Viability of Toxoplasma gondii in cattle semen cryopreserved with different concentrations of cryoprotectant / Viabilidade do Toxoplasma gondii em sêmen de bovino criopreservado em diferentes concentrações de crioprotetores

ABSTRACT: Toxoplasma gondii can be eliminated in bovine semen. Cryopreserved semen is often used due to the fact that artificial insemination in dairy and beef cattle provides benefits in terms of production. However, little is known regarding the viability and infectivity of T. gondii tachyzoites in cryopreserved bovine semen. In the present study, cattle semen negative for T. gondii were contaminated with 1 x 106 tachyzoites (RH strain) and cryopreserved with and without different cryoprotectants, such as DMSO (concentrations of 2.5%, 5.0%, 7.5%, 8.0% and 10.0%) and glycerol (2.25%, 2.5%, 3.0%, 5.0%, 7.5% and 10.0%), followed by freezing in liquid nitrogen (-196°C). After 24 hours, the samples were thawed and inoculated in 10 mice per cryoprotectant concentration. The mice were evaluated for clinical signs of toxoplasmosis (rough coat, diarrhea, hypoactivity and sudden death) as well as serum titers of IgM and IgG and the presence of tachyzoites in the peritoneal lavage. The results revealed that T. gondii remained infective in all samples. Clinical signs of toxoplasmosis were observed in the mice beginning with the 6th day post-inoculation (DPI) and 100% lethality was found between the 7th and 9th DPI. Viable tachyzoites were recovered from peritoneal exudate of dead mice (except for the control group), with higher mean of tachyzoite counts in the intraperitoneal lavage for 5% DMSO (±3.32 x 106), 8% DMSO (±3.53 x 106), 3% glycerol (±4.75 x 106), 7.5% glycerol (±6.26 x 106) and the absence of cryoprotectant (±3.11 x 106). Seroconversion occurred in the treated groups, with titers of IgG from 1:16 to 1:128 and IgM from 1:16 to 1:512. T. gondii viability and infectivity were maintained in cattle semen during 24 hours of cryopreservation at -196°C with and without cryoprotectant. However, further studies are necessary to determine whether cryopreserved semen contributes to the spread of toxoplasmosis through artificial insemination.

RESUMO: Sabe-se que Toxoplasma gondii pode ser eliminado no sêmen bovino. A inseminação artificial em bovinos leiteiros e de corte proporcionou avanços e benefícios nas produções e para isso o sêmen criopreservado é frequentemente utilizado. No entanto, pouco se sabe sobre a viabilidade e infectividade dos taquizoítos de T. gondii em sêmen bovino criopreservado. Para isso o sêmen bovino, negativo para T. gondii, foi contaminado com 1x106 taquizoítos (cepa RH), criopreservados com ou sem diferentes crioprotetores como DMSO (2.5%, 5.0%, 7.5%, 8.0% e 10.0%) e Glicerol (2.25%, 2.5%, 3.0%, 5.0%, 7.5% e 10.0%) e congelados em nitrogênio líquido (-196°C). Após 24 horas, essas amostras foram descongeladas e inoculadas em 10 camundongos por diluente de concentração de crioprotetor. Os camundongos foram avaliados quanto a sinais clínicos de toxoplasmose (pele áspera, diarreia, hipoatividade e morte súbita), títulos séricos de IgM e IgG e presença de taquizoítos no lavado peritoneal. Os resultados mostraram que T. gondii se manteve infectante em todas as amostras, inclusive naquelas sem crioprotetor. Sinais clínicos de toxoplasmose foram observados nos camundongos a partir do 6º dia pós-inoculação (DPI) e 100% de letalidade foi verificada entre o 7º ao 9º DPI. Nos camundongos mortos, exceto no grupo controle, taquizoítos viáveis foram recuperados do exsudato peritoneal, com maior média de taquizoítos quantificados na lavagem intraperitoneal para DMSO a 5% (±3.32x106), 8% (±3.53x106) e glicerol 3% (±4.75x106), 7,5% (±6.26x106) e livre de crioprotetor (±3.11x106). A soroconversão ocorreu nos grupos tratados com títulos de IgG (1:16 a 1:128) e IgM (1:16 a 1:512). A viabilidade e infectividade do T. gondii no sêmen bovino durante as 24 horas de criopreservação a -196°C foram mantidas com ou sem crioprotetor. No entanto, mais estudos são necessários para verificar se o sêmen criopreservado contribui para a disseminação da toxoplasmose na inseminação artificial.

Criopreservação e crioprotetores na proteção do espermatozoide suíno / Cryopreservation and cryoprotectors in protection of the swine sperm

O uso de sêmen congelado apresenta menores índices de concepção e menor número de leitões nascidos por parto. Isso ocorre porque a criopreservação acarreta variações de temperatura, alteração da permeabilidade espermática e processos oxidativos, sendo que o sêmen suíno apresenta, naturalmente, baixa capacidade antioxidante e sofre estresse oxidativo. No entanto, vários crioprotetores são utilizados para diversas espécies e já é descrito o uso de colesterol, carreado com ciclodextrina, e de aminoácidos, visando a melhoria do sêmen após o descongelamento. A adição de colesterol ao sêmen, previamente à criopreservação, mantém a integridade da membrana acrossomal e retarda a capacitação espermática, feito que pode ser facilitado com o carreamento por ciclodextrina. Em paralelo, pesquisas apontam a importância do uso de aminoácidos no sêmen, que formam uma camada de proteção térmica que preserva a integridade da célula espermática, além de apresentarem função osmorregulativa. Nesse sentido, a viabilização da criopreservação do sêmen suíno favorece o melhoramento genético, minimiza a transmissão de patógenos e possibilita a formação de um banco de germoplasma. Para tanto, faz-se necessário o aprimoramento do uso de crioprotetores em uma proporção ideal, que mantenha a integridade da membrana espermática e não prejudique a capacitação espermática e a reação acrossomal, necessárias para a fecundação.

