Resumo
A raça tropicalmente adaptada Curraleiro Pé Duro (CPD) possui grande rusticidade e capacidade de produção. A técnica de criopreservação de células somáticas permite estocar, por tempo indeterminado, o material genético. O objetivo deste trabalho é avaliar a viabilidade de fibroblastos, pós-criopreservação, em protocolos diferentes. Foi utilizada uma biópsia auricular de um bovino CPD, que passou por antissepsia e anestesia local. Posteriormente o material foi processado e incubado para ser observado quanto à confluência e à morfologia. Em seguida, os fibroblastos foram criopreservados em três tratamentos (T1, T2 e T3). Após serem criopreservados, foram descongelados e analisados quanto à viabilidade celular, à capacidade de crescimento e à morfologia. Na análise de variância e das médias, foram comparados pelo teste de Tukey com significância de 5%. Não foram observadas, nos protocolos, diferenças estatísticas entre a viabilidade celular (T1 = 67,98%, T2 = 71,42% e T3 = 69,93%), a capacidade de confluência (T1 = 80%, T2 = 90%, T3 = 85%) ou a passagem de origem das células. A criopreservação de fibroblastos auriculares de bovinos CPD não mostrou diferença entre os três métodos, sugerindo até que o método que demanda equipamentos menos especializados (T1) é tão eficiente quanto os demais.
Assuntos
Animais , Bovinos , Criopreservação , FibroblastosResumo
Avian coronavirus (AvCoV) infects a range of tissues in chickens and several other avian species. Although the virus can be isolated in chicken embryos, only a few strains of the 6 genotypes/33 lineages can grow in cell lines, with the Beaudette strain (GI-1 lineage) being the most used for in vitro studies. Considering the differences between cell lines and chicken embryos as habitats for AvCoV, this study aimed to assess the diversity of the genes coding for the nonstructural protein 3 (nsp3) and spike envelope protein (S) after serial passages in BHK-21 and Vero cells. After 14 passages of an embryo-adapted Beaudette strain, the virus loads fluctuated in both cell lines, with the highest loads being 8.72 log genome copies/µL for Vero and 6.36 log genome copies/µL for BHK-21 cells. No polymorphisms were found for nsp3; regarding S, not only aa substitutions (Vero: 8th passage A150S, and 14th S150A; BHK-21: 4th S53F, 8th F53Y, and 8th S95R), but also minor variants could be detected on chromatograms with fluctuating intensities. As the regions of these aa substitutions are within the receptor-binding domain of S, it can be speculated that differences in cell receptors between Vero and BHK-21 cells and the speed of cell death led to the selection of different dominant strains, whi
O Coronavírus aviário AvCoV infecta uma variedade de tecidos de galinhas e de outras espécies aviárias. Apesar de este vírus poder ser isolado em ovos embrionados de galinha, apenas alguns dos 6 genótipos / 33 linhagens podem crescer em cultivo celular, sendo a cepa Beuadette (linhagem GI-11) a mais utilizada para estudos in vitro. Considerando as diferentes linhagens celulares e ovos embrionados como habitats para o AvCoV, este estudo teve por objetivo estudar a diversidade de genes que codificam para a proteína não-estrutural 3 (nsp3) e espícula (S) após passagens seriadas em células BHK-21 e VERO. Após 14 passagens, de uma amostra Beuadette adaptada a ovos embrionados, os títulos virais variaram em ambas as células, com os maiores títulos sendo de 8,72 log cópias genômicas/µL para Vero e 6,36 cópias genômicas/µL para BHK-21. Nenhum polimorfismo foi encontrando para nsp3. Considerando a proteína S, não somente foram encontradas substituições de aminoácidos (Vero: 8a passagem A150S e 14a passagem S150A; BHK-21: 4a passagem S53F, 8a passagem F53Y e S95R), mas também, variantes subconsensuais foram detectadas pelos cromatogramas com intensidades flutuantes. Uma vez que as regiões destes aa se encontram no domínio de ligação de receptor de S, pode
Resumo
Avian coronavirus (AvCoV) infects a range of tissues in chickens and several other avian species. Although the virus can be isolated in chicken embryos, only a few strains of the 6 genotypes/33 lineages can grow in cell lines, with the Beaudette strain (GI-1 lineage) being the most used for in vitro studies. Considering the differences between cell lines and chicken embryos as habitats for AvCoV, this study aimed to assess the diversity of the genes coding for the nonstructural protein 3 (nsp3) and spike envelope protein (S) after serial passages in BHK-21 and Vero cells. After 14 passages of an embryo-adapted Beaudette strain, the virus loads fluctuated in both cell lines, with the highest loads being 8.72 log genome copies/µL for Vero and 6.36 log genome copies/µL for BHK-21 cells. No polymorphisms were found for nsp3; regarding S, not only aa substitutions (Vero: 8th passage A150S, and 14th S150A; BHK-21: 4th S53F, 8th F53Y, and 8th S95R), but also minor variants could be detected on chromatograms with fluctuating intensities. As the regions of these aa substitutions are within the receptor-binding domain of S, it can be speculated that differences in cell receptors between Vero and BHK-21 cells and the speed of cell death led to the selection of different dominant strains, while the stability of nsp3 supports its function as a protease involved in AvCoV replication. In conclusion, AvCoV quasispecies evolution is influenced by the biological model under consideration, and a gradual transition is seen for minor and major variants.(AU)
O Coronavírus aviário AvCoV infecta uma variedade de tecidos de galinhas e de outras espécies aviárias. Apesar de este vírus poder ser isolado em ovos embrionados de galinha, apenas alguns dos 6 genótipos / 33 linhagens podem crescer em cultivo celular, sendo a cepa Beuadette (linhagem GI-11) a mais utilizada para estudos in vitro. Considerando as diferentes linhagens celulares e ovos embrionados como habitats para o AvCoV, este estudo teve por objetivo estudar a diversidade de genes que codificam para a proteína não-estrutural 3 (nsp3) e espícula (S) após passagens seriadas em células BHK-21 e VERO. Após 14 passagens, de uma amostra Beuadette adaptada a ovos embrionados, os títulos virais variaram em ambas as células, com os maiores títulos sendo de 8,72 log cópias genômicas/µL para Vero e 6,36 cópias genômicas/µL para BHK-21. Nenhum polimorfismo foi encontrando para nsp3. Considerando a proteína S, não somente foram encontradas substituições de aminoácidos (Vero: 8a passagem A150S e 14a passagem S150A; BHK-21: 4a passagem S53F, 8a passagem F53Y e S95R), mas também, variantes subconsensuais foram detectadas pelos cromatogramas com intensidades flutuantes. Uma vez que as regiões destes aa se encontram no domínio de ligação de receptor de S, pode-se especular que diferenças em receptores celulares entre Vero e BHK-21, além da velocidade da morte celular, levaram à seleção de diferentes cepas dominantes, enquanto que a estabilidade de nsp3 concorda com sua função como protease com papel na replicação de AvCoV. Como conclusão, a evolução de quase-espécies de AvCoV é influenciada pelo modelo biológico sob consideração e uma transição gradual é vista para variantes dominantes e subdominantes.(AU)
