que codifica a amilase de 565 aminoácidos foi amplificado por PCR, a partir de Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, clonado no plasmídeo pET21a (+), expresso na cepa BL21 (DE3) de E. coli e caracterizado. A enzima recombinante exibiu peso molecular de 63 kDa, pH ótimo igual a 8, temperatura ótima de 70° C e valor KM de 157,7 µM. Em escala piloto, a enzima purificada removeu com eficiência até 95% de amido do tecido de algodão, indicando sua capacidade de desengomagem em alta temperatura. O modelo 3D da enzima construída por Raptor-X e validada por Ramachandran plot apareceu como um monômero com 31% de hélices alfa, 15% de folhas beta e 52% de loops. Os estudos de docking mostraram melhor afinidade de ligação da enzima com amilopectina (G: - 10,59). De acordo com nossos resultados, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276 e Arg175 constituem o sítio ativo potencial da enzima.
Resumo
Abstract L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.
Resumo A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.
Resumo
Alpha amylase, catalyzing the hydrolysis of starch is a ubiquitous enzyme with tremendous industrial applications. A 1698 bp gene coding for 565 amino acid amylase was PCR amplified from Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, cloned in pET21a (+) plasmid, expressed in BL21 (DE3) strain of E. coli and characterized. The recombinant enzyme exhibited molecular weight of 63 kDa, optimum pH 8, optimum temperature 70°C, and KM value of 157.7µM. On pilot scale, the purified enzyme efficiently removed up to 95% starch from the cotton fabric indicating its desizing ability at high temperature. 3D model of enzyme built by Raptor-X and validated by Ramachandran plot appeared as a monomer having 31% α-helices, 15% β-sheets, and 52% loops. Docking studies have shown the best binding affinity of enzyme with amylopectin (∆G -10.59). According to our results, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276, and Arg175 constitute the potential active site of enzyme.(AU)
A alfa-amilase, que catalisa a hidrólise do amido, é uma enzima ubíqua com imensas aplicações industriais. Um gene de 1698 pb que codifica a amilase de 565 aminoácidos foi amplificado por PCR, a partir de Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, clonado no plasmídeo pET21a (+), expresso na cepa BL21 (DE3) de E. coli e caracterizado. A enzima recombinante exibiu peso molecular de 63 kDa, pH ótimo igual a 8, temperatura ótima de 70° C e valor KM de 157,7 µM. Em escala piloto, a enzima purificada removeu com eficiência até 95% de amido do tecido de algodão, indicando sua capacidade de desengomagem em alta temperatura. O modelo 3D da enzima construída por Raptor-X e validada por Ramachandran plot apareceu como um monômero com 31% de hélices alfa, 15% de folhas beta e 52% de loops. Os estudos de docking mostraram melhor afinidade de ligação da enzima com amilopectina (∆G: - 10,59). De acordo com nossos resultados, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276 e Arg175 constituem o sítio ativo potencial da enzima.(AU)
Assuntos
alfa-Amilases/genética , Geobacillus , Escherichia coli/genética , Vetores GenéticosResumo
L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.(AU)
A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.(AU)
Assuntos
Linfoma/tratamento farmacológico , Leucemia/tratamento farmacológico , Pyrococcus abyssi/enzimologia , Anticarcinógenos/análise , Asparaginase/genéticaResumo
Alpha amylase, catalyzing the hydrolysis of starch is a ubiquitous enzyme with tremendous industrial applications. A 1698 bp gene coding for 565 amino acid amylase was PCR amplified from Geobacillus thermodenitrificans DSM465, cloned in pET21a (+) plasmid, expressed in BL21 (DE3) strain of E. coli and characterized. The recombinant enzyme exhibited molecular weight of 63 kDa, optimum pH 8, optimum temperature 70°C, and KM value of 157.7µM. On pilot scale, the purified enzyme efficiently removed up to 95% starch from the cotton fabric indicating its desizing ability at high temperature. 3D model of enzyme built by Raptor-X and validated by Ramachandran plot appeared as a monomer having 31% α-helices, 15% ß-sheets, and 52% loops. Docking studies have shown the best binding affinity of enzyme with amylopectin (∆G -10.59). According to our results, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276, and Arg175 constitute the potential active site of enzyme.