The use of frozen semen presents lower conception rates and fewer piglets born per birth. This is due to the fact that cryopreservation causes variations in temperature, changes in sperm permeability and oxidative processes, and the swine semen naturally presents low antioxidant capacity and undergoes oxidative stress. However, several cryoprotectants are used for several species, and the use of cyclodextrin and amino acid-loaded cholesterol is already described, aiming to improve the semen after thawing. The addition of cholesterol to the semen prior to cryopreservation maintains the integrity of the acrosomal membrane and slows sperm capacitation, which can be facilitated by cyclodextrin loading. In parallel, research indicates the importance of the use of amino acids in the semen, which form a layer of thermal protection that preserves the integrity of the sperm cell, in addition to presenting osmorregulatory function. In this sense, the viability of the cryopreservation of the swine semen favors the genetic improvement, minimizes the transmission of pathogens and allows the formation of a germplasm bank. Therefore, it is necessary to improve the use of cryoprotectants in an ideal proportion, which maintains the integrity of the sperm membrane and does not detract from the sperm capacitation and acrosomal reaction required for fertilization.

Criopreservação e crioprotetores na proteção do espermatozoide suíno / Cryopreservation and cryoprotectors in protection of the swine sperm

O uso de sêmen congelado apresenta menores índices de concepção e menor número de leitões nascidos por parto. Isso ocorre porque a criopreservação acarreta variações de temperatura, alteração da permeabilidade espermática e processos oxidativos, sendo que o sêmen suíno apresenta, naturalmente, baixa capacidade antioxidante e sofre estresse oxidativo. No entanto, vários crioprotetores são utilizados para diversas espécies e já é descrito o uso de colesterol, carreado com ciclodextrina, e de aminoácidos, visando a melhoria do sêmen após o descongelamento. A adição de colesterol ao sêmen, previamente à criopreservação, mantém a integridade da membrana acrossomal e retarda a capacitação espermática, feito que pode ser facilitado com o carreamento por ciclodextrina. Em paralelo, pesquisas apontam a importância do uso de aminoácidos no sêmen, que formam uma camada de proteção térmica que preserva a integridade da célula espermática, além de apresentarem função osmorregulativa. Nesse sentido, a viabilização da criopreservação do sêmen suíno favorece o melhoramento genético, minimiza a transmissão de patógenos e possibilita a formação de um banco de germoplasma. Para tanto, faz-se necessário o aprimoramento do uso de crioprotetores em uma proporção ideal, que mantenha a integridade da membrana espermática e não prejudique a capacitação espermática e a reação acrossomal, necessárias para a fecundação.(AU)

The use of frozen semen presents lower conception rates and fewer piglets born per birth. This is due to the fact that cryopreservation causes variations in temperature, changes in sperm permeability and oxidative processes, and the swine semen naturally presents low antioxidant capacity and undergoes oxidative stress. However, several cryoprotectants are used for several species, and the use of cyclodextrin and amino acid-loaded cholesterol is already described, aiming to improve the semen after thawing. The addition of cholesterol to the semen prior to cryopreservation maintains the integrity of the acrosomal membrane and slows sperm capacitation, which can be facilitated by cyclodextrin loading. In parallel, research indicates the importance of the use of amino acids in the semen, which form a layer of thermal protection that preserves the integrity of the sperm cell, in addition to presenting osmorregulatory function. In this sense, the viability of the cryopreservation of the swine semen favors the genetic improvement, minimizes the transmission of pathogens and allows the formation of a germplasm bank. Therefore, it is necessary to improve the use of cryoprotectants in an ideal proportion, which maintains the integrity of the sperm membrane and does not detract from the sperm capacitation and acrosomal reaction required for fertilization.(AU)

Uso da galactose na vitrificação de sêmen ovino em palhetas / Use of galactose to vitrify ram semen in straws

A vitrificação de espermatozoides é uma técnica que apresenta grande potencial para criopreservação de material genético, e sua eficácia tem sido superior aos métodos convencionais em algumas espécies. No entanto, existem poucos estudos sobre sua eficiência com sêmen ejaculado de carneiros e o uso da galactose como crioprotetor extracelular durante a vitrificação. Objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da galactose (0,01 M), associada ou não ao glicerol (3% e 7%), em meio comercial (Steridyl® - controle), na criopreservação de espermatozoides de carneiros pelo método de palhetas, comparando o método clássico de congelação e a vitrificação. Ejaculados de seis carneiros da raça Dorper em idade reprodutiva foram coletados com vagina artificial, aliquotados, diluídos individualmente (100 × 106 espermatozoides/mL) nos meios testados, envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos à congelação clássica ou vitrificação. Foram analisadas a cinemática, morfologia, morfometria, viabilidade, integridade física e funcional da membrana espermática. A congelação clássica obteve melhores resultados de motilidade total e progressiva do que a vitrificação nos quatro extensores testados, uma vez que as amostras vitrificadas não apresentaram motilidade pós-reaquecimento (p < 0,05). A adição de galactose ou glicerol ao meio comercial não trouxe efeito benéfico tanto para a vitrificação quanto congelação clássica.