Assuntos
Embrião de Galinha , Proteínas não Estruturais Virais , Infecções por Coronavirus/veterinária , Glicoproteína da Espícula de Coronavírus , GammacoronavirusResumo
Avian coronavirus (AvCoV) infects a range of tissues in chickens and several other avian species. Although the virus can be isolated in chicken embryos, only a few strains of the 6 genotypes/33 lineages can grow in cell lines, with the Beaudette strain (GI-1 lineage) being the most used for in vitro studies. Considering the differences between cell lines and chicken embryos as habitats for AvCoV, this study aimed to assess the diversity of the genes coding for the nonstructural protein 3 (nsp3) and spike envelope protein (S) after serial passages in BHK-21 and Vero cells. After 14 passages of an embryo-adapted Beaudette strain, the virus loads fluctuated in both cell lines, with the highest loads being 8.72 log genome copies/µL for Vero and 6.36 log genome copies/µL for BHK-21 cells. No polymorphisms were found for nsp3; regarding S, not only aa substitutions (Vero: 8th passage A150S, and 14th S150A; BHK-21: 4th S53F, 8th F53Y, and 8th S95R), but also minor variants could be detected on chromatograms with fluctuating intensities. As the regions of these aa substitutions are within the receptor-binding domain of S, it can be speculated that differences in cell receptors between Vero and BHK-21 cells and the speed of cell death led to the selection of different dominant strains, while the stability of nsp3 supports its function as a protease involved in AvCoV replication. In conclusion, AvCoV quasispecies evolution is influenced by the biological model under consideration, and a gradual transition is seen for minor and major variants.(AU)
O Coronavírus aviário AvCoV infecta uma variedade de tecidos de galinhas e de outras espécies aviárias. Apesar de este vírus poder ser isolado em ovos embrionados de galinha, apenas alguns dos 6 genótipos / 33 linhagens podem crescer em cultivo celular, sendo a cepa Beuadette (linhagem GI-11) a mais utilizada para estudos in vitro. Considerando as diferentes linhagens celulares e ovos embrionados como habitats para o AvCoV, este estudo teve por objetivo estudar a diversidade de genes que codificam para a proteína não-estrutural 3 (nsp3) e espícula (S) após passagens seriadas em células BHK-21 e VERO. Após 14 passagens, de uma amostra Beuadette adaptada a ovos embrionados, os títulos virais variaram em ambas as células, com os maiores títulos sendo de 8,72 log cópias genômicas/µL para Vero e 6,36 cópias genômicas/µL para BHK-21. Nenhum polimorfismo foi encontrando para nsp3. Considerando a proteína S, não somente foram encontradas substituições de aminoácidos (Vero: 8a passagem A150S e 14a passagem S150A; BHK-21: 4a passagem S53F, 8a passagem F53Y e S95R), mas também, variantes subconsensuais foram detectadas pelos cromatogramas com intensidades flutuantes. Uma vez que as regiões destes aa se encontram no domínio de ligação de receptor de S, pode-se especular que diferenças em receptores celulares entre Vero e BHK-21, além da velocidade da morte celular, levaram à seleção de diferentes cepas dominantes, enquanto que a estabilidade de nsp3 concorda com sua função como protease com papel na replicação de AvCoV. Como conclusão, a evolução de quase-espécies de AvCoV é influenciada pelo modelo biológico sob consideração e uma transição gradual é vista para variantes dominantes e subdominantes.(AU)
Assuntos
Embrião de Galinha , Proteínas não Estruturais Virais , Infecções por Coronavirus/veterinária , Glicoproteína da Espícula de Coronavírus , GammacoronavirusResumo
Avian coronavirus (AvCoV) infects a range of tissues in chickens and several other avian species. Although the virus can be isolated in chicken embryos, only a few strains of the 6 genotypes/33 lineages can grow in cell lines, with the Beaudette strain (GI-1 lineage) being the most used for in vitro studies. Considering the differences between cell lines and chicken embryos as habitats for AvCoV, this study aimed to assess the diversity of the genes coding for the nonstructural protein 3 (nsp3) and spike envelope protein (S) after serial passages in BHK-21 and Vero cells. After 14 passages of an embryo-adapted Beaudette strain, the virus loads fluctuated in both cell lines, with the highest loads being 8.72 log genome copies/µL for Vero and 6.36 log genome copies/µL for BHK-21 cells. No polymorphisms were found for nsp3; regarding S, not only aa substitutions (Vero: 8th passage A150S, and 14th S150A; BHK-21: 4th S53F, 8th F53Y, and 8th S95R), but also minor variants could be detected on chromatograms with fluctuating intensities. As the regions of these aa substitutions are within the receptor-binding domain of S, it can be speculated that differences in cell receptors between Vero and BHK-21 cells and the speed of cell death led to the selection of different dominant strains, whi
O Coronavírus aviário AvCoV infecta uma variedade de tecidos de galinhas e de outras espécies aviárias. Apesar de este vírus poder ser isolado em ovos embrionados de galinha, apenas alguns dos 6 genótipos / 33 linhagens podem crescer em cultivo celular, sendo a cepa Beuadette (linhagem GI-11) a mais utilizada para estudos in vitro. Considerando as diferentes linhagens celulares e ovos embrionados como habitats para o AvCoV, este estudo teve por objetivo estudar a diversidade de genes que codificam para a proteína não-estrutural 3 (nsp3) e espícula (S) após passagens seriadas em células BHK-21 e VERO. Após 14 passagens, de uma amostra Beuadette adaptada a ovos embrionados, os títulos virais variaram em ambas as células, com os maiores títulos sendo de 8,72 log cópias genômicas/µL para Vero e 6,36 cópias genômicas/µL para BHK-21. Nenhum polimorfismo foi encontrando para nsp3. Considerando a proteína S, não somente foram encontradas substituições de aminoácidos (Vero: 8a passagem A150S e 14a passagem S150A; BHK-21: 4a passagem S53F, 8a passagem F53Y e S95R), mas também, variantes subconsensuais foram detectadas pelos cromatogramas com intensidades flutuantes. Uma vez que as regiões destes aa se encontram no domínio de ligação de receptor de S, pode
Resumo