A alfa-amilase, que catalisa a hidrólise do amido, é uma enzima ubíqua com imensas aplicações industriais. Um gene de 1698 pb que codifica a amilase de 565 aminoácidos foi amplificado por PCR, a partir de Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, clonado no plasmídeo pET21a (+), expresso na cepa BL21 (DE3) de E. coli e caracterizado. A enzima recombinante exibiu peso molecular de 63 kDa, pH ótimo igual a 8, temperatura ótima de 70° C e valor KM de 157,7 µM. Em escala piloto, a enzima purificada removeu com eficiência até 95% de amido do tecido de algodão, indicando sua capacidade de desengomagem em alta temperatura. O modelo 3D da enzima construída por Raptor-X e validada por Ramachandran plot apareceu como um monômero com 31% de hélices alfa, 15% de folhas beta e 52% de loops. Os estudos de docking mostraram melhor afinidade de ligação da enzima com amilopectina (∆G: - 10,59). De acordo com nossos resultados, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276 e Arg175 constituem o sítio ativo potencial da enzima.
Assuntos
Escherichia coli/genética , alfa-Amilases/genética , alfa-Amilases/metabolismo , Temperatura , Estabilidade Enzimática , Clonagem Molecular , Geobacillus , Concentração de Íons de HidrogênioResumo
L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.
A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.
Assuntos
Humanos , Asparaginase/biossíntese , Asparaginase/farmacologia , Pyrococcus abyssi/enzimologia , Antineoplásicos/farmacologia , Especificidade por Substrato , Estabilidade Enzimática , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Proteínas Recombinantes/farmacologia , Células CACO-2 , Escherichia coli/genética , Simulação de Acoplamento Molecular , Concentração de Íons de HidrogênioResumo
The aim of this study was to produce high yield of a local bacterial alkaline protease in the yeast system because the scientific involvement of microorganisms in enzyme production is still not given enough attention in Saudi Arabia. Soil samples were collected from the rhizosphere of some desert plants in Saudi Arabia. Ninety-three alkaline protease producing bacterial isolates were recovered on skimmed-milk agar at pH 9.4 and 45°C for 48 hr. Isolate D9 obtained from the rhizosphere of Heliotropium digynum at Dhahran City was the most potent isolate in respect to enzyme productivity (184.6 U/ml). The full gene of alkaline protease was amplified and showed the expected size (1300 bp). Restriction enzymes analysis also verified the integrity of the PCR product. The sequence of the protease gene revealed an open reading frame of 1329 nt correspond to the full length of the protease gene of isolate D9 encoding a 443 aa protein. After ligation of the amplified gene by the TA cloning method, digestion with appropriate restriction enzymes confirmed the integrity of the cloned gene. The insert was prepared by two PCRs that were conducted with a pair of primers specifically designed for this purpose. The digested and purified cloning vector pRS426/GAL1p-207-Glu-MS was ligated with the insert then transformed into various strains of Saccharomyces cerevisiae via the electroporation method. Maximum protease expression was done by recombinant OS303 in galactose containing media (145.5 U/ml) with an approximately 2-fold increase when compared with the wild OS303 strain., this may be due to ability to activate gal operon.