Sperm vitrification is a technique with great potential for cryopreservation of genetic material, with superior effectiveness compared to conventional methods in some species. However, few studies have shown its efficiency with ejaculated sperm of rams and the use of galactose as an extracellular cryoprotectant during vitrification. This study aimed to evaluate the effect of galactose (0.01 M), with or without glycerol addition (3% and 7%) in a commercial extender (Steridyl® - control) for ram sperm cryopreservation in straws, comparing the classic freezing method and vitrification. Ejaculates from six breeding soundness Dorper rams were collected with an artificial vagina, aliquoted, individually diluted (100 × 106 sperm/mL) on extenders tested, loaded into 0.25 mL straws, and subjected to a classic freezing method or vitrification. Sperm kinematics, morphology, morphometry, viability, and physical and functional integrity of the sperm membrane were evaluated. The classic freezing method resulted in higher total and progressive motility than vitrification, as no motility was detected in vitrified samples after rewarming (p<0.05). The addition of galactose or glycerol to the commercial medium did not benefit both vitrification and the classic freezing method.

Uso da galactose na vitrificação de sêmen ovino em palhetas / Use of galactose to vitrify ram semen in straws

A vitrificação de espermatozoides é uma técnica que apresenta grande potencial para criopreservação de material genético, e sua eficácia tem sido superior aos métodos convencionais em algumas espécies. No entanto, existem poucos estudos sobre sua eficiência com sêmen ejaculado de carneiros e o uso da galactose como crioprotetor extracelular durante a vitrificação. Objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da galactose (0,01 M), associada ou não ao glicerol (3% e 7%), em meio comercial (Steridyl® - controle), na criopreservação de espermatozoides de carneiros pelo método de palhetas, comparando o método clássico de congelação e a vitrificação. Ejaculados de seis carneiros da raça Dorper em idade reprodutiva foram coletados com vagina artificial, aliquotados, diluídos individualmente (100 × 106 espermatozoides/mL) nos meios testados, envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos à congelação clássica ou vitrificação. Foram analisadas a cinemática, morfologia, morfometria, viabilidade, integridade física e funcional da membrana espermática. A congelação clássica obteve melhores resultados de motilidade total e progressiva do que a vitrificação nos quatro extensores testados, uma vez que as amostras vitrificadas não apresentaram motilidade pós-reaquecimento (p < 0,05). A adição de galactose ou glicerol ao meio comercial não trouxe efeito benéfico tanto para a vitrificação quanto congelação clássica.

Sperm vitrification is a technique with great potential for cryopreservation of genetic material, with superior effectiveness compared to conventional methods in some species. However, few studies have shown its efficiency with ejaculated sperm of rams and the use of galactose as an extracellular cryoprotectant during vitrification. This study aimed to evaluate the effect of galactose (0.01 M), with or without glycerol addition (3% and 7%) in a commercial extender (Steridyl® - control) for ram sperm cryopreservation in straws, comparing the classic freezing method and vitrification. Ejaculates from six breeding soundness Dorper rams were collected with an artificial vagina, aliquoted, individually diluted (100 × 106 sperm/mL) on extenders tested, loaded into 0.25 mL straws, and subjected to a classic freezing method or vitrification. Sperm kinematics, morphology, morphometry, viability, and physical and functional integrity of the sperm membrane were evaluated. The classic freezing method resulted in higher total and progressive motility than vitrification, as no motility was detected in vitrified samples after rewarming (p<0.05). The addition of galactose or glycerol to the commercial medium did not benefit both vitrification and the classic freezing method.

Uso do DMSO a 3% e diferentes concentrações de glicerol na curva de resfriamento do sêmen suíno / Use of 3% DMSO and different glycerol concentrations in the swine semen cooling curve

Este trabalho teve como objetivo testar o crioprotetor Dimetilsulfóxido (DMSO-3%) e o glicerol, em cinco concentrações (0,5%, 1%, 3%, 5% e 7%) em uma nova curva de resfriamento. Foram feitas sete coletas de sete varrões (n=49) através da técnica da mão enluvada. O DMSO (3%) e o glicerol foram adicionados separadamente ao diluente de congelação. Durante a análise da curva, a menor média de vigor espermático foi observada à concentração de 7% de glicerol. Na concentração de 1% de glicerol obteve-se maior média de motilidade espermática (72±12,3), sem diferença em relação à concentração de 5%. Maiores médias de vigor e motilidade espermática pós-descongelação foram observadas a3% de glicerol, diferindo das concentrações de 0,5% de glicerol e 3% de DMSO quanto ao vigor e dos demais tratamentos quanto à motilidade espermática. No teste de resistência osmótica o glicerol a 3% como diluente de congelação proporcionou melhor proteção à membrana espermática, diferindo dos demais tratamentos, exceto do DMSO a 3% e glicerola 1%. Observou-se maior porcentagem de células vivas na concentração de 5% e 7% de glicerol, diferindo das demais concentrações. Já o maior percentual de espermatozoides com acrossomas intactos foi observado quando se utilizou o diluente de congelação contendo glicerol a 3% (73,8±11,9). Os resultados do presente estudo, sugeriram que o glicerol, ainda é a melhor opção de crioprotetor a ser utilizada nos processos de criopreservação do espermatozoide suíno.