The agouti has been used as an experimental model in several studies focused on reproductive biology. The umbilical cord, an embryonic attachment that connects the foetus to the placenta, has been reported as an important anatomical site for obtaining stem cells. The objective of this study was to describe macro- and microscopically the umbilical cord of agoutis at different stages of gestation, to expand and cultivate in vitro the progenitor cells and to report their morphological characteristics. Seven cutias were submitted to caesarean section to collect the umbilical cords: five were destined for studies of cord structure in different stages of gestation (30, 35, 50, 75 and 100 days postcoital), and two were collected in the third stage of gestation for isolation and cell culture. The umbilical cord of cutias assumes a spiral arrangement, with veins and arteries on it starting 50 days after coitus. The arteries present an outer layer of smooth muscle fibres in a longitudinal and circular arrangement and a medium layer of smooth muscle fibres with only longitudinal and intimate orientation and coated by the endothelium. The veins consist of longitudinal smooth muscle fibres with an extract of smooth muscle cells, and the endothelium, in all analysed gestational phases, is a structure bounded by simple pavement epithelial tissue originating from the amnion, adhered to Whartons Jelly and forming the umbilical vessels and allantoid duct. The proposed protocol allowed the collection of a high cellular concentration of umbilical cord progenitor cells from viable cutias.(AU)
A cutia vem sendo utilizada como modelo experimental em diversos estudos voltados à biologia reprodutiva. O cordão umbilical, anexo embrionário que une o feto à placenta, tem sido relatado como um importante sítio anatômico para obtenção de células-tronco. O objetivo deste estudo foi descrever macro e microscopicamente o cordão umbilical de cutias, em fases diferentes da gestação, expandir e cultivar in vitro as células progenitoras e relatar suas características morfológicas. Foram utilizadas sete cutias submetidas à cesariana para a coleta dos cordões umbilicais, cinco foram destinadas aos estudos da estrutura do cordão, em diferentes estágios de gestação (30, 35, 50, 75 e 100 dias pós-coito), e duas, no terço final da gestação, para isolamento e cultivo celular. O cordão umbilical de cutia assume disposição espiralada, com veias e artérias sobre ele a partir dos 50 dias após o coito. As artérias apresentam camada externa de fibras musculares lisas, disposição longitudinal e circular, camada média de fibras musculares lisas, apenas com disposição longitudinal e íntima revestida pelo endotélio. As veias constituídas por fibras musculares lisas longitudinais com um extrato de células musculares lisas e pelo endotélio. Em todas as fases gestacionais analisadas é uma estrutura delimitada por tecido epitelial simples pavimentoso, proveniente do âmnio, aderido a Geleia de Wharton e com formação de vasos umbilicais e ducto alantóide. O protocolo proposto permitiu a coleta de células progenitoras do cordão umbilical de cutias, viáveis com elevada concentração celular.(AU)
Assuntos
Animais , Feminino , Gravidez , Dasyproctidae , Cordão Umbilical/anatomia & histologia , Cordão Umbilical/ultraestrutura , Idade Gestacional , Células Cultivadas , Plasticidade Celular , Separação Celular/veterinária , Cesárea/veterináriaResumo
Objetivou-se estabelecer um protocolo para extração, cultivo e expansão de células tronco mesenquimais (CTM), utilizando-se 3,0 mL da medula óssea e 3,0 cm3 de tecido adiposo do subcutâneo de três cães machos com seis meses de idade. As amostras foram processadas e as células extraídas e cultivadas em DMEM. Para comprovação do isolamento de CTM, procedeu-se a caracterização fenotípica e a diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. As células isoladas apresentaram morfologia alongada e fusiforme e capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A caracterização fenotípica revelou alta expressão de marcadores de CTM CD90 (80,04%) e CD29 (96%) nas células de origem medular e CD90 (60,94%) e CD29 (77,08%) nas de origem adiposa. A expressão de marcadores hematopoiéticos foi baixa tanto nas células de origem medular CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%), quanto nas de origem adiposa CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%). As modificações e adaptações realizadas nos protocolos clássicos simplificaram o processo e foram eficientes, permitindo o isolamento e cultivo de CTM da medula óssea e do tecido adiposo de cães. (AU)
The objective of this study was to establish a protocol for the isolation and culture of mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow and adipose tissue of dogs. Three 6-month-old male dogs were used. Approximately 3.0 cm3 of adipose tissue and 3.0 mL of bone marrow were collected. The samples were processed and the isolated cells were cultured in DMEM. The cells were subjected to phenotypic characterization and to osteogenic, adipogenic, and condrogenic differentiation to confirm the isolation of the MSC. The cells showed elongated and fusiform morphology and they were able to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Phenotypic characterization revealed high expression of the MSC markers CD90(80.04%) and CD29(96%) in the cells from bone marrow and high expression of CD90(60.94%) and CD29(77.08%) in the cells from adipose tissue. In addition, phenotypic characterization revealed low expression of hematopoietic markers CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from bone marrow and low expression of CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from adipose tissue. Based on these results, the modifications applied to classical protocols simplified the process and proved to be efficient in the isolation, culture, and expansion of MSC isolated from the bone marrow and adipose tissue of dogs.(AU)
Assuntos
Animais , Cães , Células-Tronco , Gordura Subcutânea , Medula Óssea , Técnicas de Cultura de Células/veterinária , Diferenciação CelularResumo
Objetivou-se estabelecer um protocolo para extração, cultivo e expansão de células tronco mesenquimais (CTM), utilizando-se 3,0 mL da medula óssea e 3,0 cm3 de tecido adiposo do subcutâneo de três cães machos com seis meses de idade. As amostras foram processadas e as células extraídas e cultivadas em DMEM. Para comprovação do isolamento de CTM, procedeu-se a caracterização fenotípica e a diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. As células isoladas apresentaram morfologia alongada e fusiforme e capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A caracterização fenotípica revelou alta expressão de marcadores de CTM CD90 (80,04%) e CD29 (96%) nas células de origem medular e CD90 (60,94%) e CD29 (77,08%) nas de origem adiposa. A expressão de marcadores hematopoiéticos foi baixa tanto nas células de origem medular CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%), quanto nas de origem adiposa CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%). As modificações e adaptações realizadas nos protocolos clássicos simplificaram o processo e foram eficientes, permitindo o isolamento e cultivo de CTM da medula óssea e do tecido adiposo de cães.