O objetivo deste estudo foi produzir alto rendimento de uma protease alcalina bacteriana local no sistema de leveduras, já que o envolvimento científico de microrganismos na produção de enzimas ainda não recebe atenção suficiente na Arábia Saudita. Amostras de solo foram coletadas da rizosfera de algumas plantas do deserto na Arábia Saudita. Noventa e três isolados bacterianos produtores de protease alcalina foram recuperados em ágar de leite desnatado a pH 9,4 e 45°C por 48 horas. O isolado D9 obtido da rizosfera de Heliotropium digynum na cidade de Dhahran foi o mais potente em relação à produtividade da enzima (184,6 U/ml). O gene completo da protease alcalina foi amplificado e apresentou o tamanho esperado (1300 pb). A análise de enzimas de restrição também verificou a integridade do produto de PCR. A sequência do gene da protease revelou uma fase de leitura aberta de 1329 nt, correspondendo ao comprimento total do gene da protease do isolado D9 que codifica uma proteína 443 aa. Após a ligação do gene amplificado pelo método de clonagem TA, a digestão com enzimas de restrição apropriadas confirmou a integridade do gene clonado. A inserção foi preparada por dois PCRs que foram conduzidos com um par de primers projetados especificamente para esta finalidade. O vetor de clonagem digerido e purificado pRS426/GAL1p-207-Glu-MS foi ligado com a inserção e então transformado em várias cepas de Saccharomyces cerevisiae por meio do método de eletroporação. A expressão máxima da protease foi feita por OS303 recombinante em meio contendo galactose (145,5 U/ml) com um aumento de aproximadamente duas vezes quando comparado com a cepa OS303 selvagem, e isso pode ser por causa da capacidade de ativar o operon gal.
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Animais , Peptídeo Hidrolases , Saccharomyces cerevisiae , Leveduras , Ativadores de Enzimas , Enzimas/biossíntese , RizosferaResumo
The native stands of candeia (Eremanthus erythropappus) have been explored through management plans due to the economic potential of essential oil. The rescue of adult trees, as well as the application of silvicultural techniques that favor the restoration of the stand, can contribute to the genetic conservation of this species. This studys objective was to assess the efficiency of propagation techniques for the rescue of 26 matrices of candeia in a natural managed stand and discussion about the rhizogenesis. In August 2017, trees were induced to regrowth by coppice, followed by exposure and scarification of roots. The emergence of shoots and morphology were evaluated according to the origin (i.e., stump or root). After that period, 19 matrices had their sprouts collected for the preparation of apical cuttings. Indole-3-butyric acid (IBA) was applied at the base of the cuttings. Cutting survival at greenhouse exit (GE), rooting at shade house exit (SHE), morphology and root anatomy were evaluated. In 189 days, the scarification of roots promoted 76.92% of budding. The percentage of sprouted matrices, number of shoots per matrice, length, diameter, and shoot length/diameter ratio increased over time. Only 12.2% of the cuttings survived in GE, and of these, 7.9% rooted in SHE. The cutting resulted in the formation of a clonal mini-garden of candeia, with seven of the 19 matrices submitted to propagation. The anatomical analyses showed that bud formation occurs from cell redifferentiation in the phloem parenchyma, and presence of crystals on the walls of the vessel elements of the secondary xylem. The shoots induction from scarification of roots could be used as a silvicultural practice for the reestablishment of the native fragments handle.(AU)