This study aimed to test the cryoprotectant Dimethylsulfoxide (DMSO-3%) and glycerol, in five concentrations (0.5%, 1%, 3%, 5% and 7%) in a new cooling curve. Seven collections from seven boars (n=49) through the gloved hand technique were made. DMSO (3%) and glycerol were added separately to the freezing diluent. During the analysis of the curve, the lowest mean sperm count was observed at a concentration of 7% glycerol. The concentration of 1% glycerol obtained more sperm motility (72±12.3) but, did not differ in concentrations of 5% glycerol. Higher mean sperm motility and vigor after thawing were observed at 3%glycerol, differing from 0.5% glycerol and 3% DMSO concentrations regarding vigor and other treatments regarding sperm motility. In the osmotic resistance test, 3% glycerol as a freezing agent provided better protection to the spermatic membrane, differing from the other treatments except for 3% DMSO and 1% glycerol. A higher percentage of living cells was observed in the 5% and 7% glycerol concentration, differing from the other concentrations. The highest percentage of spermatozoa with intact acrosomes was observed when the freezing diluent containing 3% glycerol (73.8±11.9) was used. The results of this study suggested that glycerol is still the best cryoprotective option to be used in cryopreservation processes of swine sperm.

Cryopreservation of Trichomonas gallinae trophozoites / Criopreservação de trofozoítos de Trichomonas gallinae

This study aimed at evaluating the viability of T. gallinae isolates with the use of cryoprotectants – DMSO, ethylene glycol (EG), glycerol (GL) and propylene glycol (PG) in a freezer, in nitrogen and in an ultrafreezer, 120 days. Cryopreservation with GL, the freezing process was only viable in an ultrafreezer (20%). The use of DMSO led to viable trophozoites (40%) when freezing took place in an ultrafreezer and in nitrogen. Freezing was viable when both cryoprotectants EG (90%) and PG (80%) were used in an ultrafreezer and in nitrogen.

Este estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de isolados de T. gallinae com o uso de crioprotetores - DMSO, etileno glicol (EG), glicerol (GL) e propileno glicol (PG) em freezer, nitrogênio e ultrafreezer, por 120 dias. Criopreservação com GL, o processo de congelamento só foi viável em um ultrafreezer (20%). O uso de DMSO levou a trofozoítos viáveis (40%) quando o congelamento ocorreu em um ultrafreezer e em nitrogênio. O congelamento foi viável quando ambos os crioprotetores, EG (90%) e PG (80%), foram utilizados em um ultrafreezer e em nitrogênio.

Uso do DMSO a 3% e diferentes concentrações de glicerol na curva de resfriamento do sêmen suíno / Use of 3% DMSO and different glycerol concentrations in the swine semen cooling curve

Este trabalho teve como objetivo testar o crioprotetor Dimetilsulfóxido (DMSO-3%) e o glicerol, em cinco concentrações (0,5%, 1%, 3%, 5% e 7%) em uma nova curva de resfriamento. Foram feitas sete coletas de sete varrões (n=49) através da técnica da mão enluvada. O DMSO (3%) e o glicerol foram adicionados separadamente ao diluente de congelação. Durante a análise da curva, a menor média de vigor espermático foi observada à concentração de 7% de glicerol. Na concentração de 1% de glicerol obteve-se maior média de motilidade espermática (72±12,3), sem diferença em relação à concentração de 5%. Maiores médias de vigor e motilidade espermática pós-descongelação foram observadas a3% de glicerol, diferindo das concentrações de 0,5% de glicerol e 3% de DMSO quanto ao vigor e dos demais tratamentos quanto à motilidade espermática. No teste de resistência osmótica o glicerol a 3% como diluente de congelação proporcionou melhor proteção à membrana espermática, diferindo dos demais tratamentos, exceto do DMSO a 3% e glicerola 1%. Observou-se maior porcentagem de células vivas na concentração de 5% e 7% de glicerol, diferindo das demais concentrações. Já o maior percentual de espermatozoides com acrossomas intactos foi observado quando se utilizou o diluente de congelação contendo glicerol a 3% (73,8±11,9). Os resultados do presente estudo, sugeriram que o glicerol, ainda é a melhor opção de crioprotetor a ser utilizada nos processos de criopreservação do espermatozoide suíno.(AU)

This study aimed to test the cryoprotectant Dimethylsulfoxide (DMSO-3%) and glycerol, in five concentrations (0.5%, 1%, 3%, 5% and 7%) in a new cooling curve. Seven collections from seven boars (n=49) through the gloved hand technique were made. DMSO (3%) and glycerol were added separately to the freezing diluent. During the analysis of the curve, the lowest mean sperm count was observed at a concentration of 7% glycerol. The concentration of 1% glycerol obtained more sperm motility (72±12.3) but, did not differ in concentrations of 5% glycerol. Higher mean sperm motility and vigor after thawing were observed at 3%glycerol, differing from 0.5% glycerol and 3% DMSO concentrations regarding vigor and other treatments regarding sperm motility. In the osmotic resistance test, 3% glycerol as a freezing agent provided better protection to the spermatic membrane, differing from the other treatments except for 3% DMSO and 1% glycerol. A higher percentage of living cells was observed in the 5% and 7% glycerol concentration, differing from the other concentrations. The highest percentage of spermatozoa with intact acrosomes was observed when the freezing diluent containing 3% glycerol (73.8±11.9) was used. The results of this study suggested that glycerol is still the best cryoprotective option to be used in cryopreservation processes of swine sperm.(AU)

Cryopreservation of Trichomonas gallinae trophozoites

Este estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de isolados de T. gallinae com o uso de crioprotetores - DMSO, etileno glicol (EG), glicerol (GL) e propileno glicol (PG) em freezer, nitrogênio e ultrafreezer, por 120 dias. Criopreservação com GL, o processo de congelamento só foi viável em um ultrafreezer (20%). O uso de DMSO levou a trofozoítos viáveis (40%) quando o congelamento ocorreu em um ultrafreezer e em nitrogênio. O congelamento foi viável quando ambos os crioprotetores, EG (90%) e PG (80%), foram utilizados em um ultrafreezer e em nitrogênio.(AU)