The objective of this study was to establish a protocol for the isolation and culture of mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow and adipose tissue of dogs. Three 6-month-old male dogs were used. Approximately 3.0 cm3 of adipose tissue and 3.0 mL of bone marrow were collected. The samples were processed and the isolated cells were cultured in DMEM. The cells were subjected to phenotypic characterization and to osteogenic, adipogenic, and condrogenic differentiation to confirm the isolation of the MSC. The cells showed elongated and fusiform morphology and they were able to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Phenotypic characterization revealed high expression of the MSC markers CD90(80.04%) and CD29(96%) in the cells from bone marrow and high expression of CD90(60.94%) and CD29(77.08%) in the cells from adipose tissue. In addition, phenotypic characterization revealed low expression of hematopoietic markers CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from bone marrow and low expression of CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from adipose tissue. Based on these results, the modifications applied to classical protocols simplified the process and proved to be efficient in the isolation, culture, and expansion of MSC isolated from the bone marrow and adipose tissue of dogs.
Assuntos
Animais , Cães , Células-Tronco , Gordura Subcutânea , Medula Óssea , Diferenciação Celular , Técnicas de Cultura de Células/veterináriaResumo
Abstract The objective of this study was to establish a protocol for the isolation and culture of mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow and adipose tissue of dogs. Three 6-month-old male dogs were used. Approximately 3.0 cm3 of adipose tissue and 3.0 mL of bone marrow were collected. The samples were processed and the isolated cells were cultured in DMEM. The cells were subjected to phenotypic characterization and to osteogenic, adipogenic, and condrogenic differentiation to confirm the isolation of the MSC. The cells showed elongated and fusiform morphology and they were able to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Phenotypic characterization revealed high expression of the MSC markers CD90(80.04%) and CD29(96%) in the cells from bone marrow and high expression of CD90(60.94%) and CD29(77.08%) in the cells from adipose tissue. In addition, phenotypic characterization revealed low expression of hematopoietic markers CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from bone marrow and low expression of CD45(1.45%) and CD34(1.53%) in the cells from adipose tissue. Based on these results, the modifications applied to classical protocols simplified the process and proved to be efficient in the isolation, culture, and expansion of MSC isolated from the bone marrow and adipose tissue of dogs.
Resumo Objetivou-se estabelecer um protocolo para extração, cultivo e expansão de células tronco mesenquimais (CTM), utilizando-se 3,0 mL da medula óssea e 3,0 cm3 de tecido adiposo do subcutâneo de três cães machos com seis meses de idade. As amostras foram processadas e as células extraídas e cultivadas em DMEM. Para comprovação do isolamento de CTM, procedeu-se a caracterização fenotípica e a diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. As células isoladas apresentaram morfologia alongada e fusiforme e capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A caracterização fenotípica revelou alta expressão de marcadores de CTM CD90 (80,04%) e CD29 (96%) nas células de origem medular e CD90 (60,94%) e CD29 (77,08%) nas de origem adiposa. A expressão de marcadores hematopoiéticos foi baixa tanto nas células de origem medular CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%), quanto nas de origem adiposa CD45 (1,45%) e CD34 (1,53%). As modificações e adaptações realizadas nos protocolos clássicos simplificaram o processo e foram eficientes, permitindo o isolamento e cultivo de CTM da medula óssea e do tecido adiposo de cães.
Resumo
Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.
Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.
Assuntos
Animais , Circovirus , Infecções por Circoviridae , Suínos , VírusResumo
Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.(AU)
Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.(AU)
Assuntos
Animais , Suínos , Circovirus , Infecções por Circoviridae , VírusResumo
Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.(AU)
Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.(AU)
Assuntos
Animais , Circovirus , Infecções por Circoviridae , Suínos , VírusResumo
Os bovinos da raça Curraleiro Pé Duro possuem grande rusticidade e capacidade de adaptação, o que despertou interesse em cruzamentos genéticos, até a diminuição drástica do número de animais. A técnica de Criopreservação de Células Somáticas, permite estocar por tempo indeterminado o material genético. Logo, o objetivo desse trabalho é observar o efeito de 3 curvas de criopreservação sobre as células somáticas de bovinos Curraleiro Pé Duro. O experimento foi realizado em Teresina-PI, na Universidade Federal do Piauí, no LBRA/CCA, utilizou-se um animal, hígido e com acesso a água e sal à vontade. O mesmo após os exames iniciais passou pelas etapas de assepsia, tricotomia, anestesia e colheita da biópsia, que foi transportada dentro de uma caixa com temperatura controlada. No laboratório, a biópsia foi processada incubadas em atmosfera controlada. Como grupo controle, foram utilizadas células de tecido auricular de bovinos Nelore. As células foram observadas quando a confluência e a morfologia até a quarta passagem e então, criopreservadas em 3 tratamentos (1NEL, 2NEL, 3NEL, 1CPD, 2CPD e 3CPD). Após 10 dias foram descongeladas e analisadas quanto a sua viabilidade celular, pela técnica de Azul de Tripan e em 7 dias, analisadas quando a confluência e morfologia novamente. Os dados passaram por análise de Variância e pelo teste de Tukey. Não foram observadas diferenças estatísticas entre a viabilidade celular e a capacidade de confluência das amostras. Conclui-se que a criopreservação de células auriculares de bovinos Curraleiro Pé Duro, se mostra uma ferramenta positiva para a conservação do material genético de raças nativas em risco de extinção, na forma de bancos de germoplasma, com grande potencial para utilização em biotécnicas de reprodução assistida.