Os povoamentos nativos de candeia (Eremanthus erythropappus) vêm sendo explorados por planos de manejo devido ao potencial econômico do óleo essencial. O resgate de árvores adultas, bem como a aplicação de técnicas silviculturais que favoreçam o restabelecimento do povoamento podem contribuir para a conservação genética dessa espécie. O objetivo desse trabalho foi avaliar a eficiência de técnicas de propagação para o resgate de 26 matrizes de candeia em um povoamento natural manejado e discutir sobre a rizogênese. Em agosto de 2017, as árvores foram induzidas à rebrota por meio da decepa, seguida da exposição e escarificação das raízes. A emissão brotações e morfologia foram avaliadas de acordo com a origem (toco ou raiz). Após esse período, 19 matrizes tiveram as brotações recolhidas para o preparo de estacas apicais, que foram tratadas com ácido indolbutírico (AIB). A sobrevivência das estacas na saída da casa de vegetação (SCV), o enraizamento na saída da casa de sombra (SCS), a morfologia e a anatomia da raiz foram avaliados. Aos 189 dias, a escarificação das raízes resultou em 76,92% de emissão de brotos. O percentual de matrizes brotadas, número de brotos por matriz, comprimento, diâmetro e relação comprimento/diâmetro dos brotos aumentaram ao longo do período avaliado. Somente 12,2% das estacas sobreviveram na SCV e 7,9% enraizaram na SCS. A estaquia resultou na formação de um minijardim clonal de candeia com sete das dezenove matrizes submetidas à propagação. As análises anatômicas mostraram a diferenciação das células na região do parênquima floemático e a presença de cristais de inulina nas paredes dos elementos de vaso do xilema secundário. A indução de brotos radiculares pode ser usada como prática silvicultural visando o restabelecimento de fragmentos nativos manejados.(AU)
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Asteraceae/crescimento & desenvolvimento , Desenvolvimento VegetalResumo
A biotecnologia vegetal é uma área de elevada importância, uma vez que tem a função de obter organismos vegetais com características superiores aos já existentes no mercado. A clonagem é uma das ferramentas que podem ser utilizadas para essa função, através dela, seleciona-se organismos com características de interesse e realiza-se a multiplicação deste individuo, garantindo que as plantas regeneradas sejam geneticamente idênticas a matriz desejada, estabelecendo uma padronização. Sabendo que o setor de plantas ornamentais contribui de maneira expressiva com a economia e dentre as plantas ornamentais de mais estima entre os brasileiros, encontram-se as orquídeas, que vem adquirindo visibilidade cultural e um grande número de colecionadores nos últimos anos. O objetivo, do presente trabalho, foi estabelecer um protocolo de assepsia eficiente para meristemas laterais e obtenção de clones da orquídea do gênero Phalaenopsis. Para metodologia, visando a padronização de um protocolo de assepsia, foram elaborados e testados 4 tratamentos que possuíam diferentes combinações (concentração x tempo) de agentes como o hipoclorito de sódio, álcool, cobre, tween e lavagem dos explantes com água destilada estéril para meristemas laterais da orquídea de gênero Phalaenopsis. Os meristemas, também conhecidos como gemas laterais, foram retirados do caule das plântulas, de suas hastes florais...
Plant biotechnology is an área of high importance since it has the function of obtaining plant organisms with characteristics superior to those already on the market. Cloning is one of the tools that can be used for this function, through it, organisms with characteristics of interest are selected and this individual is multiplied, ensuring that the regenerated plants are genetically identical to the desired matrix, establishing a standardization. Knowing that the ornamental plants sector contributes significantly to the economy and among the most esteemed ornamental plants among Brazilians, there are orchids which have acquired cultural visibility and a large number of collectors in recent years. The objective of the present work was to establish an efficient assepsis protocol for lateral meristems and to obtain clones of the orchid of the genus Phalaenopsis. For methodology, aiming at the standardization o fan asepsis protocol, 4 treatments were developed and tested with different combinations (concentration x time) of agents such as sodium hypochlorite, alcohol, copper, tween and washing the explants with sterile distilled wáter for meristems of the orchid of the genus Phalaenopsis. The meristems, also known as lateral buds, were removed from the stem of the seedlings, from their floral stems. As for obtained clones, the experiment carried out consisted of...