This study aimed at evaluating the viability of T. gallinae isolates with the use of cryoprotectants DMSO, ethylene glycol (EG), glycerol (GL) and propylene glycol (PG) in a freezer , in nitrogen and in an ultrafreezer, 120 days. Cryopreservation with GL, the freezing process was only viable in an ultrafreezer (20%). The use of DMSO led to viable trophozoites (40%) when freezing took place in an ultrafreezer and in nitrogen. Freezing was viable when both cryoprotectants EG (90%) and PG (80%) were used in an ultrafreezer and in nitrogen.(AU)

Cryopreservation of Trichomonas gallinae trophozoites / Criopreservação de trofozoítos de Trichomonas gallinae

This study aimed at evaluating the viability of T. gallinae isolates with the use of cryoprotectants DMSO, ethylene glycol (EG), glycerol (GL) and propylene glycol (PG) in a freezer, in nitrogen and in an ultrafreezer, 120 days. Cryopreservation with GL, the freezing process was only viable in an ultrafreezer (20%). The use of DMSO led to viable trophozoites (40%) when freezing took place in an ultrafreezer and in nitrogen. Freezing was viable when both cryoprotectants EG (90%) and PG (80%) were used in an ultrafreezer and in nitrogen.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de isolados de T. gallinae com o uso de crioprotetores - DMSO, etileno glicol (EG), glicerol (GL) e propileno glicol (PG) em freezer, nitrogênio e ultrafreezer, por 120 dias. Criopreservação com GL, o processo de congelamento só foi viável em um ultrafreezer (20%). O uso de DMSO levou a trofozoítos viáveis (40%) quando o congelamento ocorreu em um ultrafreezer e em nitrogênio. O congelamento foi viável quando ambos os crioprotetores, EG (90%) e PG (80%), foram utilizados em um ultrafreezer e em nitrogênio.(AU)

Cryopreservation of Trichomonas gallinae trophozoites

Este estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de isolados de T. gallinae com o uso de crioprotetores - DMSO, etileno glicol (EG), glicerol (GL) e propileno glicol (PG) em freezer, nitrogênio e ultrafreezer, por 120 dias. Criopreservação com GL, o processo de congelamento só foi viável em um ultrafreezer (20%). O uso de DMSO levou a trofozoítos viáveis (40%) quando o congelamento ocorreu em um ultrafreezer e em nitrogênio. O congelamento foi viável quando ambos os crioprotetores, EG (90%) e PG (80%), foram utilizados em um ultrafreezer e em nitrogênio.

This study aimed at evaluating the viability of T. gallinae isolates with the use of cryoprotectants – DMSO, ethylene glycol (EG), glycerol (GL) and propylene glycol (PG) in a freezer , in nitrogen and in an ultrafreezer, 120 days. Cryopreservation with GL, the freezing process was only viable in an ultrafreezer (20%). The use of DMSO led to viable trophozoites (40%) when freezing took place in an ultrafreezer and in nitrogen. Freezing was viable when both cryoprotectants EG (90%) and PG (80%) were used in an ultrafreezer and in nitrogen.

Vitrificação de embriões equinos: alternativas para melhorar as taxas de sobrevivência embrionária / Vitrification of equine embryos: alternatives to improve embryonic survival rates

A criopreservação de embriões permite a criação de um banco genético de alto valor zootécnico, aproveitando-se do melhor momento reprodutivo das doadoras, facilitando a comercialização de material genético. Os crioprotetores utilizados durante o processo de vitrificação, afetam o equilíbrio osmótico, evitando a formação de cristais de gelo durante a diminuição de temperatura. Além da escolha adequada dos crioprotetores, o sistema de envase utilizado e a característica de manipulação prévia a vitrificação, impactam a viabilidade embrionária pós aquecimento. Apesar dos protocolos de vitrificação para embriões pequenos (300 µm), que apresentam maior taxa de recuperação, os mesmos protocolos não apresentam sucesso. A eficiência do processo de vitrificação em estruturas maiores está relacionada a redução do tamanho da blastocele, exigindo equipamentos de maior custo. O objetivo dessa revisão é descrever o “estado da arte” da vitrificação de embriões equinos, descrevendo diferentes protocolos de vitrificação, manipulação prévia e sistema de envase.(AU)

Embryo cryopreservation allows the formation of a genetic bank from high genetical value animals, taking advantage of the best reproductive moment of the mares, facilitating its genetic material commercialization. Cryoprotectants used during the vitrification process act in osmotic equilibrium, preventing ice crystals formation during the temperature decrease. In addition to the appropriate choice of cryoprotectants, the characteristic of support/packaging used and the type of manipulation prior to vitrification impact the embryonic viability after heating. Although vitrification protocols for small embryos ( 300 µm) have higher recovery rates but low survival rates when the same protocols are used. Vitrification efficiency in larger structures is related to the reduction of blastocele size, requiring equipment with higher cost. The purpose of this review is to describe the state of the art of equine embryo vitrification by describing different vitrification protocols, previous manipulation and different storage systems.(AU)

Vitrificação de embriões equinos: alternativas para melhorar as taxas de sobrevivência embrionária / Vitrification of equine embryos: alternatives to improve embryonic survival rates

A criopreservação de embriões permite a criação de um banco genético de alto valor zootécnico, aproveitando-se do melhor momento reprodutivo das doadoras, facilitando a comercialização de material genético. Os crioprotetores utilizados durante o processo de vitrificação, afetam o equilíbrio osmótico, evitando a formação de cristais de gelo durante a diminuição de temperatura. Além da escolha adequada dos crioprotetores, o sistema de envase utilizado e a característica de manipulação prévia a vitrificação, impactam a viabilidade embrionária pós aquecimento. Apesar dos protocolos de vitrificação para embriões pequenos (300 µm), que apresentam maior taxa de recuperação, os mesmos protocolos não apresentam sucesso. A eficiência do processo de vitrificação em estruturas maiores está relacionada a redução do tamanho da blastocele, exigindo equipamentos de maior custo. O objetivo dessa revisão é descrever o “estado da arte” da vitrificação de embriões equinos, descrevendo diferentes protocolos de vitrificação, manipulação prévia e sistema de envase.