Os bovinos da raça Curraleiro Pé Duro possuem grande rusticidade e capacidade de adaptação, o que despertou interesse em cruzamentos genéticos, até a diminuição drástica do número de animais. A técnica de Criopreservação de Células Somáticas, permite estocar por tempo indeterminado o material genético. Logo, o objetivo desse trabalho é observar o efeito de 3 curvas de criopreservação sobre as células somáticas de bovinos Curraleiro Pé Duro. O experimento foi realizado em Teresina-PI, na Universidade Federal do Piauí, no LBRA/CCA, utilizou-se um animal, hígido e com acesso a água e sal à vontade. O mesmo após os exames iniciais passou pelas etapas de assepsia, tricotomia, anestesia e colheita da biópsia, que foi transportada dentro de uma caixa com temperatura controlada. No laboratório, a biópsia foi processada incubadas em atmosfera controlada. Como grupo controle, foram utilizadas células de tecido auricular de bovinos Nelore. As células foram observadas quando a confluência e a morfologia até a quarta passagem e então, criopreservadas em 3 tratamentos (1NEL, 2NEL, 3NEL, 1CPD, 2CPD e 3CPD). Após 10 dias foram descongeladas e analisadas quanto a sua viabilidade celular, pela técnica de Azul de Tripan e em 7 dias, analisadas quando a confluência e morfologia novamente. Os dados passaram por análise de Variância e pelo teste de Tukey. Não foram observadas diferenças estatísticas entre a viabilidade celular e a capacidade de confluência das amostras. Conclui-se que a criopreservação de células auriculares de bovinos Curraleiro Pé Duro, se mostra uma ferramenta positiva para a conservação do material genético de raças nativas em risco de extinção, na forma de bancos de germoplasma, com grande potencial para utilização em biotécnicas de reprodução assistida.
Resumo
A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença hereditária de caráter progressivo causada por mutação no gene produtor da proteína distrofina, responsável por ligar o citoesqueleto da célula muscular a matriz extracelular (MEC). Além de humanos, outros animais podem apresentar distrofias musculares, podendo ser utilizados como modelos para o estudo de distrofias musculares em humanos. O modelo animal mais utilizado é o modelo de Distrofia Muscular do Golden Retriever (GRMD). Os estudos de distrofias musculares podem ser associados a diversas áreas, como a Bioengenharia de tecidos, área que visa a utilização de MEC descelularizadas (scaffolds) para reparação/substituição de órgãos e tecidos, porém estes scaffolds também podem servir como ferramenta para estudo de MEC em doenças. Portando, o objetivo deste trabalho foi a caracterização de alguns componentes da MEC distrófica, sugerir se uma MEC distrófica pode ser um possível biomaterial para medicina regenerativa e a recelularização de MEC distróficas para observação da relação célula- matriz. Para realização deste trabalho, músculos bíceps femorais distróficos e não distróficos foram descelularizados com protocolo de utilização de SDS a 1% e passaram por análises de quantificação de DNA e fluorescência por DAPI para validação da descelularização e análises histológicas (colorações), imunohistoquímica e de Microscopia Eletrônica de Varredura para avaliação da composição, ultraestrutura e preservação das MEC distróficas e não distróficas. Como resultados, obtivemos as quantificações de DNA que alcançaram quantidade inferior a 50ng de DNA por mg de tecido e na fluorescência por DAPI não foram visualizados núcleos celulares nos tecidos descelularizados. Pelas análises histológicas foi possível observar a ausência de células nos tecidos descelularizados e a preservação de fibras colágenas da MEC. Pela imunohistoquímica, não foram observadas grandes diferenças nos componentes da MEC de músculos distróficos quando comparados com músculos não distróficos. Quando observadas, as células utilizadas para recelularização dos scaffolds apresentaram maior taxa de proliferação quando em contato com o scaffold muscular e o protocolo de esterilização do scaffold foi eficiente, já que os testes para detecção de micoplasma foram negativos. Foi observado o aumento da quantidade de DNAg após a recelularização dos scaffolds e pela MEV são visíveis camadas de células sobre a matriz extracelular. Concluímos que a MEC de músculo distrófico não interfere na diferenciação e adesão celular quando comparadas às MEC de músculo não distrófico. Embora o aumento de distrofina tenha sido observado em alguns processos de recelularização, mais estudos precisam ser realizados para comprovação deste dado.
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a progressive hereditary disease caused by a mutation in the gene producing the dystrophin protein, responsible for linking the cytoskeleton of the muscle cell to the extracellular matrix (ECM). In addition to humans, other animals may have muscular dystrophies and can be used as models for the study of muscular dystrophies in humans. The most used animal model is the Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) model. Muscular dystrophy studies can be associated with several areas, such as tissue bioengineering, an area that aims to use decellularized ECM (scaffolds) for repairing / replacing organs and tissues, but these scaffolds can also serve as a tool for studying the ECM in diseases. Therefore, the objective of this work was to characterize some components of the dystrophic ECM, to suggest whether a dystrophic ECM may be a possible biomaterial for regenerative medicine and the recellularization of dystrophic ECM to observe the cell-matrix relationship. To perform this work, dystrophic and non-dystrophic femoral biceps muscles were decellularized using a 1% SDS protocol and underwent DNA quantification and fluorescence analyzes by DAPI to validate decellularization and histological (staining), immunohistochemistry and Scanning Electron microscopy analyzes to evaluate the composition, ultrastructure and preservation of dystrophic and non-dystrophic ECM. As a result, we obtained the DNA quantifications that reached a quantity of less than 50ng of DNA per mg of tissue and in the fluorescence by DAPI, cell nuclei were not seen in the decellularized tissues. Through histological analyzes it was possible to observe the absence of cells in the decellularized tissues and the preservation of collagen fibers of the ECM. Due to immunohistochemistry, no major differences were observed in the ECM components of dystrophic muscles when compared with non-dystrophic muscles. When observed, the cells used to recellularize the scaffolds showed a higher proliferation rate when in contact with the muscle scaffold and the scaffold sterilization protocol was efficient, since the tests for mycoplasma detection were negative. An increase in the amount of DNAg was observed after the scaffolds were recellularized and by SEM, layers of cells are visible on the extracellular matrix. We conclude that the ECM of dystrophic muscle does not interfere with cell differentiation and adhesion when compared to the ECM of non-dystrophic muscle. Although the increase in dystrophin has been observed in some recellularization processes, more studies need to be carried out to prove this data.