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Biotecnologia , Clonagem de Organismos , Orchidaceae , Técnicas In VitroResumo
A biotecnologia vegetal é uma área de elevada importância, uma vez que tem a função de obter organismos vegetais com características superiores aos já existentes no mercado. A clonagem é uma das ferramentas que podem ser utilizadas para essa função, através dela, seleciona-se organismos com características de interesse e realiza-se a multiplicação deste individuo, garantindo que as plantas regeneradas sejam geneticamente idênticas a matriz desejada, estabelecendo uma padronização. Sabendo que o setor de plantas ornamentais contribui de maneira expressiva com a economia e dentre as plantas ornamentais de mais estima entre os brasileiros, encontram-se as orquídeas, que vem adquirindo visibilidade cultural e um grande número de colecionadores nos últimos anos. O objetivo, do presente trabalho, foi estabelecer um protocolo de assepsia eficiente para meristemas laterais e obtenção de clones da orquídea do gênero Phalaenopsis. Para metodologia, visando a padronização de um protocolo de assepsia, foram elaborados e testados 4 tratamentos que possuíam diferentes combinações (concentração x tempo) de agentes como o hipoclorito de sódio, álcool, cobre, tween e lavagem dos explantes com água destilada estéril para meristemas laterais da orquídea de gênero Phalaenopsis. Os meristemas, também conhecidos como gemas laterais, foram retirados do caule das plântulas, de suas hastes florais...(AU)
Plant biotechnology is an área of high importance since it has the function of obtaining plant organisms with characteristics superior to those already on the market. Cloning is one of the tools that can be used for this function, through it, organisms with characteristics of interest are selected and this individual is multiplied, ensuring that the regenerated plants are genetically identical to the desired matrix, establishing a standardization. Knowing that the ornamental plants sector contributes significantly to the economy and among the most esteemed ornamental plants among Brazilians, there are orchids which have acquired cultural visibility and a large number of collectors in recent years. The objective of the present work was to establish an efficient assepsis protocol for lateral meristems and to obtain clones of the orchid of the genus Phalaenopsis. For methodology, aiming at the standardization o fan asepsis protocol, 4 treatments were developed and tested with different combinations (concentration x time) of agents such as sodium hypochlorite, alcohol, copper, tween and washing the explants with sterile distilled wáter for meristems of the orchid of the genus Phalaenopsis. The meristems, also known as lateral buds, were removed from the stem of the seedlings, from their floral stems. As for obtained clones, the experiment carried out consisted of...(AU)
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Orchidaceae , Técnicas In Vitro , Biotecnologia , Clonagem de OrganismosResumo
Cedrela fissilis is a species of great genetic diversity, with low population density and seminal propagation, which causes difficulties in the vegetative propagation process. This research evaluated the vegetative rescue and propagation of stem cutting rooting originated from epicormic and canopy sprouts of C. fissilis. For this, the induction of epicormic sprouts was evaluated 52 days after the complete girdling and semi-girdling 20 and 40 cm from the ground, and no girdling treatment, during spring (2018), summer (2018) and autumn (2019). The variables evaluated were, survival (%), sprouting (%), number, length (cm) and diameter (mm) of sprouts. The cuttings were made from spring epicormic sprouts, divided in two categories: 10 cm cuttings placed vertically in pits and 5 cm cuttings placed horizontally in furrows. The canopy sprouts were collected in the summer, then cut in apical and intermediate cuttings (15 cm). After 60 days, the cuttings were evaluated in survival (%), rooting (%), callus (%), average number and length of roots (cm). Results showed that only the complete girdling produced sprouts (average >67%) with no difference between 20 and 40 cm heights, with a greater number of sprouts during spring. The cuttings from epicormic sprouts, planted vertically in pits presented higher percentage of rooting (44%) than cuttings planted horizontally in furrows (17%). Cuttings from the canopy had inconsiderable rooting (apical - 2%; intermediate - 0%). The girdling periods influences the number of epicormic sprouts and its use for cutting was more efficient in rooting.