Embryo cryopreservation allows the formation of a genetic bank from high genetical value animals, taking advantage of the best reproductive moment of the mares, facilitating its genetic material commercialization. Cryoprotectants used during the vitrification process act in osmotic equilibrium, preventing ice crystals formation during the temperature decrease. In addition to the appropriate choice of cryoprotectants, the characteristic of support/packaging used and the type of manipulation prior to vitrification impact the embryonic viability after heating. Although vitrification protocols for small embryos ( 300 µm) have higher recovery rates but low survival rates when the same protocols are used. Vitrification efficiency in larger structures is related to the reduction of blastocele size, requiring equipment with higher cost. The purpose of this review is to describe the state of the art of equine embryo vitrification by describing different vitrification protocols, previous manipulation and different storage systems.

Aspectos gerais da criopreservação de sêmen suíno / General aspects of boar semen cryopreservation

A utilização de sêmen congelado para inseminações artificiais já vem sendo estudada há mais de 30 anos e os avanços nesta área se devem principalmente às pesquisas dos diferentes fatores que influenciam a conservação do sêmen e fertilidade de um ejaculado. O protocolo ideal de criopreservação não foi totalmente elucidado por pesquisadores da área, apesar de ser bastante utilizado para conservação de tecidos e de células, como os espermatozoides. Isto se deve ao fato de que o sucesso da criopreservação depende de diferentes parâmetros, entre eles a utilização de crioprotetores; bem como uma concentração adequada, o que varia de espécie para espécie. Vários estudos foram feitos para se obter uma melhor congelação de sêmen suíno, com o objetivo de diminuir os índices de crioinjúrias causados pelo abaixamento de temperatura. Apesar de ainda existirem muitos problemas no processo de criopreservação de sêmen do varrão, alguns autores relatam que o uso do sêmen congelado superará o do sêmen resfriado, por ser um procedimento que permite preservar células por longos períodos de tempo. Este trabalho teve como objetivo relatar os principais problemas ligados à congelação de sêmen e os avanços da técnica utilizada para tal, através de um levantamento geral acerca dos principais aspectos ligados à criopreservação, com ênfase na espécie suína.

The use of frozen semen for artificial insemination has been studied for over 30 years and the advances in this area are mainly due to research the different factors that influence the semen retention and fertility of an ejaculate. The optimal protocol for cryopreservation has not been fully elucidated by researchers in the field, even though it is often used for preservation of tissues and cells such as sperm cells. This is due to the fact that the success of cryopreservation depends on different parameters, among them the use of cryoprotectants as well as a suitable concentration, which differ between species. Several studies were made seeking a better freezing of boar semen, also, aiming to reduce the rates of freezing damages caused by the lowering of temperature. Although there are still many problems in the process of cryopreservation of boar semen, some authors report that the use of frozen semen, outrank the cooled semen, due to a procedure that preserves cells for long periods of time. This study aimed to report the main problems associated with freezing semen, and technique advances through a general survey about the main aspects of cryopreservation with emphasis on swine.

Aspectos gerais da criopreservação de sêmen suíno / General aspects of boar semen cryopreservation

A utilização de sêmen congelado para inseminações artificiais já vem sendo estudada há mais de 30 anos e os avanços nesta área se devem principalmente às pesquisas dos diferentes fatores que influenciam a conservação do sêmen e fertilidade de um ejaculado. O protocolo ideal de criopreservação não foi totalmente elucidado por pesquisadores da área, apesar de ser bastante utilizado para conservação de tecidos e de células, como os espermatozoides. Isto se deve ao fato de que o sucesso da criopreservação depende de diferentes parâmetros, entre eles a utilização de crioprotetores; bem como uma concentração adequada, o que varia de espécie para espécie. Vários estudos foram feitos para se obter uma melhor congelação de sêmen suíno, com o objetivo de diminuir os índices de crioinjúrias causados pelo abaixamento de temperatura. Apesar de ainda existirem muitos problemas no processo de criopreservação de sêmen do varrão, alguns autores relatam que o uso do sêmen congelado superará o do sêmen resfriado, por ser um procedimento que permite preservar células por longos períodos de tempo. Este trabalho teve como objetivo relatar os principais problemas ligados à congelação de sêmen e os avanços da técnica utilizada para tal, através de um levantamento geral acerca dos principais aspectos ligados à criopreservação, com ênfase na espécie suína.(AU)

The use of frozen semen for artificial insemination has been studied for over 30 years and the advances in this area are mainly due to research the different factors that influence the semen retention and fertility of an ejaculate. The optimal protocol for cryopreservation has not been fully elucidated by researchers in the field, even though it is often used for preservation of tissues and cells such as sperm cells. This is due to the fact that the success of cryopreservation depends on different parameters, among them the use of cryoprotectants as well as a suitable concentration, which differ between species. Several studies were made seeking a better freezing of boar semen, also, aiming to reduce the rates of freezing damages caused by the lowering of temperature. Although there are still many problems in the process of cryopreservation of boar semen, some authors report that the use of frozen semen, outrank the cooled semen, due to a procedure that preserves cells for long periods of time. This study aimed to report the main problems associated with freezing semen, and technique advances through a general survey about the main aspects of cryopreservation with emphasis on swine.(AU)