Resumo
A neurogênese em mamíferos adultos ocorre principalmente nas zonas subventricular e subgranular do encéfalo, mas também há relatos de sua ocorrência na medula espinhal. Ao cultivar o tecido proveniente de regiões neurogênicas, é possível obter células tronco neurais e neuroprogenitoras que são caracterizadas pelo seu potencial de gerar neurônios e neuroglia. Em um estudo realizado com ratos foi possível obter essas células através do cultivo primário de medula espinhal, mas não há estudos em cães, o que justifica o presente trabalho ao representar uma fonte fidedigna para estudos sobre neurogênese e terapias neuroregenerativas da medula espinhal nesta espécie. Em virtude disso, este estudo tem o objetivo de isolar, cultivar e caracterizar células tronco neurais/neuroprogenitoras provenientes da medula espinhal de fetos caninos em terço final de gestação. As células foram isoladas a partir de fragmentos da medula espinhal e foram cultivadas em meio de cultivo livre de soro e suplementado com os fatores de crescimento EGF, FGF-2 e associação de ambos. Essas células foram observadas diariamente por microscopia óptica para a análise das suas características morfológicas. A partir do terceiro dia de cultivo foi possível observar agrupamentos celulares translúcidos semelhantes às neuroesferas com aproximadamente 50 m chegando até 200 m com sete dias de cultivo. Ao comparar as neuroesferas tratadas com diferentes fatores de crescimento, foi possível constatar que o formato foi semelhante, porém o diâmetro e número de neuroesferas observadas no grupo FGF-2 foi menor. Todos os grupos expressaram os genes característicos das neuroesferas, como o SOX-2, importante marcador de células-tronco pluripotentes, a Nestina como marcador de células neurais progenitoras e o GFAP expresso principalmente por células gliais imaturas e astrócitos. No entanto, o grupo FGF-2 teve maior expressão do gene GFAP, enquanto o EGF teve maior expressão da Nestina sendo possível presumir que em neuroesferas provenientes da medula espinhal de cães o FGF-2 estimula a gliogênese. Além da expressão gênica, as células também foram marcadas fenotipicamente pelo método de imunofluorescência para as proteínas Nestina, GFAP e beta-Tubulina III caracterizando-as como neuroesferas e, por fim, concluindo que é possível isolar e cultivar células-tronco neurais e neuroprogenitoras a partir da medula espinhal de fetos caninos.
Neurogenesis in adult mammals occurs mainly in the subventricular and subgranular areas of the brain, but there are also reports of its occurrence in the spinal cord. By culturing tissue from neurogenic regions, it is possible to obtain neural stem cells (NSC) and neural progenitor cells (NPC) that are characterized by their potential to generate neurons and neuroglia. In a study with rats, it was possible to obtain these cells by primary culture of spinal cord, but there are no studies in dogs, which justifies the present work by representing a reliable source for studies on neurogenesis and neuroregenerative spinal cord therapies in this species. Because of this, this study aims to isolate, cultivate and characterize NSCs and NPCs from the spinal cord of canine fetuses in the final third of gestation. Cells were isolated from spinal cord fragments and were cultured in a serum-free culture medium supplemented with EGF, FGF-2 growth factors and a combination of both. These cells were observed daily by optical microscopy for analysis of their morphological characteristics. After 3 days in culture, it was possible to observe translucent cell clusters similar to neurospheres with approximately 50 m, and after 7 days, they grew to a size of approximately 200 m. By comparing the neurospheres treated with the different growth factors, we found that their shape was similar but the diameter and number of clusters in the group treated with FGF-2 were smaller. All growth factor groups expressed the characteristic genes of neurospheres, like SOX-2, an important marker for pluripotent stem cells, Nestin, a marker for NPCs, and GFAP, which is mainly expressed by immature glial cells and astrocytes. However, the FGF-2 group showed a higher expression of GFAP, whereas the EGF group had a higher Nestin expression, being possible to presume that in neurospheres originated from canine spinal cord FGF-2 stimulates gliogenesis. Besides gene expression, the cells were also marked phenotypically by immunofluorescence for Nestin, GFAP, and Beta-tubulin III proteins, characterizing them as neurospheres and finally concluding that it is possible to isolate and cultivate neural stem cells and neural progenitor cells from the spinal cord of canine fetuses.
Resumo
O osteossarcoma (OSA) é um tumor muito agressivo nos cães, com baixo índice de sobrevida e tratamento pouco efetivo. Na busca de fontes alternativas de terapia, o bioma brasileiro torna-se uma esperança científica, por apresentar uma diversidade de plantas medicinais de conhecimento e utilização popular. No entanto, elas podem apresentar funções biológicas controversas. O objetivo deste estudo foi verificar a bioatividade das folhas de Campomanesia adamantium e de Hymenaea martiana Hayne sobre células de Osteossarcoma Canino (OC) de cultura estabelecida e células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). As células foram cultivadas e submetidas ao tratamento com as concentrações de C. adamantium (1 g/mL, 10 g/mL, 100 g/mL, 1000 g/mL) e H. martiana Hayne (10L/mL, 100L/mL, 1000L/mL, 2000L/mL e 5000L/mL), nos tempos de exposição de 24h, 48h e 72h em normoxia e 24h para células expostas ao estresse oxidativo, induzido por peróxido de hidrogênio. Os resultados foram obtidos por meio da análise da viabilidade celular e citotoxicidade pelo método de redução do tetrazólio (MTT). Este estudo traz resultados inéditos em relação aos efeitos dos extratos, pois foi possível demonstrar que possuem pouca ação citotóxica. Além disso, foi observado que, quanto maior a dosagem e maior o tempo de exposição, maior a atividade proliferativa, com aumento da viabilidade celular no grupo de 72 horas. Nas células endoteliais, de forma similar, não houve atividade citotóxica, além da ocorrência do aumento da viabilidade celular, inclusive após a submissão ao estresse oxidativo. O extrato de folhas de C. adamantium aumentou a viabilidade e não apresentou ação citotóxica nas células de osteossarcoma canino e nas células endoteliais sob estresse oxidativo. O extrato etanólico bruto das folhas de Hymenaea martiana Hayne, aumentou a viabilidade celular das células de osteossarcoma canino e das células endoteliais de veia umbilical humana, submetidas ao estresse oxidativo.
Osteosarcoma (OSA) is a very aggressive tumor in dogs, with low survival rate and ineffective treatment. In the search for alternative sources of therapy, the Brazilian biome becomes a scientific hope, presenting a diversity of medicinal plants of popular knowledge and use. However, they can have controversial biological functions. The aim of this study was to verify the bioactivity of the leaves of Campomania adamantium and Hymenaea martiana Hayne on canine osteosarcoma (OC) cells from cell cultures and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). As cells were cultured and subjected to treatment with C. adamantium (1 g / mL, 10 g / mL, 100 g / mL, 1000 g / mL) and H. martiana Hayne (10L / mL, 100L / mL, 1000L / mL , 2000L / mL and 5000L / mL), in the 24h, 48h and 72h exposure periods in normoxia and 24h in cells exposed to oxidative stress, induced by hydrogen peroxide. The results were analyzed by analyzing cell viability and cytotoxicity using the tetrazolium reduction method (MTT). This study brings unprecedented results in relation to extractive effects, as it was possible to demonstrate that they have little cytotoxic action. In addition, it was observed that the higher the dosage and the longer the exposure time, the greater the proliferative activity, with increased cell viability in the 72-hour group. In endothelial cells, similarly, there was no cytotoxic activity, in addition to the occurrence of increased cell viability, even after submission to oxidative stress. C. adamantium leaf extract increased viability and did not show cytotoxic action in canine osteosarcoma cells and endothelial cells under oxidative stress. The crude ethanolic extract of the leaves of Hymenaea martiana Hayne, increased the cell viability of canine osteosarcoma cells and human umbilical vein endothelial cells, submitted to oxidative stress.