Cedrela fissilis é uma espécie de grande diversidade genética, com baixa densidade populacional florestal, de propagação seminal, que apresenta dificuldade de ser propagada vegetativamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar o regate e propagação vegetativa a partir do enraizamento de estacas de origem epicórmicas e de copa de C. fissilis. Para isso, a brotação epicórmica foi avaliada 52 dias após o anelamento completo e semianelamento nas alturas de 20 e 40 cm, e tratamento sem anelamento, durante primavera (2018), verão (2018) e outono (2019). Foram avaliados: sobrevivência das árvores (%), brotação (%), número, comprimento (cm) e diâmetro (mm) de brotos. A estaquia utilizou brotos epicórmicos de primavera, divididos em duas categorias: estacas com 10 cm colocadas verticalmente em covas e estacas de 5 cm colocadas horizontalmente em sulcos. Brotos de copa foram coletados no verão, cortados em estacas apicais e intermediárias (15 cm). Após 60 dias avaliou-se das estacas: sobrevivência (%), enraizamento (%), calos (%), número médio e comprimento de raízes (cm). Os resultados apresentam que apenas o anelamento completo formou brotos (média >67%), sem diferença entre a altura 20 e 40 cm, com maior número de brotos durante a primavera. As estacas de brotos epicórmicos, plantadas verticalmente em covas, apresentaram a maior porcentagem de enraizamento (44%) que estacas plantadas horizontalmente em sulcos (17%). Estacas de copa obtiveram enraizamento desconsiderável (apicais - 2%; intermediárias - 0%). As épocas de anelamento influenciam no número de brotos epicórmicos e seu uso como estacas foi mais eficiente no enraizamento.
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Cedrela/crescimento & desenvolvimento , Desenvolvimento VegetalResumo
ABSTRACT: The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.
RESUMO: O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.
Resumo
The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.(AU)
O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.(AU)
Assuntos
Testes Imunológicos , Imunoglobulina G , Vacinas , Neospora , Clonagem de OrganismosResumo
Cedrela fissilis is a species of great genetic diversity, with low population density and seminal propagation, which causes difficulties in the vegetative propagation process. This research evaluated the vegetative rescue and propagation of stem cutting rooting originated from epicormic and canopy sprouts of C. fissilis. For this, the induction of epicormic sprouts was evaluated 52 days after the complete girdling and semi-girdling 20 and 40 cm from the ground, and no girdling treatment, during spring (2018), summer (2018) and autumn (2019). The variables evaluated were, survival (%), sprouting (%), number, length (cm) and diameter (mm) of sprouts. The cuttings were made from spring epicormic sprouts, divided in two categories: 10 cm cuttings placed vertically in pits and 5 cm cuttings placed horizontally in furrows. The canopy sprouts were collected in the summer, then cut in apical and intermediate cuttings (15 cm). After 60 days, the cuttings were evaluated in survival (%), rooting (%), callus (%), average number and length of roots (cm). Results showed that only the complete girdling produced sprouts (average >67%) with no difference between 20 and 40 cm heights, with a greater number of sprouts during spring. The cuttings from epicormic sprouts, planted vertically in pits presented higher percentage of rooting (44%) than cuttings planted horizontally in furrows (17%). Cuttings from the canopy had inconsiderable rooting (apical - 2%; intermediate - 0%). The girdling periods influences the number of epicormic sprouts and its use for cutting was more efficient in rooting.(AU)
Cedrela fissilis é uma espécie de grande diversidade genética, com baixa densidade populacional florestal, de propagação seminal, que apresenta dificuldade de ser propagada vegetativamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar o regate e propagação vegetativa a partir do enraizamento de estacas de origem epicórmicas e de copa de C. fissilis. Para isso, a brotação epicórmica foi avaliada 52 dias após o anelamento completo e semianelamento nas alturas de 20 e 40 cm, e tratamento sem anelamento, durante primavera (2018), verão (2018) e outono (2019). Foram avaliados: sobrevivência das árvores (%), brotação (%), número, comprimento (cm) e diâmetro (mm) de brotos. A estaquia utilizou brotos epicórmicos