Surubim-do-Paraíba oocytes viability after being exposed to different cryoprotectants / Viabilidade de oócitos de surubim do Paraíba após exposição a diferentes crioprotetores

To know the non-toxic cryoprotectants to fish oocytes is of extreme importance for tests that aim to increase oocyte resistance to cold, thus allowing more advanced studies in cryopreservation. Therefore, commonly used cryoprotectants such as methanol, dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, propylene glycol, sucrose and fructose were studied. Immature oocytes from the initial to vitelogenic (diameter 1.7 mm) and mature (diameter >1.8 mm) stages of Steindachneridion parahybae were evaluated. Four distinct experiments were performed, three using immature oocytes and one using oocytes at the mature stage. For each oocyte stage, the best maintenance solution to be used: Hank or 50% L15 and; viability after baths for 30min (room temperature) at cryoprotectant concentrations ranging from 0.25 to 4M were evaluated. Different tests were used to evaluate oocyte viability: in vitro maturation followed by observation of germinal vesicle breakdown (only for immature oocytes), Trypan Blue staining (all stages) and fertilization and hatching rates (mature stage only). Results showed that the toxic effect of cryoprotectants on oocytes generally increases with increasing concentrations. Sensitivity of oocytes to cryoprotectants increases according to the stage of development, with mature oocytes being more sensitive. Sucrose, fructose, methanol, propylene glycol and dimethyl sulfoxide can be used as cryoprotectants for S. parahybae oocytes.(AU)

Conhecer os crioprotetores não tóxicos aos oócitos de peixes é de extrema importância para testes que visam aumentar a resistência dos oócitos ao frio, permitindo, assim, estudos mais avançados em criopreservação. Desta forma, crioprotetores comumente utilizados como o metanol, dimetil sulfóxido, etilenoglicol, propilenoglicol, sacarose e frutose foram estudados. Os oócitos imaturos, nos estágios inicial até vitelogênico (diâmetro 1,7mm), e maduros (diâmetro >1,8mm) de Steindachneridion parahybae foram avaliados. Quatro experimentos distintos foram realizados, sendo três destes utilizando oócitos imaturos, e um usando oócitos no estágio maduro. Para cada estágio oocitários foram avaliados, considerando qual a melhor solução de manutenção a ser utilizada: Hank ou 50% L15 e; viabilidade após banhos por 30min (temperatura ambiente) em concentrações de crioprotetores, variando de 0,25 a 4M. Diferentes testes foram utilizados para avaliar a viabilidade dos oócitos: maturação in vitro seguido por observação da quebra da vesícula germinativa (somente para oócitos imaturos), coloração por Azul de Tripan (todos os estágios) e taxas de fertilização e eclosão (somente no estágio maduro). Os resultados mostraram que o efeito tóxico dos crioprotetores em oócitos geralmente crescem com o aumento das concentrações. A sensibilidade dos oócitos a crioprotetores aumentam de acordo com o estágio de desenvolvimento, com oócitos maduros sendo mais sensíveis. Sacarose, frutose, metanol, propileno glicol e dimetil sulfóxido podem ser usados como crioprotetores para oócitos de S. parahybae.(AU)

Cryopreservation of testicular tissue: an alternative to maintain the reproductive capacity in different animal species / Criopreservação do tecido testicular: uma alternativa para manter a capacidade reprodutiva em diferentes espécies animais

Cryopreservation of testicular tissue enables the maintenance of reproductive capacity in different animal species, and contributes to the formation of gene banks for endangered species. The spermatogonia present in the testes can be grown in vitro and the sperm obtained can be used in artificial breeding programs. This review aimed to describe the main techniques of testicular cryopreservation, the main cryoprotectants used, as well as the progress made in different animal species thus far. In the last decade, significant progress has been made in obtaining viable and functional germ cells from testicular tissue. However, more research is needed to better establish protocols that can be used in clinical practice with various species.(AU)

A criopreservação do tecido testicular possibilita a manutenção da capacidade reprodutiva em diferentes espécies animais e contribui para a formação de bancos de germoplasma nas espécies ameaçadas de extinção. As espermatogônias presentes nos testículos podem ser cultivadas in vitro e os espermatozoides obtidos utilizados em programas de reprodução artificial. Assim, esta revisão teve como objetivo descrever as principais técnicas de criopreservação testicular, os principais crioprotetores utilizados e os avanços obtidos até o presente momento nas diferentes espécies animais. Na última década, os avanços obtidos com a utilização do tecido testicular para obtenção de células germinativas viáveis e funcionais foram significativos. Todavia, o estabelecimento de protocolos que possam ser utilizados na rotina clínica em diferentes espécies ainda necessitam de maiores esclarecimentos.(AU)

Toxicity, freezing and cold storage tests of native species semen / Testes de toxicidade, congelamento e refrigeração em sêmen de espécie nativa