Resumo
O diabetes mellitus tipo I é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células pancreáticas causando a redução da produção de insulina. É uma disfunção comum que afeta cães de todo o mundo, sendo um grande desafio para Veterinários e tutores em manter o controle adequado da hiperglicemia e, assim, reduzir os sintomas. Foi descrito em ratos e humanos que os organóides pancreáticos podem expressar genes progenitores como LGR5, ALD1A1, NGN3 e SOX9, mesmo em meio de expansão. Além disso, os organóides ductais pancreáticos, em meio de diferenciação adequado, podem gerar células . Estabelecemos os primeiros organóides pancreáticos caninos adultos através do isolamento de células pancreáticas ductais de tecido fresco e congelado originado de cães saudáveis. Para isolar as células pancreáticas ductais foram utilizadas colagenase I + dispase e tripsina. Protocolos de congelamento e descongelamento em diferentes passagens sem perda de capacidade de proliferação e alterações morfológicas foram observados. Na análise de genes alvo usando qPCR mostrando as células do ducto pancreático proliferaram com a expressão de genes progenitores multipotentes.
Type I diabetes mellitus is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic cells causing the reduction of insulin production. It is a common disfunction that affects dogs from all over the world, being a great challenge for Veterinarians and tutors in maintaining adequate control of hyperglycemia and, thus, reducing symptoms. It was described in mice and humans that pancreatic organoids can express progenitors genes as LGR5, ALD1A1, NGN3 and SOX9, even in expansion medium. Besides, pancreatic ductal organoids, in suitable differentiation medium, can generate cells. We established the first adult canine pancreatic organoids through ductal pancreatic cells isolation from fresh and frozen tissue originating from healthy dogs. To isolate the ductal pancreatic cells collagenase I + dispase and trypsin were used. It was observed that freezing and thawing protocols in different passages without loose proliferation capacity and morphology changes. In the analysis of target genes using qPCR showing the pancreatic duct cells proliferated with the expression of multipotent progenitor genes.
Resumo
The study aimed to isolate, expand, differentiate and characterize progenitor cells existent in the dental pulp of agouti. The material was washed with PBS solution and dissociated mechanically with the aid of a scalpel blade on plates containing culture medium D-MEM/F-12, and incubated at 5% CO2-37⁰C. The growth curve, CFU assay, osteogenic/adipogenic differentiation and characterization were obtained from the isolation. The cells began to be released from the explant tissue around the 7th day of culture. By day 22 of culture, cells reached 80% confluence. At the UFC test, 81 colonies were counted with 12 days of cultivation. The growth curves before and after freezing showed a regular growth with intense proliferation and clonogenic potential. The cell differentiation showed formation of osteoblasts and fat in culture, starting at 15 days of culture in a specific medium. Flow cytometry (FACs) was as follows: CD34 (positive), CD14 (negative), CD45 (negative), CD73 (positive), CD79 (negative), CD90 (positive), CD105 (positive), demonstrating high specificity and commitment of isolated cells with mesenchymal stem cells strains. These results suggest the existence of a cell population of stem cells with mesenchymal features from the isolated tissue in the explants of agouti dental pulp, a potential model for study of stem cell strains obtained from the pulp tissue.(AU)
Isolation, expansion and differentiation of cellular progenitors obtained from dental pulp of agouti (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831). Este estudo teve como objetivo isolar, expandir, diferenciar e caracterizar células progenitoras existentes na polpa dentária de cutia. O material foi lavado em solução de PBS e dissociado mecanicamente, com o auxílio de uma lâmina de bisturi, em placas contendo meio de cultura D-MEM/F-12, e incubadas em 5% de CO2-37⁰C. A curva de crescimento, o ensaio de CFU, a diferenciação osteogênica/adipogênica e a caracterização foram obtidas a partir do isolamento. As células começaram a ser liberadas, a partir do explante, em torno do sétimo dia de cultura. A partir do 22o dia, as células atingiram 80% de confluência. No teste para UFC, 81 colônias foram contadas aos 12 dias de cultivo. As curvas de crescimento pré- e pós-congelamento apresentaram crescimento regular, com intensa proliferação e potencial clonogênico. A diferenciação das células mostrou a formação de osteoblastos e de células de gordura, a partir de 15 dias de cultura em meio específico. A citometria de fluxo (FACS) apresentou-se como segue: CD34 (positivo), CD14 (negativo), CD45 (negativo), CD73 (positivo), CD79 (negativo), CD90 (positivo), CD105 (positivo), demonstrando a grande especificidade e comprometimento das células isoladas com linhagens de células-tronco mesenquimais. Estes resultados sugerem a existência de uma população de células-tronco mesenquimais isolada a partir de explantes da polpa dentária cutia, um modelo potencial para o estudo de linhagens de células-tronco obtidas a partir do tecido pulpar.(AU)
Assuntos
Animais , Masculino , Células-Tronco , Polpa Dentária , Técnicas de Cultura de Células/veterinária , Dasyproctidae/anatomia & histologia , Radiografia Dentária/veterinária , Crescimento Celular , Citometria de Fluxo/veterinária , AdipogeniaResumo
Os organóides intestinais possuem grande relevância na terapia celular, pois fornecem informações mais precisas sobre a composição e arquitetura de tecidos em relação ao cultivo bidimensional, além de servir como modelo de estudo para interação de hospedeiros e testes de fármacos. O saco vitelino, membrana de nutrição fetal, é um dos responsáveis pela formação do epitélio intestinal durante o desenvolvimento embrionário. Com isso, este trabalho teve como objetivo verificar se o cultivo tridimensional in vitro de células-tronco derivadas do saco vitelino canino possui capacidade de desenvolver organóides intestinais. Células-tronco mesenquimais do saco vitelino canino foram isoladas e caracterizadas, sendo posteriormente cultivadas tridimensionalmente em Matrigel® sob diferentes condições de indução da diferenciação, sendo o próprio tecido do saco vitelino digerido também testado para este cultivo tridimensional, utilizando como grupo controle células-tronco intestinais caninas. As estruturas derivadas dos diferentes tipos de cultivo foram testadas com RT-qPCR para diferentes marcadores endodermais e intestinais, sendo a quantificação das amostras avaliada utilizando o método 2-CT. As estruturas tridimensionais derivadas do tecido do saco vitelino foram capazes de desenvolver morfologia semelhante ao grupo controle, possuindo marcação para células epiteliais intestinais e células do cólon intestinal. Enquanto que as estruturas derivadas do grupo das mesenquimais, apesar de apresentar expressão de células intestinais, não desenvolveu uma morfologia adequada. Concluindo assim que o saco vitelino canino possui capacidade para desenvolver organóides intestinais, enquanto que as células-tronco mesenquimais isoladas, apesar de serem capazes de sofrer diferenciação intestinal, não formam uma morfologia semelhante a organóides no cultivo tridimensional.