de primavera, divididos em duas categorias: estacas com 10 cm colocadas verticalmente em covas e estacas de 5 cm colocadas horizontalmente em sulcos. Brotos de copa foram coletados no verão, cortados em estacas apicais e intermediárias (15 cm). Após 60 dias avaliou-se das estacas: sobrevivência (%), enraizamento (%), calos (%), número médio e comprimento de raízes (cm). Os resultados apresentam que apenas o anelamento completo formou brotos (média >67%), sem diferença entre a altura 20 e 40 cm, com maior número de brotos durante a primavera. As estacas de brotos epicórmicos, plantadas verticalmente em covas, apresentaram a maior porcentagem de enraizamento (44%) que estacas plantadas horizontalmente em sulcos (17%). Estacas de copa obtiveram enraizamento desconsiderável (apicais - 2%; intermediárias - 0%). As épocas de anelamento influenciam no número de brotos epicórmicos e seu uso como estacas foi mais eficiente no enraizamento.(AU)
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Cedrela/crescimento & desenvolvimento , Desenvolvimento VegetalResumo
Serine protease inhibitors (serpins), a superfamily of protease inhibitors, are known to be involved in several physiological processes, such as development, metamorphosis, and innate immunity. In our study, a full-length serpin cDNA, designated Haserpin1, was isolated from the cotton bollworm Helicoverpa armigera. The cDNA sequence of Haserpin1 is 1176 nt long, with an open reading frame encoding 391 amino acids; there is one exon and no intron. The predicted molecular weight of Haserpin1 is 43.53 kDa, with an isoelectric point of 4.98. InterProScan was employed for Haserpin1 functional characterization, which revealed that Haserpin1 contains highly conserved signature motifs, including a reactive center loop (RCL) with a hinge region (E341N350), the serpin signature, (F367F375) and a predicted P1P1 cleavage site (L357S358), which are useful for identifying serpins. Transcripts of Haserpin1 were constitutively expressed in the fat body, suggesting that it is the major site for serpin synthesis. During the developmental stages, a fluctuation in the expression level of Haserpin1 was observed, with low expression detected at the 5th-instar larval stage. In contrast, relatively high expression was detected at the prepupal stage, suggesting that Haserpin1 might play a critical role at the H. armigera wandering stage. Although the detailed function of this serpin (Haserpin1) needs to be elucidated, our study provides a perspective for the functional investigation of serine protease inhibitor genes.(AU)
Sabe-se que os inibidores de serina protease (serpinas), uma superfamília de inibidores de protease, estão envolvidos em vários processos fisiológicos, como desenvolvimento, metamorfose e imunidade inata. Neste estudo, um cDNA de serpina de comprimento total, denominado Haserpin1, foi isolado da lagarta Helicoverpa armigera na cultura de algodão. A sequência de ADNc de Haserpin1 tem 1.176 nt de comprimento, com uma grelha de leitura aberta que codifica 391 aminoácidos; existe um éxon, mas nenhum íntron. O peso molecular previsto de Haserpin1 é de 43,53 kDa, com um ponto isoelétrico de 4,98. O InterProScan foi empregado para a caracterização funcional do Haserpin1, que revelou que o Haserpin1 contém motivos de assinatura altamente conservados, incluindo um loop central reativo (RCL) com uma região de dobradiça (E341-N350), a assinatura da serpina (F367-F375) e um local de clivagem previsto de P1-P1' (L357-S358), que são úteis para identificar serpinas. As transcrições de Haserpin1 foram expressas constitutivamente no corpo gordo, sugerindo que é o principal local para a síntese de serpinas. Durante os estágios de desenvolvimento, observou-se uma flutuação no nível de expressão de Haserpin1, com baixa expressão detectada no estágio larval do 5º ínstar. Por outro lado, detectou-se uma expressão relativamente alta no estágio pré-pupal, sugerindo que o Haserpin1 pode desempenhar um papel crítico no estágio errante de H. armigera. Embora a função detalhada dessa serpina (Haserpin1) precise ser elucidada, este estudo fornece uma perspectiva para a investigação funcional dos genes inibidores da serina protease.(AU)
Assuntos
Gossypium/parasitologia , Pragas da Agricultura , Lepidópteros , Inibidores de Serina ProteinaseResumo
The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.(AU)
O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.(AU)