In the first part of this study, toxicity tests were performed on the sperm of Macrobrachium acanthurus using four cryoprotectants for periods of 10 and 20 min at concentrations of 10 and 20%. In the second part, cryopreservation was performed by applying the least toxic cryoprotectant, and two freezing methods were tested over 24 hours: automated (protocols A and B) and conventional (protocols C and D). Protocol A exhibited a cooling rate of 0.5°C min-1 from -6°C to -32°C; protocol B was similar to A except for the starting temperature, which was room temperature; whereas protocols C and D exhibited a cooling rate of 2 and 10°C min-1, respectively. The third part of the study was conducted to assess the lifespan of the sperm when stored at 5°C, in which sperm viability was evaluated by a semen smear with eosin-nigrosin. The least toxic cryoprotectants were 10 and 20% glycerol, and 10% methanol, and the equilibrium time was 10 minutes. The optimal cooling rate was 2°C min-1 for 10% glycerol, which had a sperm survival rate of 21.8%. Cold storage for up to 3 days is recommended, presenting a sperm survival rate of 35.3%.(AU)

A primeira estapa deste trabalho testou a toxicidade de quatro crioprotetores em espermatozoides de Macrobrachium acanthurus durante 10 e 20 min nas concentrações de 10 e 20%. A segunda etapa foi realizar a criopreservação aplicando o crioprotetor com menor grau de toxicidade, testanto dois mecanismos de congelamento, um automatizado (protocolos A e B) e outro convencional (protocolos C e D), durante 24 horas. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5°C min-1 até alcançar -32°C, partindo de uma temperatura de -6°C e idem o protocolo B, com a diferença de partir de uma temperatura ambiente; os protocolos C e D apresentaram uma velocidade de resfriamento de 2 e 10°C min-1, respectivamente, sendo as palhetas transferidas ao nitrogênio líquido. A terceira etapa foi verificar o tempo de vida do espermatozoide quando refrigerado a 5°C. A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen com eosina-nigrosina. Os crioprotetores que se apresentaram menos tóxicos foram o glicerol 10 e 20% e metanol 10%, num tempo de equilíbrio de 10 minutos. A melhor velocidade de congelamento foi a de 2°C min-1 para glicerol 10%, com 21,8% de sobrevivência espermática, sendo a refrigeração até três dias recomendada, com uma sobrevivência de 35,3%.(AU)

Toxicity, freezing and cold storage tests of native species semen / Testes de toxicidade, congelamento e refrigeração em sêmen de espécie nativa

In the first part of this study, toxicity tests were performed on the sperm of Macrobrachium acanthurus using four cryoprotectants for periods of 10 and 20 min at concentrations of 10 and 20%. In the second part, cryopreservation was performed by applying the least toxic cryoprotectant, and two freezing methods were tested over 24 hours: automated (protocols A and B) and conventional (protocols C and D). Protocol A exhibited a cooling rate of 0.5°C min-1 from -6°C to -32°C; protocol B was similar to A except for the starting temperature, which was room temperature; whereas protocols C and D exhibited a cooling rate of 2 and 10°C min-1, respectively. The third part of the study was conducted to assess the lifespan of the sperm when stored at 5°C, in which sperm viability was evaluated by a semen smear with eosin-nigrosin. The least toxic cryoprotectants were 10 and 20% glycerol, and 10% methanol, and the equilibrium time was 10 minutes. The optimal cooling rate was 2°C min-1 for 10% glycerol, which had a sperm survival rate of 21.8%. Cold storage for up to 3 days is recommended, presenting a sperm survival rate of 35.3%.

A primeira estapa deste trabalho testou a toxicidade de quatro crioprotetores em espermatozoides de Macrobrachium acanthurus durante 10 e 20 min nas concentrações de 10 e 20%. A segunda etapa foi realizar a criopreservação aplicando o crioprotetor com menor grau de toxicidade, testanto dois mecanismos de congelamento, um automatizado (protocolos A e B) e outro convencional (protocolos C e D), durante 24 horas. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5°C min-1 até alcançar -32°C, partindo de uma temperatura de -6°C e idem o protocolo B, com a diferença de partir de uma temperatura ambiente; os protocolos C e D apresentaram uma velocidade de resfriamento de 2 e 10°C min-1, respectivamente, sendo as palhetas transferidas ao nitrogênio líquido. A terceira etapa foi verificar o tempo de vida do espermatozoide quando refrigerado a 5°C. A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen com eosina-nigrosina. Os crioprotetores que se apresentaram menos tóxicos foram o glicerol 10 e 20% e metanol 10%, num tempo de equilíbrio de 10 minutos. A melhor velocidade de congelamento foi a de 2°C min-1 para glicerol 10%, com 21,8% de sobrevivência espermática, sendo a refrigeração até três dias recomendada, com uma sobrevivência de 35,3%.

Avaliação histomorfológica do tecido testicular de gatos domésticos impúberes após vitrificação / Histomorphological evaluation of testicular tissue from prepubertal cats after vitrification

The aim of this study was to evaluate prepubertal cats testicular tissue histomorphology aftervitrification. Five testicular pairs from five prepubertal cats were used. The fragments were distributed in thecontrol group and vitrification group containing association of the cryoprotectants ethylene glycol and glycerolin a final concentration of 5.6M. Testicular fragments of the control group were fixed in Bouin solution,processed for histomorphological evaluation and stained with hematoxylin-eosin. Then, the fragments ofvitrification group were subjected to a solid surface vitrification and stored in liquid nitrogen. The fragmentswere thawed and processed for histology similarly to the control group. The control group was superior to thevitrification group regarding to the basal membrane separation cell, cell differentiation, visibility of the nucleusand nuclear condensation. Regarding the shrinkage of the basal membrane, there were no differences betweenthe groups. Morphological analysis of prepubertal cats testicular tissue after vitrification can contribute toimprove the reproductive biotechnologies applied to felines.(AU)