The intestinal organoids have great relevance in cell therapy, since they provide more precise information on the composition and architecture of tissues in relation to the two-dimensional culture, besides serving as a study model for host interaction and drug tests. The yolk sac, fetal nutrition membrane, is one of the responsible for the formation of the intestinal epithelium during the embryonic development. The objective of this study was to verify if the in vitro three-dimensional culture of stem cells derived from the canine yolk sac has the capacity to develop intestinal organoids. The mesenchymal stem cells of the canine yolk sac were isolated and characterized, and were subsequently cultured three-dimensionally in Matrigel® under different conditions of induction of differentiation, and the same yolk sac tissue was also tested for this three-dimensional culture using canine intestinal stem cell as control. The structures derived from the different culture types were tested with RT-qPCR for different endodermal and intestinal markers, and the quantification of the samples was evaluated using the 2-CT method. The three-dimensional structures derived from yolk sac tissue were able to develop similar morphology to the control group, expressing intestinal epithelial cells and intestinal colon cells genes. While the structures derived from the mesenchymal group, despite presenting intestinal cell expression, did not develop an adequate morphology. Concluding that the canine yolk sac is capable of developing intestinal organoids, whereas isolated mesenchymal stem cells, although capable of undergoing intestinal differentiation, do not form organoids-like structures in three-dimensional culture.
Resumo
As neoplasias estão se tornando cada vez mais comuns entre os animas domésticos, seja devido a maior expectativa de vida ou pelo avanço dos métodos diagnósticos e tratamentos. As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de neoplasias entre as fêmeas caninas. A procura por novos tratamentos e/ou tratamentos específicos para os animais é cada vez mais comum frente à esse quadro. A rapamicina é um fármaco antifúngico com atividade antitumoral, que atua inibindo o complexo mTOR, já testada para o tratamento de neoplasias em diferentes órgãos em humanos, podendo ser uma alternativa no tratamento de neoplasias em cães. Devido ao grande número de repetições que os ensaios com fármacos necessitam, o cultivo celular in vitro é uma alternativa inicial para a descoberta de novos medicamentos eficazes no tratamento dessa espécie, além de também se tornar um ensaio pré-clínico. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da rapamicina em células de tumores mamários primários e suas respectivas metástases de cadelas, cultivadas in vitro. Foram utilizados dois tipos histológicos tumores de mama, provenientes do tumor primário e suas respectivas metástases. Após a colheita, as amostras foram classificadas por histopatologia como carcinoma sólido grau III e carcinoma adenoescamoso, como tumores triplo negativos não basal pela imuno-histoquímica e tanto os tumores primários como suas metástases apresentaram expressão positiva para as proteínas PTEN, AKT, mTOR e 4EBP1 na imunofluorescência. Parte do tecido tumoral foi cultivado in vitro e as células foram avaliadas quanto a morfologia e fenótipo celular, expressão gênica (qPCR) e viabilidade celular (MTT). Os genes validados pela qPCR foram AKT, mTOR e PTEN, relacionados com a via AKT-mTOR. A expressão do gene PTEN estava diminuída e do mTOR aumentada nas células de tumores primários, quando comparadas as suas metastases. O tratamento com rapamicina e ensaio MTT foram realizados nas concentrações de 2, 5, 10 e 12 M, por 24, 48 e 72 h. O ensaio de MTT mostrou que para uma diminuição de 50% da viabilidade celular, a concentração de rapamicina deve ser 2 M para o carcinoma adenoescamoso e 10 M para metástase. Para o carcinoma sólido grau III e sua respectiva metástase, a concentração utilizada foi de 12 M. A rapamicina teve um resultado satisfatório na inibição do crescimento dos dois tipos celulares utilizados nesse estudo.
Neoplasms are becoming increasingly common among animals, whether due to longer life expectancy or new diagnostic methods and treatments. Breast neoplasms are the most common type of neoplasm among canine females. The search for new treatments and / or specific treatments for animals is increasingly common in this context. Rapamycin is an antifungal drug with antitumor activity, which acts to inhibit the mTOR comple. It was already tested for the treatment of neoplasms in different organs in humans and may be an alternative in the treatment of neoplasms in dogs. Due to the large number of replicates required by drug assays, in vitro cell culture is an early alternative for the discovery of new drugs that might be effective in treatment of this species, as well as becoming a preclinical assay. The aim of this study was to evaluate the effect of rapamycin on primary and metastatic mammary dog tumor on in vitro cultured cells. Two histological types of neoplastic cells from the primary tumor and their respective metastases were used. After collection, the samples were classified by histopathology as grade III solid carcinoma and adenosquamous carcinoma, as non-basal triple negative tumors by immunohistochemistry, and both the primary tumors and their metastases presented positive expression for PTEN, AKT, mTOR and 4EBP1 proteins in immunofluorescence. A fragment of the tumor tissue was cultured in vitro and the cells were evaluated for cell morphology and phenotype, gene expression (qPCR) and cell viability (MTT). The genes validated by qPCR were AKT, mTOR and PTEN, related to the AKT-mTOR pathway. PTEN gene expression was decreased and mTOR increased in primary tumor cells when compared to metastatic tumors. Treatment with rapamycin and MTT assay were performed at concentrations of 2, 5, 10 and 12 M for 24, 48 and 72 h. The MTT assay showed that for a 50% decrease in cell viability, the concentration of rapamycin should be 2 M for adenosquamous carcinoma and 10 M for its metastasis. For grade III solid carcinoma and its respective metastasis, the concentration used was 12 M. The treatment with rapamicyn inhibited the cell growth in the two cell types cultured in vitro.